Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Сибирская язва: молекулярные механизмы инфекции и подходы к лечению. Обзор литературы 6
1.1 Болезнь Сибирская язва 6
1.1.1 Патогенез 6
1.1.2 Факторы вирулентности 7
1.1.2.1 ПА 8
1.1.2.2 ЛФ 8
1.1.2.3 ОФ 9
1.1.3 Токсины СЯ 10
1.1.4 Проникновение токсинов в клетку 10
1.1.4.1 Рецепторы 10
1.1.4.2 Сборка и транслокация токсинов 12
1.1.5 Действие токсинов внутри клетки 13
1.1.5.1. Расщепление МАРКК киназ с помощью ЛФ 13
1.1.5.2 Повышение уровня цАМФ с помощью ОФ 15
1.1.6 Клеточные мишени для токсинов СЯ 16
1.1.6.1 Токсины СЯи врожденный иммунитет 16
1.1.6.1.1 ЛТ и апоптоз макрофагов 16
1.1.6.1.2 ЛТ блокирует активацию макрофагов 18
1.1.6.1.3 ЛТ и нейтрофилы 18
1.1.6.1.4 Токсины СЯ и дендритные клетки 19
1.1.6.2 Токсины СЯи приобретенный иммунитет 19
1.1.6.2.1 Токсины СЯ и ДК 20
1.1.6.2.2 Токсины СЯ и Т-клетки 20
1.1.6.2.3 Токсины СЯиВ-клетки 20
1.1.6.3 Действие токсинов нанеимунные клетки 21
1.1.6.3.1 Токсины СЯ и эндотелиальные клетки 21
1.1.6.3.2 Токсины СЯ и эритроциты 21
1.1.7 Современные подходы к лечению болезни СЯ 22
1.1.7.1 Вакцины 22
1.1.7.2 Антибактериальные лекарства 24
1.1.7.3 Антитоксины 24
1.1.7.3.1 Антитела к токсинам СЯ 24
1.1.7.3.2 Свободные рецепторы 25
1.1.7.3.3 Блокирование созревания и сборки токсинов 25
1.1.7.3.4 Предотвращение транслокации токсинов 26
1.1.7.3.5 Использование аналогов субстратов в качестве антитоксинов 27
1.1.7.3.6 Низкомолекулярпые ингибиторы эффекторных субъединиц 27
1.2 Методические подходы к получению ингибиторов металопротеаз, имеющих медицинское значение 29
1.2.1 Структура активного центра ЛФ. Дизайн ингибиторов с помощью структурных исследований 30
1.2.2 Дизайн ингибиторов с помощью ЯМР 33
1.2.3 Дизайн ингибиторов с помощью масс-спектроскопии 33
1.2.4 Селекция ингибиторов с помощью био-неорганического подхода 34
1.2.5 Механизм действия металл опротеаз. Дизайн ингибиторов на основе информации о механизме работы фермента 36
1.2.6 Получение ингибиторов путем широкомасштабного скрининга на основе активности фермента 39
1.2.6.1 Подбор эффективного субстрата для измерения активности протеазы 40
1.2.6.1.1 Использование специфичных субстратов протеаз 40
1.2.6.1.2 Подбор субстрата комбинаторным способом 41
1.2.6.1.2.1 Контекст-зависимые субстратные библиотеки 41
1.2.6.1.2.1 Смешанные контекст-зависимые библиотеки субстратов 42
1.2.6.1.2.3 Анализ библиотек пептидных субстратов методом секвенирования. 43
1.2.6.1.2.4 Иммобилизованные субстратные библиотеки 44
1.2.6.1.2.5 Сканирующие синтетические комбинаторные библиотеки 45
1.2.6.1.2.6 Субстратный фаговый дисплей 45
1.2.6.1.2.7 Другие стратегии биологического субстратного дисплея 48
1.2.6.2 Создание системы детекции активности протеазы для широкомасштабного
скрининга ингибиторов 49
1.2.6.2.1 Подбор оптимальных репортеров для детекции работы фермента in
vitro 50
1.2.6.2.2 Разработка системы детекции протеаз in vivo 53
Заключение 55
Глава 2: Результаты и обсуждения 56
2.1 Исследование субстратной специфичности ЛФ методом фагового дисплея 56
2.1.1 Конструирование и скрининг фаг-дисплейной библиотеки 56
2.1.2 Анализ структуры субстратов после первого этапа скрининга 58
