Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
I. Классификации корегуляторов транскрипции 8
II. Корегуляторы, обладающие способностью модифицировать гистоны
1. Семейство корегуляторных комплексов SAGA 14
2. MYST семейство 17
III. АТФ-зависимые хроматин-ремоделирующие комплексы 26
1. SWI2/SNF2 семейство 26
2. Семейство ремоделирующих комплексов ISWI 29
3. Семейство комплексов CHD 32
IV. Медиаторный комплекс 35
V. Ядерные рецепторы 37
VI. Динамика обмена коактиваторных комплексов на промоторе 40
Объект и задачи исследования 46
Материалы и методы 48
I. Материалы 48
II. Методы 52
Результаты 60
I. Определение домена белка SAYP, отвечающего за его способность активировать
транскрипцию в системе S2 клеток D. Melanogaster 60
II. Определение коактиваторов, обеспечивающих способность SAY домена активировать транскрипцию репортерного гена 64
III. Колокализация компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции на репортерном гене, активируемом SAY доменом в ядре клетки 67
IV. Экспрессированныи в S2 клетках SAY домен способен образовывать белковый
комплекс, характерный для полноразмерного SAYP 70
V. Определение белка-партнера в составе коактиватора Brahma, взаимодействующего с SAY доменом 72
VI. Определение белка-партнера в составе общего фактора транскрипции TFIID,
взаимодействующего с SAY 75
Обсуждение 78
Выводы 85
Список литературы
- Корегуляторы, обладающие способностью модифицировать гистоны
- Семейство корегуляторных комплексов SAGA
- Семейство комплексов CHD
- Определение коактиваторов, обеспечивающих способность SAY домена активировать транскрипцию репортерного гена
Введение к работе
Физиологическое состояние клетки определяется внешними сигналами и в большинстве случаев конечной точкой действия этих сигналов является изменение уровня транскрипции гена. Изучение сложных механизмов, позволяющих клетке распознавать и реагировать на внешние факторы, является одной из основных задач современной молекулярной биологии.
Первым этапом экспрессии большинства генов высших эукариот является транскрипция, осуществляемая РНК-полимеразой II. Этот процесс контролируется многоуровневым аппаратом, состоящим из нескольких тысяч транскрипционных факторов. Для инициации транскрипции какого-либо гена требуется воздействие различных коактиваторных комплексов, которые привлекаются ген-специфическими активаторами (Rosenfeld, Lunyak et al. 2006).
В настоящее время факторы транскрипции принято делить на три большие группы: активаторы и репрессоры (специфичные регуляторы), корегуляторы и общие факторы транскрипции (GTFs-General Transcriptional Factors). Назначение первых - контроль работы определенного гена или группы генов на определенной стадии развития или при наличии определенных сигналов. Основной задачей корегуляторных комплесов (коактиваторов и корепрессоров) является осуществление взаимной связи между активаторами и общими факторами транскрипции, а также изменение состояние хроматина в районе гена.
За последнее десятилетие было описано множество мультибелковых комплексов, которые биохимически и функционально были отнесены к коактиваторам транскрипции. Однако все их можно разделить на два больших класса: адапторы и хроматин-модифицирующие и ремоделирующие комплексы (Lemon and Tjian 2000). В свою очередь коактиваторы, изменяющие состояние хроматина делятся на ковалентно модифицирующие гистоны и хроматин ремоделирующие.
Подобная классификация является достаточно условной. Так, TAFs (ТВР-ассоциированные факторы) рассматриваются и как GTFs, и как корегуляторы. Фактор SPBP является специфическим регулятором гена стромелизина-1 и одновременно -корегулятором, усиливающим действие ряда других специфических активаторов (Rekdal, Sjottem et al. 2000). В то же время известны специфические факторы транскрипции, осуществляющие взаимодействие с GTFs без участия корегуляторов. Так, активатор VP16C непосредственно взаимодействует с ТВР, TAF9, TFIIA и TFIIB (Nedialkov and Triezenberg 2004)
В настоящее время известно около 100 белков, составляющих основу транскрипционного аппарата (Pol II, GTFs, основные коактиваторы). В то же время количество известных специфических активаторов и репрессоров составляет несколько тысяч (Kadonaga 2004). Однако механизмы, по которым функционируют корегуляторы транскрипции, все еще остаются недостаточно изученными и представляют несомненный интерес.
