Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы произошел значительный прорыв в молекулярной биологии и медицине. Определены нуклеотидные последовательности геномов многих организмов, картированы гены, определены последовательности белков. В эту постгеномную эру важный вопрос заключается в том, какие механизмы лежат в основе реализации этой первичной генетической информации, как организм регулирует транскрипцию многих генов, какие регуляторные факторы задействованы и как. Большое значение имеет изучение взаимосвязей между различными этапами экспрессии генов и механизмов контроля этих этапов в процессе развития организма.
Исследование инсуляторов и других регуляторных элементов генома важно не только для понимания работы транскрипционной сети клетки, но и имеет большое прикладное значение для медицины, фармакологии и биотехнологии. Инсуляторы играют важную роль при создании ДНК-векторов для продукции биологически активных белков человека, используемых для диагностики и лечения различных заболеваний. Уровень продукции лекарственных белков напрямую зависит от эффективности работы этих регуляторных областей.
Многочисленные исследования показали, что в регуляции экспрессии генов задействовано несколько дискретных, контролируемых процессов: изменение структуры хроматина, изменение локализации гена внутри ядра и привлечение на промотор гена мультибелковых комплексов, активация транскрипции, элонгация и процессинг мРНК, экспорт мРНК из ядра в цитоплазму. В данной работе впервые описан механизм действия белка Е(у)2, связывающий все эти этапы реализации генетической информации.
Цель работы и основные задачи исследования.
Целью данной работы стало изучение белка Е(у)2 и механизмов его участия в регуляции экспрессии генов эукариот. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Охарактеризовать ген е(у)2 и его белковый продукт с точки зрения эволюционного
подхода.
-
Идентифицировать Е(у)2-содержащие белковые комплексы и белки-партнеры, с которыми взаимодействует Е(у)2 в составе этих комплексов.
-
Идентифицировать биологические процессы, в которые вовлечен Е(у)2 и изучить механизм его участия в этих процессах.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые описаны механизмы действия белка Е(у)2 в регуляции экспрессии генов эукариот. Показано, что белок Е(у)2 связывает несколько этапов реализации генетической информации. Этот белок важен для формирования активной структуры хроматина как на инсуляторах, так и на промоторах активно транскрибирующихся генов, участвует в активации транскрипции и последующем транспорте мРНК из ядра в цитоплазму. Таким образом, Е(у)2 является ключевым компонентом многих процессов, лежащих в основе жизнедеятельности клетки.
Проведен анализ структуры и эволюции гена, кодирующего Е(у)2, у эукариот, показана высокая консервативность гена и белка Е(у)2 в эволюции. Найден ген е(у)2Ъ D.melanogaster, кодирующий белок Е(у)2Ь, являющийся паралогом белка Е(у)2. Показано, что в то время как Е(у)2 экспрессируется во всех тканях организма и на всех стадиях развития, Е(у)2Ь является белком, специфическим для мужских зародышевых клеток. Таким образом, выявлен новый тестис-специфический компонент общего транскрипционного аппарата, регулирующего экспрессию генов в половых клетках. Показано, что ген е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Ъ. Описан достаточно редкий случай, когда ретрокопия гена функционально заменила исходный ген в эволюции, а не потеряла активность, превратившись в псевдоген.
В данной работе показано, что Е(у)2 является новым, ранее не описанным компонентом SAGA гистонацетилтрансферазного комплекса дрозофилы. Изучена роль SAGA комплекса в активации транскрипции гена теплового шока hsp70. Показано, что именно SAGA, а не общие транскрипционные факторы, формирующие преинициаторный комплекс РНК-полимеразы II (TFIID, TFIIB и TFIIF), участвует в реинициации транскрипции на промоторе гена hsp70 при тепловом воздействии. Таким образом, SAGA комплекс необходим для активации транскрипции генов ответа на стресс.
Показано, что Е(у)2 также является компонентом нового ассоциированного с ядерной порой комплекса АМЕХ, который участвует в организации экспорта мРНК из ядра. Показано, что в составе АМЕХ Е(у)2 взаимодействует с белком Xmas-2. На модели кластера SAGA-зависимых генов теплового шока hsp70 было показано, что Е(у)2 является белком, координирующим транскрипцию hsp70 генов, их ассоциацию с ядерной порой (NPC) и экспорт мРНК hsp70.
Таким образом, впервые в многоклеточном организме был описан белок, осуществляющий физическую связь между транскрипцией генетического локуса, его внутриядерным положением и экспортом его транскриптов.
Показано, что Е(у)2 и Xmas-2 (комплекс АМЕХ) играют роль в тотальном экспорте мРНК из ядра в цитоплазму. В частности, АМЕХ участвует в транспорте мРНК генов домашнего хозяйства trf2 и actin из ядра в цитоплазму.
Изучена функция Е(у)2 в составе SAGA комплекса. Идентифицирован компонент SAGA комплекса Sgfll, с которым непосредственно взаимодействует Е(у)2. Показано, что SAGA комплекс многоклеточных обладает деубиквитиназной активностью гистонов Н2А и Н2В. Идентифицированы три субъединицы SAGA комплекса человека Е(у)2, Sgfl 1 и Nonstop, которые формируют деубиквитиназный модуль. Показано, что этот модуль способен блокировать репрессию, опосредованную гетерохроматином и действовать как позитивный кофактор для активации транскрипции ядерными рецепторами.
Также впервые было показано, что Е(у)2 является белковым компонентом Su(Hw)-зависимых инсуляторов. Е(у)2 связывается с доменом цинковых пальцев белка Su(Hw) и необходим для барьерной, но не для энхансер-блокирующей, активности Su(Hw)-зависимых инсуляторов. Показано, что SAGA комплекс рекрутируется на Su(Hw)-зависимые инсуляторы и что для этого необходим белок Е(у)2. Предложена модель SuHw-E(y)2-SAGA инсуляторного комплекса, согласно которой, роль Е(у)2 в осуществлении барьерной функции заключается в рекрутировании гистон модифицирующих ферментов GCN5 и Nonstop на инсуляторы, что в свою очередь препятствует распространению гетерохроматина и репрессирующему действию белков группы Polycomb. Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на международных российских и зарубежных конференциях: III Съезд Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002), "Molecular Genetics of Eucariotes" (Moscow, 2003), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2003), "Advances in Molecular Cell Biology" (Moscow, 2004), 6th EMBL International PhD Students Symposium "Animal Models" (Rome, Italy, 2005), EMBO Workshop "Mechanisms of nucleocytoplasmic transport" (Sicilia, Italy, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 8th Young Scientist Forum and 33d FEBS Congress (Athens, Greece, 2008), "Хромосома 2009" (Новосибирск 2009). Публикации. По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ, из которых 17 статей в российских и международных журналах и 12 тезисов докладов и материалов конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой
литературы. Диссертация изложена на страницах и содержит рисунков и
таблиц. Библиография включает источник.