2.1.3 Создание системы детекции активности ЛФ с использованием флуоресцентных белков 60
2.1.4 Оценка эффективности субстратов ЛФ после первого этапа скрининга 63
2.1.5 Создание и скрининг удлиненной библиотеки субстратов 63
2.1.6 Исследование расщепления субстратов ЛФ после скрининга расширенной библиотеки 64
2.1.7 Определение положения сайтов расщепления полученных субстратов 66
2.1.8 Определение влияния точечных мутаций в последовательности субстрата на эффективность взаимодйствия с ЛФ 67
2.2 Исследование механизма фермент-субстратных взаимодействий ЛФ с помощью предстационарной кинетики 69
2.2.1 Взаимодействие ЛФ с субстратами группы ЛФ15 69
2.2.2 Изучение ингибирования ЛФ 73
2.2.3 Протеолитическое расщепление субстрата мутантными формами ЛФ с измененным активным центром 75
2.2.4 Взаимодействие ЛФ с субстратом С20, отобранным из фаговой библиотеки 78
2.2.5 Активация апофермента ЛФ с помощью двухвалентных металлов 80
Заключение 85
Глава 3. Практическая часть 88
Материалы 88
Методы 90
Выводы 99
Список литературы
- Факторы вирулентности
- ЛТ блокирует активацию макрофагов
- Конструирование и скрининг фаг-дисплейной библиотеки
- Протеолитическое расщепление субстрата мутантными формами ЛФ с измененным активным центром
Введение к работе
Сибирская язва (СЯ) является опасной бактериальной инфекцией. При попадании в организм человека патоген вызывает системную интоксикацию организма, которая, в случае лёгочной или кишечной форм инфекции, летальна в высоком проценте случаев. Основным фактором вирулентности патогена является бинарный экзотоксин, состоящий из одной медиаторной (протективный антиген, ПА) и двух эффекторных субъединиц (отечный фактор, ОФ) и летальный фактор, ЛФ). ПА связывается с рецепторами на клеточной мембране и обеспечивает транслокацию ЛФ и ОФ во внутриклеточные компартменты. ОФ является Са2+-зависимой аденилатциклазой, ЛФ представляет собой высокоспецифичную цинк-зависимую металлопротеазу. Известно, что ЛФ расщепляет ряд киназ семейства МКК в районе последовательностей их докинг-сайтов, отвечающих за взаимодействие киназ друг с другом и низлежащими участниками каскадов. Действие ЛФ запускает малоизученную цепь событий, приводящих к смерти клетки-хозяина, которую, на сегодняшний день, невозможно объяснить исключительно выключением каскада сигнальной трансдукции с участием МКК. Хотя полная цепь событий, индуцированная ЛФ, остается не совсем определенной, имеются веские доводы в пользу того, что ингибирование протеолитической активности ЛФ вносит существенный вклад в излечение инфекции СЯ. Информация, касающаяся механизма узнавания и превращения субстрата данным ферментом, важна для оптимизации имеющихся и дизайна новых ингибиторов ЛФ, применимых на практике. Исследование субстратной специфичности ЛФ может привести к идентификации новых природных мишеней данного фермента, что является ключевым этапом для разработки новых подходов к терапии сибирской язвы. Другой важной причиной для изучения специфичности ЛФ является необходимость получения эффективно гидролизуемого пептидного субстрата для создания системы детекции активности фермента, селекции ингибиторов и диагностики СЯ.