В данной работе были изучены свойства основного консервативного домена коактиватора транскрипции SAYP: показано, что именно он отвечает за способность этого белка активировать транскрипцию, а также обнаружены взаимодействующие с ним белковые комплексы, которые и осуществляют механизм активации, регулируемый SAYP. Таким образом, показан новый механизм функционирования коактиватора транскрипции посредством объединения двух больших транскрипционных комплексов в единый.
\
Корегуляторы, обладающие способностью модифицировать гистоны
Кроме участия в упаковке ДНК в ядре, нуклеосомные а также более высокого порядка хроматиновые структуры участвуют в регуляции процесса транскрипции в клетке, так как представляют собой барьер для транскрипционной «машины». Эксперименты с удалением гистонов в дрожжах подтверждают общую репрессирующую функцию для гистонов, а также показывают, что действие многих активаторов направлено на преодоление репрессирующих свойств гистонов, в том числе и путем удаления гистонов из активно транскрибируемого участка ДНК. (Han and Grunstein 1988)
За последнее десятилетие было проведено множество исследований, которые показали, что большое количество разнообразных модификаций (ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и убиквитинилирование) N-концевых «хвостов» гистонов не только коррелирует, но, по-видимому, и является причиной специфической активации и репрессии генов. (Berger 2002). Причем было показано, что N-концевые хвосты гистонов НЗ и Н4 зачастую принимают участие в механизме активации транскрипции, в отличие от N концов гистонов Н2А и Н2В. (An, Palhan et al. 2002)
Существует две модели, которые объясняют, как модификации с изменением зарядов хвостовых остатков могут влиять на взаимодействия гистонов с ДНК или белком, тем самым, изменяя структуру хроматина. Например, ацетилирование нейтрализует положительный заряд на лизине, тем самым уменьшая силу взаимодействия нуклеосомы с отрицательно заряженными фосфатными остатками ДНК, делая ДНК более доступной для таких активных процессов как транскрипция. (Wade, Pruss et al. 1997) Альтернативная, более сложная модель, учитывающая недавно открытые функции и партнеров для связывания многочисленных модификаций гистонов известна как «гистоновый код». В этой модели гистоновые модификации, действующие как специфические сайты (поодиночке и координировано, или последовательно на одном или многих пістонах), И способны формировать «гистоновый код», распознаваемый транскрипционными факторами и корегуляторами и определяющий специфическое функционирование хроматина. (Turner 2000)
К настоящему времени описано множество кофакторов, которые вызывают вышеперечисленные модификации гистонов и которые связывают с различными механизмами активации и репрессии транскрипции. К сожалению, большинство исследований показывает только корреляцию между модификацией гистонов и регуляцией генов, но не доказывает, что они являются ее причиной.
Кроме того, у многоклеточных, имеются случаи, когда сами факторы регуляции транскрипции также являются субстратами для действия кофакторов, модифицирующих гистоны, примером такого действия является р53 (Gu and Roeder 1997).
Несмотря на то, что в достаточно короткое время накопилось множество информации о разнообразных модификациях гистонов, до сих пор еще не совсем ясно какие отношения возникают между механизмом регуляции транскрипции и различными модификациями. Однако уже ясно, что эти отношения цикличны и взаимозависимы. Например, корегуляторы, модифицирующие гистоны не способны достигнуть своих субстратов, пока они не «помечены» соответствующей модификацией.
