Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор данных литературы. 19-76
1.1. Моноклональные антитела как инструмент изучения вирусных белков. 19
1.1.1. Моноклональные антитела: получение и основные свойства. 19
1.1.2. Исследование и картирование антигенных детерминант на вирусных белках с помощью МКА. 22
1.2. Филовирусы: вирусы Марбург и Эбола.
1.2.1. Классификация, морфология, организация генома, структура и функции белков. 25
1.2.2. Иммунитет при филовирусных инфекциях. 35
1.2.3. Вакцинный потенциал филовирусных белков. 39
1.2.4. МКА к филовирусам: получение, свойства и применение. 42
1.3. Флавивирусы: вирус Западного Нила (ВЗН). 43
1.3.1. Общая характеристика ВЗН 43
1.3.2. Структурные белки флавивирусов и белок Е ВЗН. 46
1.3.3. Моноклональные антитела против структурных белков ВЗН в изучении флавивирусов. 48
1.4. Ортопоксвирусы: ВНО, ВОВ, ВОК, ВЭм. 51
1.4.1. Краткая характеристика ортопоксвирусов. 51
1.4.2. Некоторые методы исследования ортопоксвирусных белков. 53
1.4.3. Мембранные белки ортопоксвирусов. 56
1.4.4. МКА против структурных белков ортопоксвирусов. 63
1.5. Использование рекомбинантных белков для изучения и картирования антигенных детерминант на вирусных белках. 67
1.6. Гибридомные МКА и рекомбинантные одноцепочечные, химерные и гуманизированные антитела на их основе. 69
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть (Материалы и методы). 77-95
2.1. Исходные материалы. 77
2.1.1. Материалы и реактивы. 77
2.1.2. Вирусные препараты. 77
2.1.3. Клеточные культуры и среды. 80
2.1.4. Сыворотки и иммуноглобулины . 80
2.1.5. МКА к вирусным белкам. 81
2.1.6. Рекомбинантные белки вирусов и рекомбинантные антитела. 82
2.2. Методы получения гибридом и приготовления МКА. 82
2.2.1. Иммунизация животных-доноров иммунных спленоцитов . 82
2.2.2. Получение гибридом. 83
2.2.3. Клонирование гибридом. 86
2.2.4. Криоконсервация клеточных линий. 86
2.2.5. Наработка значительных количеств МКА in vivo. 87
2.2.6. Методы очистки МКА. 87
2.2.7. Измерение концентрации белковых препаратов. 88
2.2.8. Определение класса и подкласса моноклональных иммуноглобулинов. 89
2.2.9. Приготовление конъюгатов антител с биотином. 89
2.3. Иммунологические методы. 89
2.3.1. Твердофазный иммуноферментный анализ. 89
2.3.2. Конкурентный иммуноферментный анализ. 90
2.3.3. Определение константы аффинности МКА. 92
2.3.4. Иммуноблот. 93
2.3.5. Реакция нейтрализации вируса in vitro. 94
2.3.6. Антителозависимый лизис инфицированных вирусом клеток. 94
2.3.7. Определение протективной активности МКА при пассивной
иммунизации животных. 94
2.4. Электрофорез. 94
2.5. Статистическая обработка результатов. 95
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение исследований. 96-246
3.1. Создание, расширение и изучение коллекции гибридом ГНЦ ВБ «Вектор» » за период с 1982 по 2007 годы. 96
3.2. Особенности технологии получения гибридом - продуцентов МКА к возбудителям особо опасных инфекций и изучение свойств антител . 103
3.2.1. Исследование препаратов вирусов Марбург и Эбола, используемых для получения гибридом. 104
3.2.2. Получение коллекции гибридом, продуцирующих MICA к филовирусам, и изучение свойств гибридомных антител. 112
3.3. Использование МКА в изучении белков филовирусов, их антигенной структуры, биологической активности и иммуногенных свойств. 119
3.3.1. Применение специфических моноклональных и поликлональных антител для выявления перекрестно-реактивных антигенных детерминант на структурных белках филовирусов Марбург и Эбола. 119
3.3.2. Выявление иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков NP, VP35 и VP40 ВМ, на репродукцию вируса. 124
3.3.3. Определение с помощью моноклональных и поликлональных антител иммунодоминантных белков филовирусов, формирующих В-клеточный иммунный ответ. 130
3.4. Изучение белков филовирусов и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических поликлональных и моноклональных антител . 141-157
3.4.1, Использование моноклональных антител для сравнительного изучения иммуногенных и антигенных свойств белка VP35 вируса Эбола и его рекомбинантного аналога. 141
3.4.2. Изучение белков NP, VP40 и VP35 вируса Марбург и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических моноклональных и поликлональных антител. 153
3.5. Картирование антигенных детерминант и эпитопов белков филовирусов Марбург и Эбола, с использованием моноклональных антител, рекомбинантных белков и их фрагментов. 158
3.5.1. Топологическое картирование антигенных сайтов и эпитопов на белках NP, VP40 и VP35 вируса Марбург. 158
3.5.2. Картирование антигенных детерминант и эпитопов для МКА на аминокислотной последовательности белков VP35 филовирусов Марбург и Эбола. 164
3.6. Изучение перекрестного взаимодействия МКА против ортопоксвирусов с патогенными и непатогенными для человека ортопоксвирусами. 182
3.6.1. Определение видоспецифических эпитопов ВЭм и родоспецифических эпитопов ВНО, ВОВ, ВОК и ВЭм 183
3.6.2. Выявление перекрестной нейтрализующей активности МКА, реагирующих с белками слияния 14 кДа вирусов эктромелии (ген 129L) и натуральной оспы (ген A30L). 189
3.7. Исследование с использованием гибридомных МКА антигенных 201-245
взаимоотношений штаммов вируса Западного Нила, изолированных в России и за рубежом. 202
3.7.1. Получение и характеристика МКА, реагирующих с общими и дифференцирующими антигенными детерминантами ВЗН.
