Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава І. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
Структура, физико-химические свойства и функции сывороточного альбумина 8
Ассоциация сывороточного альбумина с лиган-
дами 14
1.3. Влияние малых молекул на конформацию
альбумина 17
1.4. Пенициллины и их связывание с сывороточным
альбумином 23
Глава 2. МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТА И ОБРАБОТКИ ДАННЫХ 30
Калориметрические методы исследования растворов биополимеров 30
Метод проточкой микрокалориметрии 32
2.2.1. Обработка экспериментальных данных 35
2.3. Метод дифференциальной сканирующей калоримет
рии 41
Обработка экспериментальных данных 47
Контрольные опыты 50
Определение температуры денатурации ЧСА по изменению оптической плотности 56
Кинетический анализ тепловой денатурации сывороточного альбумина человека 58
2.6. Объекты исследования 62
Глава 3. ШЗЙШ-ХЙМИЧЕСКЙЕ ПАРАМЕТРЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
ПЕНИЦЙЛЛИНОВ С СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ И
ТЕПЛОВОЙ ДЕНАТУРАЦИИ ОБРАЗУЩИХСЯ КОМПЛЕКСОВ
(результаты эксперимента) 64
Глава 4. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ АССОЦИАЦИИ В СИСТМЕ
ІШШЩЛИН-ШВИРОТОЧНЬЙ АЛЬБУМИН ЧЕЛОВЕКА
(Обсуждение результатов) 93
4.1. Природа активных центров альбумина 94
Пенициллины первой группы 95
Пенициллины второй группы 100
4.2. Изменение конформации молекулы сывороточного
альбумина при связывании пенициллинов. . . . 102
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 105
ВЫВОДЫ 108
ЛИТЕРАТУРА НО
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
Щ - активный центр альбумина
БСА- бычий сывороточный альбумин
ДСК- дифференциальная сканирующая калориметрия
ПМК- проточная микрокалориметрия
СА - сывороточный альбумин
ЧСА- сывороточный альбумин человека
ЭПР- электронный парамагнитный резонанс
Введение к работе
Тот факт, что большинство антибиотиков, попадая в кровь млекопитающих, образуют комплекс с альбуминовой фракцией крови, известен давно. Уже в начале практики клинического применения пениниллиыов было обнаружено уменьшение их антибактериальной активности в присутствии сыворотки крови. В дальнейшем установили, что пенициллины взаимодействуют только с сывороточным альбумином как in vivo , так и In vitro. Поскольку активным началом обладает свободная (несвязанная) фракция введенного лекарства, степень связывания имеет решающее значение при оценке его фармакологического действия. Молекулы лекарств конкурируют за активные центры белка с соединениями, участвующими в жизнедеятельности организма, для которых сывороточный альбумин осуществляет транспортную функцию. Все это вызвало появление большого количества работ, направленных на исследование механизма взаимодействия пенициллинов с сывороточным альбумином; расшифровка молекулярной природы сил, присутствующих в образовании комплекса, необходима как в плане понимания самого механизма ас-сгоциации, так и для углубления представлений о транспорте антибиотиков в организме.
При ассоциации антибиотиков с сывороточным альбумином установлен обратимый характер такого взаимодействия; количественная информация ограничивается процентом связывания либо, в лучшем случае, константой ассоциации, определенной при одной температуре. Однако, в литературе единой точки зрения на природу такого взаимодействия на сегодня нет. Большинство исследователей сходятся во мнении о преобладающем значении гидрофобного связыва-
- б -
ния между компонентами комплекса; выводы относительно участия в комплексообразовании других сил противоречивы. В раде работ придается большое значение электростатическим взаимодействиям, другие исследователи отвергают их роль в образовании комплексов. Указывают также на существование водородных связей в рассматриваемой системе.
Упомянутые противоречия связаны с недостаточной информативностью применявшихся до настоящего времени методов исследования. Так, прямые калориметрические эксперименты, обеспечивающие получение достоверной информации о термодинамике взаимодействия в системе сывороточный альбумин человека - пенициллины, до настоящего времени не проводились.
Целью нашей работы было исследование природы молекулярных сил при ассоциации восьми пенициллинов (оксациллина, клоксацил-лина, диклоксациллина, феноксиметилпенициллина, нафциллина, бвн-зилпенициллина, метициллина и ампициллина) с сывороточным альбумином человека, определение количества активных центров белка для данного лекарства, расчет и сопоставление констант связывания в изучаемой системе, а также рассмотрение влияния связанных антибиотиков на конформацию белка-носителя.
В экспериментальной части работы нами впервые для исследования системы сывороточный альбумин человека - пенициллины были применены методы проточной микрокалориметрии и дифференциальной сканирующей калориметрии. Выбранные методы позволили непосредственно измерить энтальпию комплексообразования в изучаемой системе, температуру и энтальпию денатурации сывороточного альбуїшна и его комплексов с пенициллинами и рассчитать основные термодинамические параметры ассоциации.
Метициллин и ампициллин при взаимодействии с сывороточным альбумином человека не вызывают резких изменений конформации белка. При связывании первой молекулы оксациллина, клоксацилли-на, диклоксациллина, нафциллина, феноксиметилпенициллина и бен-зилпенициллина наблюдался конформационный переход макромолекулы, сопровождаемый появлением дополнительных активньсс центров белка. Впервые, определено количество первичных и вторичных центров сывороточного альбумина при связывании с изученными пенициллинами, константы связывания, а также получена полная термодинамическая информация о взаимодействии лиганда с таким активным центром.
Похожие диссертации на Изучение молекулярного механизма ассоциации некоторых антибиотиков с сывороточным альбумином человека