Правильно организованный порядок привлечения коактиваторов диктуется комбинацией промотор-специфичных транскрипционных факторов. В этом контексте белковые домены этих факторов, такие как бромодомены, хромодомены, RING домены, PHD домены, F-боксы и SANT домены, а также узнающие последовательности для SUMO лигаз, протеинкиназ, и протеинфосфатаз способны распознавать специфические модификации и играть важную роль в процессе позиционирования корегуляторов на хроматине. Каждый из этих белковых доменов способен обладать двумя функциями: служить для узнавания специфической модификации гистонов, а также для осуществления этой модификации. Кроме того, известно, что хроматин-связывающие домены могут играть центральную роль в установлении периодичности транскрипционных состояний или достижении длительного транскрипционного состояния, когда это необходимо. Зачастую корегуляторы несут несколько таких узнающих/модифицирующих доменов. Например, не смотря на то, что СВР имеет бромодомен, для выполнения своей функции гистонацетилтрансферазы ему также необходим и PHD домен. В тоже время, ТірбО и MOF имеют хромодомены, но не обладают PHD или бромодоменами. Присутствие различных доменов в ацетилтрансферазах согласуется с взглядом на специфическое, своевременное вовлечение их в цикл активации. При репрессии наблюдаются сходные механизмы. Например, хромодомен белка НР1 узнает метилированный К9 гистона НЗ и запускается механизм длительного транскрипционного молчания гена (Volpe, Kidner et al. 2002). Кроме того, недавние исследования продемонстрировали, как некоторые хроматин-связывающие факторы могут изменять субстратную специфичность хроматин-модифицирующих ферментов. Примером служит привлечение LSD1 на промотор с помощью COREST, где диметил К4 гистона НЗ является субстратом для действия деметилазы (Lee, Wynder et al. 2005). В другом случае, когда LSD1 привлекается при помощи андрогенового рецептора, она функционирует как К9-НЗ деметилаза, а ее действие стимулирует лиганд-зависимую транскрипцию (Metzger, Wissmann et al. 2005).
Существование специфического порядка действия гистон/фактор-модифицирующих комплексов представляет собой сигнальный путь, определяющий активное/репрессированное состояние гена, а для сенсоров, действие которых специфично во времени, существуют дополнительные сигнальные пути, изменяемые через периодические интервалы обмена корегуляторными комплексами. Эта циклическая система зависит от системы упреждения, в которой какая либо метка, вызывающая преимущественное рекрутирование какого-то одного комплекса, может быть изменена, чтобы разрешить последующее привлечение следующих комплексов каскада, вызывая изменение в промоторном комплексе и гистоновых модификациях, которые стимулируют следующую когорту корегуляторов. Этот обмен также требует специальной стратегии для быстрого очищения промотора от предыдущего в цикле кофакторного комплекса, которая достигается или его быстрой деградацией и/или быстрым перемещением. Результатом такого циклического обмена является то, что постоянно изменяемый набор гистоновых модификаций и коактиваторных комплексов является платформой для привлечения следующего кофакторного комплекса, основываясь на действии каждого предыдущего.
Семейство корегуляторных комплексов SAGA
Около десяти лет назад в составе SAGA комплекса был описан эволюционно консервативный транскрипционный коактиватор/адапторный белок Gcn5, обладающий активностью гистонацетилтрансферазы. Было показано, что ацетилирование гистонов связано с активацией экспрессии генов и что ацетилирование гистонов является направленным процессом (Grant, Duggan et al. 1997). Ферменты гистоацетилтрансферазы переносят ацетильную группу ацетил-коэнзима А на е-аминогруппу лизинового остатка в составе гистона. Удаление ацетильных групп с N-концевых «хвостов» гистонов при помощи гистондеацетилаз играет важную роль противоположную ацетилтрансферазной активности и чаще всего стимулирует репрессию транскрипции. (Yang and Seto 2003). Некоторые ингибиторы гистондеацетилаз в настоящее время тестируются для применения в химиотерапии рака, чтобы реактивировать «молчащие» гены (супрессоры опухолей), показывая возможность использования эпигенетических механизмов для лечения различных заболеваний (Marks, Miller et al. 2003). Рекомбинантный белок Gcn5 обладает гистоацетшпрансферазной активностью, он способен переносить ацетильный остаток на N-терминальные концы гистонов НЗ и Н4 in vitro. Проявляемая активность специфична для К14 остатка гистона НЗ и в меньшей степени К8 и К14 гистона Н4 (Kuo, Brownell et al. 1996).
Большое количество нуклеосомных гистонацетилтрансферазньгх активностей было выделено у многих организмов (от дрожжей до человека). Некоторые из них содержали белки, гомологичные Gcn5, (Gcn5-related acetyltransferase - GNAT) в качестве каталитической субъединицы. У дрожжей они включают в себя SAGA, SLIK, ADA и НАТ-А2 комплексы, которые у человека соответственно называются STAGA, TFTC и PCAF. Различные компоненты этих комплексов играют значительную роль в определении субстратной специфичности гистонацетилтрансферазы, а также направленность этой активности на специфический ген (Torok and Grant 2004).