Факторы вирулентности
ЛФ является высокоспецифичной Еп2+-зависимой металлопротеазой (код фермента 3.4.24.83 по IUBMB Enzyme Nomenclature), которая расщепляет последовательности киназ семейства МАРКК (от английского mitogen activated protein kinase kinases) вблизи их N -конца. Анализ трехмерной структуры этой протеазы указывает на то, что, по-видимому, эволюционно ген ЛФ появился в результате процессов дупликаций, мутаций и слияния различных генов; это привело к появлению протеазы с крайне высокой специфичностью. ЛФ - крупный белок весом 91 кДт - включает в себя 4 домена, состоящих, во-основном, из а-спиралей (рис.1 Б). Домен 1 связывает ПА, он необходим для проникновения ЛФ внутрь клетки [18, 19]. Домен 2 напоминает по структуре АДФ-рибозилирующий домен VIP2 токсина из Bacillus cereus, активный сайт которого изменен ; в случае В. Anthracis этот домен вовлечен в узнавание субстрата. Домен 3, так называемый «спиральный пучок», встроен в домен 2 и, по всей видимости, состоит из повторов структурных элементов домена 2. Домен 4 является каталитическим центром и имеет некоторое сходство с доменами других Zn2+ содержащих металлопротеаз [20] (рис. 1Б). Каталитический домен содержит последовательность НЕХХН в своем активном сайте, которая является характерной чертой металлопротеиназ и участвует в связывании иона Zn2+. Однако, общая структура каталитического домена уникальна и не имеет гомологов. Домен I. свжьшаниес ПА ЛФ является нетипичной металлопротеазой еще и потому, что не требует активации, сопровождающейся отрезанием про-пептида, что обычно для других ферментов этой группы. ОФ является Са /кальмодулин зависимой аденилат-циклазой (АЦ). Интересно, что активность ОФ превышает таковую для АЦ млекопитающих примерно в 1000 раз [21]. Увеличение уровня клеточного цАМФ нарушает водный баланс и препятствует нормальному функционированию сигнальных каскадов в клетке. ОФ состоит из N-концевого ПА-связывающего домена, центрального каталитического домена и С-концевого спирального домена [22, 23] (рис. 1В). N-концевой домен гомологичен по структуре и функциям 1 домену ЛФ [16]. Каталитический домен структурно сходен с доменами других бактериальных АЦ токсинов, например токсинов Bordetella pertussis СуаА и Pseudomonas aerunginosa ExoY. Спиральный домен располагается напротив каталитического домена в инактивированном состоянии. Кальмодулин (СаМ) встраивается между этими двумя доменами, раздвигая их, что приводит к повороту одного домена относительно другого примерно на 30 градусов (рис. 1В). Такое взаимодействие между СаМ и ферментом вызывает конформационные изменения в линкере, соединяющем каталитический и спиральный домены, что приводит к активации ОФ [24].
Бинарные комбинации этих секретируемых белков составляют два токсина сибирской язвы: ПА в комбинации с ЛФ называется летальным токсином (ЛТ), а ПА в комбинации с ОФ известен как отечный токсин (ОТ).
Особенностью сибиреязвенных токсинов является независимая секреция бактериальной клеткой их компонентов, каждый из которых сам по себе нетоксичен. ЛТ и ОТ препятствуют развитию клеточного ответа на бактериальную инфекцию, разрушают систему иммунитета клетки и способствуют распространению бактерии. По мере развития болезни, токсины накапливаются в кровотоке и на поздних этапах, по-видимому, являются главной причиной патологии.
Ранее были высказано предположение о раздельной роли токсинов: предполагалось, что ЛТ ответственен за смертность при системной сибирской язве, тогда как ОТ вызывает локальный отек при кожной форме болезни [5, 13]. Показано, что внутривенное введение ЛТ вызывает гибель исследуемых животных (грызунов и млекопитающих), однако эффективность действия токсина существенно различается среди различных видов животных. ОТ не является смертельным при подкожном введении, но способен вызывать обширный отек. Гибель мышей от внутривенного введения ЛТ ассоциирована с шоком, разрушением сосудов и общей гипоксией, что согласуется с симптомами легочной формы сибирской язвы [12, 25, 26]. Действие ОТ приводит к повреждению тканей, дисфункции различных органов, кровоизлияниям и пониженному давлению — симптомам, которые наблюдаются у тех же пациентов. Это наблюдение поддерживает гипотезу о том, что оба токсина работают кооперативно и оба приводят к смерти при сибирской язве.