3.7.2. Изучение с использованием нейтрализующих МКА антигенной вариабельности штаммов ВЗН, изолированных из различных регионов России и за рубежом. 213
3.8. Сравнительный анализ нейтрализующей активности гибридомных МКА 9Е2 и рекомбинантных одноцепочечных scFv 9Е2
и гуманизированных Fc-9E2 антител против белка . 230
Заключение.
Выводы.
Список используемой литературы.
- Моноклональные антитела: получение и основные свойства.
- Сыворотки и иммуноглобулины
- Особенности технологии получения гибридом - продуцентов МКА к возбудителям особо опасных инфекций и изучение свойств антител
- Изучение белков филовирусов и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических поликлональных и моноклональных антител
Введение к работе
Актуальность проблемы
Только за последние 3-4 десятилетия было выявлено около 30 новых возбудителей инфекционных болезней, поразивших за этот период сотни миллионов человек и унесших миллионы жизней. К их числу относятся несколько возбудителей острых и хронических диарей, гепатитов С и Е, возбудители венесуэльской (вирус Гуанарито) и бразильской (вирус Сабиа) геморрагических лихорадок, СПИДа, геморрагических лихорадок Эбола (вирус Эбола) и Марбург (вирус Марбург) и других заболеваний. Кроме того, инфекционные заболевания расширяют ареал своего распространения. Ярким примером возникновения и распространения в последнее время новых вариантов вирусов является проникновение вируса Западного Нила в Северную Америку (Нью-Йорк) в 1999 году и его повсеместное распространение по территории континентов Северной и Южной Америки. Под эгидой ВОЗ совместными усилиями правительств многих стран в 20-м веке удалось ликвидировать только одну вирусную инфекцию - натуральную оспу. Вместе с тем, в настоящее время по ряду причин, включая угрозу биотерроризма и отсутствие современных способов лечения и профилактики, центры по контролю и предотвращению болезней во многих странах снова ставят вирус натуральной оспы на первое место в списке потенциальных агентов массового поражения. Необходимо отметить, что для многих вновь возникающих инфекций нет ни средств специфического лечения, ни эффективных способов профилактики.
Вместе с тем, гибридомная технология, разработанная Kohler & Milstein (1975) для получения клеточных гибридов, гибридом, синтезирующих моноклональные антитела (МКА) предопределенной специфичности и высокого аффинитета, позволила вывести на новый уровень понимание многих структурно-функциональных особенностей биологических объектов, в том числе вирусов. Создание гибридомной технологии и изучение свойств МКА стимулировали проведение исследований на уровне аминокислотной последовательности вирусных белков в отношении многих вирусов патогенных для человека. Использование современных молекулярно-биологических методов в сочетании с МКА позволило получить целый комплекс новых фундаментальных данных: о структуре и функции вирусных белков; о природе взаимодействия антигена и антитела, о структуре вирусных антигенных детерминант и их функциях. Так, изучение взаимодействия МКА с вирусными белками и их рекомбинантными аналогами в системах in vivo и in vitro позволило идентифицировать наиболее важные структурные участки вирусных белков и локализовать их на аминокислотной последовательности, выявить особенности строения вирионов, получить новую информацию о роли вирусных белков в формировании противовирусного иммунитета. Именно с этими исследованиями из области молекулярной вирусологии и
иммунной биотехнологии связывается дальнейший прогресс в изучении структуры и функций вирусных белков и на его основе создания новых более эффективных методов иммунодиагностики вирусных заболеваний, способов профилактики и средств специфического лечения. Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы является получение с помощью моноклональных антител комплекса новых данных о структурно-функциональных свойствах белков патогенных для человека вирусов.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Освоить комплекс методов по технологии получения гибридом и создать
коллекцию гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к
структурным белкам вирусов патогенных для человека.
-
Получить и очистить моноклональные антитела, исследовать их иммунобиологические свойства и сформировать представительные панели МКА к структурным белкам вирусов.