Дрожжевые SAGA (Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase) и SLIK (SAGA-like)/SALSA (SAGA altered, Spt8 absent) представляют собой два достаточной больших ( 1.8 МДа) коактиваторных комплекса, которые необходимы для экспрессии большого числа генов, транскрибируемых РНК полимеразой II. Оба комплекса ацетилируют нуклеосомные НЗ и Н2В и содержат группу белков, которая была прежде описана как транкрипционные регуляторы. Они были разделены на группу Spt белков, взаимодействующих с ТАТА-связывающим белком (ТВР); Ada группу, функционально связанную с нуклеосомной гистоацетилтрансферазной активностью, белок Tral, который взаимодействует с ДНК-связывающими активаторами для привлечения на промотор, а также ТВР-ассоциированные факторы (TAF), которые способны помогать рекрутировать основную транскрипционную «машину».
Кроме ацетилирования НЗ и Н2В, семейство SAGA комплексов также модифицирует гистоны посредством ЦЪр8-зависимого Н2В-К123 деубиквитинилирования. Удаление остатка убиквитина с Н2В может стимулировать транскрипцию (Henry, Wyce et al. 2003). Стоит отметить, что SAGA и SLIK комплексы необходимы для функционирования клетки в состоянии стресса, чтобы активировать транскрипцию стресс-зависимых генов, отражая тем самым важную роль этих комплексов в активации транскрипции. (Huisinga and Pugh 2004)
Не смотря на большое сходство комплексов, они обладают различными и разделяемыми функциями, вследствие их структурных различий. Например SLIK-специфический компонент Rtg2 связывает этот комплекс с дрожжевым путем обратного ответа, который важен для экспрессии генов во время нарушения митохондрий (Ргау-Grant, Schieltz et al. 2002). Мутация гена RTG2 нарушает целостность комплекса SLIK, и в тоже время не оказывает никакого действия на SAGA комплекс.
Для того, чтобы выполнить свои функции коактиваторов и критических регуляторов транскрипции, SAGA и SLIK зачастую привлекаются на промотор посредством ДНК-связывающих транскрипционных активаторов (Carrozza, Utley et al. 2003). SAGA комплекс взаимодействует непосредственно с многочисленными активаторами, в основном посредством своей Tral субъединицы, и способен стимулировать транскрипцию in vitro с хроматинизированной матрицы. Некоторые из субъединиц комплексов способны проявлять различные активности, будучи направленными к различным генам. Например, SPT3 и SPT8 необходимы, чтобы стимулировать взаимодействие с ТВР на промоторах генов ADH1, Н084 и VTC3 (Bhaumik and Green 2002), но ингибируют взаимодействие с ТВР будучи направленными к HIS3, TRP3 и НО генам. (Belotserkovskaya, Sterner et al. 2000)
Также дополнительный уровень регуляции этого мультисубъединичного комплекса достигается за счет того, что и его компоненты, также как и гистоны, могут быть пост-трансляционно модифицированы.
Семейство комплексов CHD
В 1993 году в лаборатории Перри была клонирована первая хромодомен-содержащая хеликаза CHD1 мыши (Delmas, Stokes et al. 1993). После, родственные белки были обнаружены во многих других эукариотах. Семейство CHD дрозофилы насчитывает четырех членов: dCHDl, dCHD3, dMi-2 и Kismet. Все члены этого семейства содержат по два хромодомена (модификатор организации хроматина). В отличие от dCHDl, dCHD3 и dMi-2 также в своем составе имеют один или два PHD (Plant homeodomain) цинкового пальца на их N-конце соответственно. Белок Kismet имеет домен BRK, не обнаруженный у других членов этого семейства.