Модель взаимодействия токсинов сибирской язвы с клеткой хозяина [37]. рецепторами на поверхности клетки - белками (ТЕМ)8 (от английского tumor endothelium marker) или (CMG)2 (от английского capillary morphogenesis protein), которые встречаются в разных изоформах во многих типах клеток, включая иммунные [13, 27-29]. Ген (CMG)2 экспрессируется в большинстве человеческих тканей, тогда как экспрессия (ТЕМ)8 ограничена опухолевыми эндотелиальными и раковыми клетками [28, 30-33]. Оба рецептора относятся к трансмембранным белкам типа 1, имеющим единственный мембранный домен. Отличительной особенностью этих белков является протяженный внеклеточный домен I (примерно 200 ак), связывающийся непосредственно с ПА и имеющий близкую гомологию с 1 доменом интегрина а. Рецепторы имеют структурные отличия в основном в своих цитоплазматических доменах, которые, как было показано, не влияют на связывание и траслокацию токсинов СЯ [34]. К настоящему времени все изоформы рецепторов охарактеризованы, и выяснено, что их существование является результатом альтернативного сплайсинга мРНК [27, 28]. На сегодняшний день функции белков (ТЕМ)8 и (CMG)2 достоверно неизвестны, но имеются существенные
ЛТ блокирует активацию макрофагов
Ранее и до настоящего момента значительные усилия ученых сконцентрированы на разработке оптимальной терапии, способной обеспечить всестороннюю защиту организма от инфекции СЯ. Профилактическое лечение осуществляется с помощью вакцинирования. Лечение болезни антибиотиками эффективно только на очень ранних стадиях, часто даже еще до появления симптомов. Появление штаммов, устойчивых к антибиотикам, побудило исследователей к разработке новых дополнительных терапевтических агентов, таких, как препараты антитоксиновой терапии. Несмотря на высокую эффективность известных на сегодняшний день антитоксиновых медикаментов, они имеют ряд недостатков, таких, например, как необходимость поддержания постоянной высокой концентрации препарата в крови пациента для достижения оптимального уровня защиты.
Вакцинация является наиболее дешевым способом профилактической терапии, поэтому большое количество сил и времени ученых было затрачено на разработку безопасных и эффективных вакцин [107].
К вакцинам первого поколения относятся препараты, содержащие живые бактерии или споры не болезнетворных штаммов В. anthracis. Споры для вакцинации ограниченно применялись только на территории бывшего СССР и Китая [108, 109]. Применяемая в России и странах СНГ живая сибиреязвенная вакцина СТИ обладает повышенной реактогенностью и сохраняет опасность реверсии [110]. Вакцина, применяемая в Великобритании, помимо мажорного компонента - ПА - содержит небольшие количества ЛФ и других бактериальных иммуногенов, способных вносить вклад в иммунный ответ пациента [111, 112]. Главной проблемой при применении вакцин первого поколения является проблема стандартизации иммунного ответа, связанная с тем, что количество антигенов, например ПА, в препарате может сильно варьировать [113]. Показано, что вакцины к СЯ первого поколения могут часто вызывать раздражение, покраснение, зуд и отек в месте инъекции. Кроме того, такие вакцины недостаточно эффективны и имеют ряд побочных эффектов.
Белковые вакцины второго поколения отличаются от своих предшественников тем, что их состав полностью определен, они состоят из рекомбинантных антигенов, практически не имеют побочных эффектов и производятся на средах, не имеющих в своем составе продуктов животного происхождения. Наиболее перспективные из них — гРА (рекомбинантный ПА) в США [114] и Avecia в Великобритании [115] - уже проходят клинические испытания на животных.
Вакцины третьего поколения могут быть применимы в виде оральных, назальных и наружных препаратов, чем отличаются от более ранних вариантов вакцин, вызывают быстрый иммунный ответ и представляют собой либо живые невирулентные бактерии, несущие кодирующий антигены вектор [116], либо экспрессированные в растениях антигены [117, 118]. На сегодняшний день ни одна из вакцин третьего поколения еще не имеет лицензии.