Белок dCHD обнаруживается в пуфах политенных хромосом дрозофилы и колокализуется с РНК полимеразой II (Srinivasan, Armstrong et al. 2005). Также для dCHDl было показано, что его хромодомен 1 способен специфически взаимодействовать с хвостом гистона НЗ, метилированным по К4 лизину (Pray-Grant, Daniel et al. 2005) Эта модификация хвоста гистона сопряжена с активно транскрибируемым хроматином. В противоположность другим ремоделируїощим комплексам, белок dCHDl не образует комплекса и функционирует как мономер (Lusser, Urwin et al. 2005). Комплексы Mi-2
В 1995 году в качестве антигена был выделен человеческий дерматомиозит-специфичный белок Mi-2. Немного позднее несколькими группами была очищена нуклеосом ремоделирующий гистондеацетилазный комплекс NuRD, содержащий ферменты, гомологичные Mi-2 (Zhang, LeRoy et al. 1998)
Несмотря на различие в субъединичном составе этих комплексов, все они содержали Mi-2 АТФазу и гистондеацетилазный кор, состоящий из гистондеацетилаз 1 и 2 (HDAC 1 и 2), а также гистон-связывающих белков р46 и р48, ассоциированных с ретинобластомой (Verreault, Kaufman et al. 1998). Точно такой же деацетилазный кор присутствует в репрессорном комплексе Sin3 (Zhang, Iratni et al. 1997). Позже были обнаружены и другие компоненты Mi-2 содержащих комплексов: МТА, рбб/68 и MBD. Выделение NuRD комплексов целиком изменило точку зрения о том, что ремоделирование хроматина и модификации гистонов выполняются совершенно различными белковыми комплексами.
Так, анализ делеционных мутантов dMi-2 выявил, что наличие хромодомена является абсолютно необходимым для передвижения комплексом нуклеосом in vitro. (Bouazoune, Mitterweger et al. 2002). Однако, непосредственного связывания dMi-2 с метилированными НЗК9 и НЗК4 обнаружить не удается. Возможно, это связано с особенностью самого dMi-2 подвергаться модификации (фосфорилированию). Так фосфорилирование dMi-2 казеин киназой 2 снижает его способность связывать нуклеосомы и, в свою очередь, понижает ремоделирующие свойства комплекса. dCHD3 О dCHD3 известно очень мало. Кодируется этот белок безинтронным геном, последовательность которого высоко гомологична dMi-2. Продукт гена представляет собой урезанную форму dMi-2, которая не содержит N-концевой последовательности, включая первый PHD домен, а также всей С-концевой области за АТФазным доменом.
Kismet Ген kismet был обнаружен как сильный супрессор мутации Рс, которая классифицирует его как trzG ген. (Kennison and Tamkun 1988). Этот ген кодирует длинный (KIS-L) и короткий (KIS-S) белки размером 574 кДа и 225 кДа соответственно. В дополнение к АТФазному домену и паре хромодоменов длинный белок содержит BRK (BRM и KIS) домен, также обнаруженный в BRM. Так как короткий белок соответствует только последней трети длинного белка, то он содержит только BRK домен, функции которого пока не известны. Таким образом, KIS-S не является функциональным ремоделером хроматина. Также, как и остальные белки ремоделирующие хроматин и принадлежащие семейству, KIS-L локализуется на политенных хромосомах в зонах деконденсированного хроматина, там же, где обнаруживается РНК полимераза II (Srinivasan, Armstrong et al. 2005). Более того, этот белок в основном колокализуется с РНК полимеразой II на стадии инициации/ранней элонгации. Возможно, KIS-L играет большую роль в транскрипции РНК полимеразой II, помогая переходить ей из стадии инициации в элонгацию.
Также функциональный ген kis необходим для активации рецептора тирозин киназы под действием сигналов (Therrien, Morrison et al. 2000). Кроме того, есть некоторые данные о связи этого гена с Notch сигналингом.
Определение коактиваторов, обеспечивающих способность SAY домена активировать транскрипцию репортерного гена
Для определения коактнваторов, при помощи которых домен SAY осуществляет свою активаторную функцию в S2 клетках D. melanogaster было изучено, как снижение внутриклеточного уровня различных компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции влияет на экспрессию репортерного гена, активированного при помощи SAY в описанной системе (Рис. 2А).
Для большей стабильности результатов, а также для сохранения влияния организации хроматина в области промотора на его работу (в некоторых работах было показано, что ДНК плазмид при временной трансфекции в клетку не несет нуклеосом) были получены две линии S2 клеток D. melanogaster, стабильно экспрессирующие SAY и SAY-PHD домены в составе конструкции pTrAssay. Далее приведены эксперименты, выполненные на линии клеток, несущей SAY домен, однако стоит отметить, что и для линии SAY-PHD были получены схожие результаты.
Для определения роли различных коактнваторов транскрипции в активации при помощи SAY домена была изучена экспрессия репортерного гена в клетках стабильной линии, несущей SAY домен, в условиях снижения уровня различных компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции при помощи РНК-интерференции. Для этого к S2 клеткам линии, стабильно экспрессирующей SAY домен в составе контрукции pTrAssay была добавлена двухцепочечная РНК, комплементарная последовательности белков-компонентов коактиваторных комплексов. В качестве мишеней для РНК-интерференции были выбраны следующие белки: TAF1 и TAF4 - компоненты общего фактора транскрипции TFIID, РВАР и ВАР 170 - компоненты ремоделирующего коактиватора Brahma, GCN5 - гистонацетилтрансферазы семейства коактиваторов SAGA, ISWI - АТФазы ремоделирующих коактиваторов семейства ISWI. На нижней панели рисунка 2А приведен вестерн-блот анализ, показывающий снижение уровня изучаемых белков после проведения РНК-интерференции. Через четверо суток после добавления соответствующей двухцепочечнои РНК из клеток S2 получали лизат, который по такой же схеме, как и в предыдущем эксперименте анализировали на относительную активность домена SAY. То есть измеряли уровень активности гена репортера и количество домена в лизате.
Значительное снижение активации экспрессии репортерного гена SAY доменом было обнаружено при РНК-интерференции компонентов общего фактора транскрипции TFIID и хроматин-ремоделирующего комплекса Brahma. Следовательно, их присутствие в клетке важно для активации репортерного гена при помощи SAY домена.
В тоже время, снижение уровня ССН5-гистонацетилтрансферазы и ISWI-ремоделирующей АТФазы, которые также являются компонентами комплексов-коактиваторов транскрипции (семейств коактиваторов SAGA и ISWI соответственно), не оказало влияния на способность SAY-домена активировать транскрипцию.
Было показано, что для активации экспрессии при помощи домена SAY необходимы коактиваторы TFIID и Brahma.
Было решено проверить, что обнаруженные коактиваторы не просто способствуют активации репортерного гена в исследуемой конструкции, но и привлекаются на минимальный промотор посредством непосредственного взаимодействия с доменом SAY. Для подтверждения взаимодействия консервативного домена SAY и коактиваторов TFIID и Brahma из клеток линии, стабильно экспрессирующей SAY в составе pTrAssay был получен лизат, из которого при помощи aHTH-FLAG-arapo3bi (Sigma) был осажден домен SAY (Рис.2Б). Для иммунпреципитации была использована анти-FLAG агароза, так как экспрессированный в конструкции pTrAssay домен SAY был маркирован тройным FLAG эпитопом.
Проанализировав фракцию, осаждаемую доменом SAY на присутствие компонентов коактиваторов транскрипции, обнаружили, что SAY способен соосаждать компоненты коактиваторов TFIID и Brahma и не способен соосаждать ОСЫ5-ацетилтрансферазу (компонент семейства комплексов SAGA) и ISWI-ремоделирующую АТФ-азу (компонент семейства комплесов ISWI) из лизата S2 клеток.
Такими же свойствами обладал участок белка, содержащий SAY и PHD домены, в то время, как сами по себе PHD домены оказались не способными соосаждать ни один из изучаемых белков.
Таким образом, в результате проведенного эксперимента было показано, что способность изучаемого нами домена SAY активировать транскрипцию репортерного гена зависит от уровня компонентов общего фактора транскрипции TFIID и хроматин ремоделирующего коактиватора Brahma. Было показано взаимодействие SAY домена с коактиваторами TFIID и Brahma in vivo. На основании приведенных данных, можно предположить, что коактиваторы TFIID и Brahma влияют на способность SAY домена активировать транскрипцию репортерного гена.
Похожие диссертации на Изучение механизма действия нового коактиватора транскрипции