В последнее время представляется перспективным подход на основе ДНК вакцин. Основным преимуществом этой системы является то, что антиген экспрессируется in vivo в клетках хозяина, и, в связи с этим, отпадает необходимость разработки системы экспрессии и очистки белка. Ряд испытаний таких вакцин на мышах и кроликах показал возможность использования ПА-кодирующих ДНК конструкций для защиты от инфекции СЯ[119].
Несмотря на то, что вакцинация является эффективной мерой в борьбе с инфекцией СЯ, необходимо разрабатывать также терапевтические подходы для лечения уже зараженных пациентов, для этого применяются антибактериальные лекарства на ранних стадиях болезни в комбинации с препаратами антитоксиновой терапии на поздних стадиях.
Первым антибиотиком, примененным против СЯ, был пенициллин. Большинство штаммов В. anthracis чувствительно к пенициллину, эритромицину, хлорамфениколу, гентамицину, ципрофлоксацину и тетрациклину [ПО]. Очень важно, чтобы терапия антибиотиками применялась в самые скорейшие сроки после заражения, выбор антибиотика в данном случае является менее важным моментом. Кожная форма СЯ наиболее легко излечивается с помощью антибиотиков. Однако, развитие язв может продолжаться и при применении антибактериальных препаратов, что является результатом присутствия токсина в очаге поражения. Лечение легочной формы болезни антибиотиками, напротив, обычно неэффективно, так как болезнь редко можно распознать до появления симптомов бактеримии и токсикоза. Антибактериальное лечение СЯ необходимо проводить в течение продолжительного периода. Это связано со способностью спор СЯ сохранять жизнеспособность в легких до 60 дней и вызывать последующую инфекцию при прекращении лечения антибиотиками [120]. Для решения этой проблемы необходимо проводить вакцинацию больных вначале терапии антибиотиками, чтобы при окончании терапии активировался иммунный ответ организма [121].
Важно отметить, что в разработке биологического оружия на основе СЯ могут применяться штаммы СЯ, устойчивые к антибиотикам. На сегодняшний день известны штаммы СЯ, устойчивые к множеству антибиотиков, включая самые современные средства, такие как ципрофлоксацин, доксициклин и б-лактамные антибиотики [122-124].
Конструирование и скрининг фаг-дисплейной библиотеки
Обычно после первой стадии отбора ингибиторов исследуемых протеаз методом широкомасштабного скрининга in vitro, следующими этапами оценки полученных соединений в качестве потенциальных терапевтических агентов является их тестирование in vivo на культурах клеток и далее на животных и человеке. На стадии селекции ингибиторов in vivo к системе детекции активности фермента предъявляется жесткое требование специфичности, помимо чувствительности субстрата. Наилучшим способом оценки специфичности конкретного субстрата по отношению к изучаемой протеазе in vivo является оценка степени расщепления субстрата в присутствии специфического ингибитора. Если не описано ингибитора, специфичного для изучаемой протеазы, то возможно использование ингибитора к классу протеаз, включая изучаемую, например AEBSF для сериновых протеаз, Е-64 для цистеиновых протеаз, бестатина и хелаторов металлов типа EDTA для металлоэндопептидаз [170].
Протеазы, работающие во внеклеточном пространстве, изучают на культурах клеток с использованием любого более-менее подходящего субстрата из-за низкого содержания протеолитических ферментов вне эукариотической клетки. В работе [213] для определения активности катепсина В, ассоциированного со множеством линий раковых клеток, использовали коммерчески доступный флуоресцентный дипептид Z-Arg-Arg-АМС.
При исследовании активности внутриклеточных протеаз еще одной проблемой, помимо сложности подбора специфичного субстрата, является плохая проницаемость клеточной мембраны для пептидов с флуорофорами. Для некоторых субстратов, таких как производные 4-нафти-метокси-2-нафтиламида (MNA), АМС и AFC, показана возможность успешного проникновения в клетку. Другой сложностью является быстрая диффузия флуоресцентных продуктов протеолиза и ослабление внутриклеточного флуоресцентного сигнала. В работе [214] авторы решили данную проблему с помощью химической фиксации флуорофора внутри клетки, получив не диффундирующее через клеточную мембрану соединение. Для преодоления описанных трудностей в работе [215] были разработаны ди-пептидил-родамин-110 диамид флуорогенные субстраты для анализа сериновых и цистеиновых протеаз in vivo. Их преимущество заключалось в том, что ди и моно-ацилированные производные родамина (субстраты) имеют низкий уровень флуоресцентного сигнала, тогда как сводный родамин (продукт) способен излучать значительное количество флуоресцентной энергии. Диамидные производные родамина способны легко дифундировать сквозь клеточную мембрану, однако, свободный родамин обладает низкой способностью к выведению из клетки. Пептидные субстраты с родаминовыми метками были использованы для ряда клеточных протеиназ, такую активность возможно было количественно оценить с помощью FACS [170]. Хотя для таких пептидов, меченных родамином, нет ограничения по длине аминокислотной последовательности, лишь аминокислоты в положениях Рп субстрата (до сайта разрезания) могут входить в состав такого пептида. В идеальном случае, субстрат должен представлять собой пептид, содержащий определенные аминокислотные основания по обеим сторонам от сайта разрезания. На основе ксантеновых меток были разработаны полноценные субстраты оптимальной длины [216], формирующие димеры с выраженным эффектом тушения флуоресценции репортеров. После разрезания субстрата происходило разрушение таких димеров и усиление флуоресцентного сигнала. Подобные субстраты использовались для оценки активности каспаз в тимоцитах, индуцированных для ухода в апоптоз. Так как данные субстраты несут пролонгированную пептидную последовательность, они могут быть использованы для исследования активности любых протеаз с известной структурой оптимального субстрата.
Широко применяется использование FRET-субстратов на базе белков семейства GFP для детектирования активности протеаз in vivo. В данном случае нет необходимости доставки субстрата внутрь клетки, т.к. используемая клеточная линия уже несет генетическую конструкцию, кодирующую такой белковый субстрат. Большинство подобных белков является совершенно нетоксичными для эукариотической клетки. Наилучшей описанной FRET-парой флуоресцентных белков на сегодняшний день является пара CyPet/Ypet [217]. С помощью белковых FRET субстратов была исследована активность ряда каспаз in vivo [211,218].
Заключение
Сибирская язва представляет собой тяжелую инфекционную болезнь, вызываемую патогенной бактерией В. anthracis. Помимо бактериемии, тяжелое течение болезни обуславливается действием бактериальных токсинов ЛТ и ОТ. На сегодняшний момент наименее поддаются лечению поздние стадии болезни, когда происходит накопление токсинов и интернализация эффекторных субъединиц токсинов. Описано множество терапевтических подходов для лечения СЯ, таких как применение антибиотиков и антитоксиновых реагентов. Созданы блокаторы связывания компонентов токсинов с клеточной поверхностью, интернализации токсинов, энзиматической активности ЛФ и ОФ. Описан ряд ингибиторов протеолитической активности ЛФ, обладающих кинетическими характеристиками, близкими к наномолярным. Однако, многие из них имеют ограниченное применение из-за недостаточной специфичности, токсичности и трудности внутриклеточной доставки. Поэтому, на сегодняшний день, основные подходы к разработке терапевтических агентов против СЯ сфокусированы на поиске новых и оптимизации известных ингибиторов для ЛФ.
Существует множество стратегий селекции эффективных ингибиторов протеаз, включая структурные подходы, такие как рентгеноструктурный анализ в сочетании с компьютерным моделированием, а также различные динамические подходы. Не потерял актуальности и метод прямого измерения блокирования активности фермента в присутствии ингибитора, основанный на детектировании расщепления субстрата. При проведении широкомасштабного скрининга ингибиторов in vitro и in vivo необходимо иметь чувствительную и дешевую систему детекции активности фермента. Ряд эффективных тест-систем, основанных на использовании пептидных хромо- и флуоресцентных субстратов, был создан для измерения активности ЛФ. Синтетический субстрат ЛФ15 в сочетании с концевыми метками типа флуорофор/гаситель [63] обладает приемлемыми характеристиками для детектирования активности ЛФ при широкомасштабном скрининге ингибиторов in vitro. Однако недостатком данного субстрата является протяженный блок из положительно заряженных аминокислотных остатков, что делает возможным его неспецифическое расщепление.
Протеолитическое расщепление субстрата мутантными формами ЛФ с измененным активным центром
Для приготовления вектора для экспрессии фаговой библиотеки, плазмида fdet DOG1 была модифицирована с внесением стоп кодона вместо сайта рестрикции Not I. Это было реализовано с помощью замены фрагмента ДНК fdet DOG1 между сайтами Pst I and Bam HI на другой, полученный в реакции ПЦР с fdet DOG1 с использованием прямого праймера XhoFdFor 5 — AACATATATCTGCAGTAACTCGAGGAAACTGTTGAAAGTTGTTT- 3 и обратного праймера BamFdRev 5 - AACGAATGG АТС СТС ATT AAA GCC AGA ATG GAA-3 . Получившийся продукт был обработан Pst I и Bam HI и клонирован в fdet DOG1, обработанный теми же ферментами рестрикции. Получившийся вектор fd-Base был использован на всех дальнейших стадиях создания библиотеки.
Для приготовления конструкции позитивного контрольного фага fd-Base был обработан ферментами АраЫ и Xho I и лигирован с обработанным теми же рестриктазами ПЦР продуктом, приготовленным с помощью взаимного отжига и последующей достройки фрагментом Кленова прямого праймера FdMycFor 5 -ТС TAT ATA ACT ТАС AGT GCA CAG ACT GAG CAG AAG CTT АТС ТСС GAA GAG GAC CTG GGC GGT TCT-3 и обратного праймера +SuPhage Rev 5 C TCT TAT CTC GAG TTC CAT TGG GTA CGG ATA С AC TTT CTT GCG ACG GCC AGA ACC GCC CAG GTC CTC-3 . Таким образом, N-конец белка III для положительного контроля был представлен последовательностью MAOTOiajSDGGSGRRKKVYPYPMELE. где с-тус эпитоп выделен курсивом, серин-глициновый линкер выделен жирным шрифтом, а последовательность эффективного субстрата ЛФ15 [63] подчеркнута. Негативный контрольный фаг был получен аналогично с использованием обратного праймера -Suphage Rev 5 ТС TCT TAT CTC GAG ACG GCC AGA ACC GCC CAG GTC CTC-3 вместе с прямым праймером FdMycFor, таким образом, что N-конец белка рШ имел структуру MAQTEQKLISEEDLGGSGRLE с единственным аргинином вместо субстратной последовательности.
Олигонуклеотиды XhoFdFor (упомянут выше) и RandFdXho 5 -АТС TCT TAT CTC GAG AGA VNN VNN VNN VNN VNN VNN VNN VNN GCC AGA ACC GCC CAG GTC CTC-3 были подвергнуты взаимному отжигу, расщеплены с помощью ApaL I and Xho I и очищены элюцией из агарозного геля параллельно с вектором для создания библиотеки. 5-ти кратный молярный избыток ПЦР-продукта был лигирован с 40 (J.g расщепленного вектора с помощью набора для быстрого лигирования (Roche Molecular), полученной конструкцией были трансформированы клетки Е. coli DH12S путем проведения 100 раундов электропорации. Результирующая представительность библиотеки составила 109 индивидуальных клонов. Так как число вариантов уникальных последовательностей задано химически с помощью использования вырожденного праймера и составляет максимум 20 , что превышает полученное количество индивидуальных трансформантов приблизительно в 25 раз, то можно с большой долей вероятности утверждать, что все индивидуальные клоны, полученные при первой трансформации библиотеки, несут уникальные последовательности субстратов.
Для приготовления 12-членной библиотеки удлиненных субстратов вектор fd-Base был расщеплен также ApaLI и Xhol, и лигирован с обработанным соответствующими эндонуклеазами рестрикции дуплексом, полученным последовательным взаимным отжигом пары праймеров 2Мус Asc for 5 -Т TAT TCT AAG CTT АТС ТСС GAA GAG GAC TTG AGC GGT TCT GGC GAG CAA AAA CTG ATT TCT GAG GA-3 и 2MYC ASC REV 5 TA TAT АТС TCG AGG GAA GAC GGA GGC GCG CCA GAA CCT AAA TCT TCC TCA GAA АТС AGT TTT TGC T-3 и достройкой фрагментом Кленова. Полученный вектор fd-Base II кодировал двойной с-/яус-эпитоп для усиления аффиности при иммобилизации фагов и содержал сайты рестрикции для клонирования Asc I и Xho I. Последовательность вариабельного участка библиотеки субстратов была получена взаимным отжигом и достройкой пары праймеров Lib Asc For 5 -CTT ATA TAT TCT ATT ATA GGC GCG CCT TCT GGT TCT GAC CTG GGC GGT TCT GGC-3 _и 2nd Lib Rev 5 -CT ATA TAT CTC GAG NNN NNN NNN NNN NNN DDW AAY GCG ACG GRW DWH ACG AGC GCC AGA ACC GCC CAG GTC-3 ; дуплекс был расщеплен Asc I и Xho I и клонирован в вектор fd-Base II. Представительность 12-членой библиотеки субстратов была определена как описано выше и составляла 108 индивидуальных клонов.
На первом раунде селекции библиотека была высеяна на большую чашку в 100 мл топ-агара (0.6% агар на среде 2xYT) поверх слоя стандартного агара (1,5% агар на среде 2xYT) с 10 ng/ml тетрациклина. После 16 часов роста клеток, топ-агар был снят с чашки и гомогенизирован с 1:1 2xYT:100% глицерином. Гомогенизированная суспензия была разделена на аликвоты по 10 мл и хранилась при -80С. Клетки выращивались не только на поверхности чашки, но и в толще агара для увеличения количества индивидуальных клонов на чашке, необходимого для того, чтобы не потерять разнообразия субстратных фаговых клонов. Такое культивирование библиотек необходимо было лишь на первых раундах селекции, когда представительность превышала несколько тысяч клонов, свободно умещающихся на стандартной чашке Петри.
Аликвота суспензии библиотеки помещалась в 500 мл 2xYT с 10 ug/ml тетрациклина и после 2-ух часового разгона культуры при 37С и индукции экспрессии, культура инкубировалась при 25 С в течение 12 часов. После удаления клеток Е. coli и обломков клеточных стенок путем центрифугирования при 10000 х g и 4С, фаги были высажены добавлением охлажденного раствора PEG 8000 до 4% и NaCl до 0.5 М в течение 1 часа. Фаги были собраны центрифугированием при 12,000 X g в течение 30 мин и ресуспендированы в буфере Б. фаговых частиц были смешаны с антителом к c-myc 9Е10, инкубированы при 4С в течение 3 часов и далее подвергались иммунопреципетации с помощью Pansorbin согласно инструкции производителя.
После многократных отмывок (около 40 раз буфером Б с 0.05 % Tween 20), иммобилизованные фаги были обработаны 100 нМ ЛФ в течение 1-4 часов при 37 С в 100 ці буфера Б. Элюат был собран, фаги были оттитрованы и использованы для заражения свежей культуры Е. Coli с оптической плотности СЮбоо=0.6. Инфицированные бактерии высевались на топ-агар с тетрациклином и выращивались при 37С в течение 16 часов. Параллельно, серийные разведения элюированных фагов и фагов в последней отмывке перед обработкой ЛФ анализировались для определения обогащения библиотеки на определенном раунде скрининга. Позитивные и негативные контрольные фаги также были подвергнуты всем описанным процедурам; для них также определялся титр на каждом раунде селекции. Наличие нужных субстратных последовательностей правильной длины в составе фаговых клонов было подтверждено ПЦР-анализом 20 случайных клонов после каждого раунда селекции.