-
Провести с помощью панелей моноклональных антител изучение структурных белков вирусов патогенных для человека, в том числе филовирусов, вирус Марбург (ВМ) и вирус Эбола (ВЭ), флавивирусов, вирус Западного Нила (ВЗН), ортопоксвирусов, вирус эктромелии (ВЭм), вирус осповакцины (ВОВ), вирус оспы коров (ВОК), вирус натуральной оспы (ВНО), в следующих направлениях:
выявление и изучение перекрестно-реактивных антигенных детерминант на белках филовирусов Марбург и Эбола;
определение иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков NP, VP35 и VP40 вируса Марбург (ВМ);
- исследование роли NP, VP35 и VP40 белков филовирусов в
формировании противовирусного иммунитета;
поиск и изучение перекрестно-реактивных и видоспецифических антигенных детерминант и эпитопов белков ортопоксвирусов;
исследование антигенной изменчивости штаммов ВЗН, выделенных в России и в ближнем зарубежье;
сравнительное изучение антигенной схожести вирусных белков и их рекомбинантных аналогов;
- детальное картирование эпитопов белка VP35 вирусов Эбола и Марбург и
гликопротеина Е ВЗН;
проведение сравнительного анализа противовирусной активности гибридомных и рекомбинантных одноцепочечных и гуманизированных антител против белка Е ВЗН. Научная новизна
Создание коллекции гибридных клеточных линий, гибридом, продуцентов антител к вирусным антигенам, и формирование представительных панелей МКА стимулировали исследование вирусов на
стыке трех наук, вирусологии, иммунологии и молекулярной биологии. С помощью МКА был проведен цикл работ по изучению антигенной структуры и картированию антигенных детерминант структурных белков флавивирусов, ортопоксвирусов, филовирусов и других вирусов, патогенных для человека. Проведенное исследование позволило получить комплекс новых данных по антигенной структуре изучаемых вирусов и уточнить функции вирусных белков в процессе формирования противовирусного иммунитета.
Так использование моноклональных антител позволило получить приоритетные данные по антигенной структуре нуклеокапсидных, NP и VP35, и матриксного VP40 белков вирусов Марбург и Эбола и ее роли в формировании противовирусного иммунитета.
Впервые обнаружено наличие общей перекрестно-реактивной антигенной детерминанты на нуклеокапсидных белках NP и VP35 вирусов Марбург и Эбола.
С помощью МКА проведено топологическое картирование эпитопов белков NP, VP40 и VP35 вируса Марбург. Установлено, что 7 эпитопов на структурных белках NP, VP35 и VP40 вируса Марбург, взаимно перекрываясь, образуют функциональный домен, индуцирующий синтез МКА. Именно эти МКА проявляли антивирусную активность - в присутствии комплемента они вызывали лизис клеток, инфицированных вирусом Марбург. В ходе уточнения роли антигенных детерминант на белке VP40 ВМ было выявлено 2 эпитопа, которые индуцируют синтез протективных антител В-клетками. Предварительное введение этих МКА в морских свинок защищает их от гибели при заражении ВМ.
В результате исследования закономерностей формирования противовирусного иммунитета на белки филовирусов обнаружено, что иммунный ответ, как на введение вирусного антигена, так и, по-видимому, в процессе начального развития филовирусной инфекции у выживших животных, формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные NP и VP35 белки и VP40 матриксный белок.
Анализ антигенной структуры белков филовирусов (NP, VP40, VP35 ВМ и VP35 ВЭ) и их рекомбинантных аналогов показал, что не только рекомбинантные белки, но и их фрагменты могут сохранять антигенную конформацию вирусных белков. Используя МКА и фрагменты рекомбинантных аналогов вирусных белков, впервые удалось провести картирование антигенных детерминант и эпитопов на аминокислотной последовательности VP35 белков вирусов Марбург и Эбола.
В результате анализа взаимодействия МКА с ортопоксвирусами была выявлена высокая перекрестная реактивность МКА против ВЭм с патогенными для человека ортопоксвирусами - ВОВ, ВОК и вирусом натуральной оспы. Было обнаружено, что белки слияния ВЭм (ген 129L), ВОВ (ген A27L), ВОК и ВНО (ген A30L) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками
вируснейтрализующих антител против ВОВ и ВНО; исследованные рекомбинантные полипептиды prl29L (ВЭм) и ргАЗОЬ (ВНО) имитируют эти вирусные эпитопы.
С помощью нейтрализующих МКА против штамма Vlg99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, выявлена значительная антигенная вариабельность современных штаммов ВЗН, циркулирующих в Евразии. Многие штаммы вели себя как типичные антигенные мутанты и были способны избегать нейтрализующего действия МКА, например, штаммы Нр-94 и Tur-2914, у которых выявлены различия в нейтрализации по 7 эпитопам. Даже штаммы Vlg99-27889 и VlgOO-27924, выделенные в Волгограде с интервалом в один год, показывали вариабельность в реакции нейтрализации по 4 эпитопам.
В результате анализа взаимодействия МКА с рекомбинантными пептидами белка Е ВЗН продемонстрировано наличие двух дискретных районов, вовлеченных в процессы (РН и РТГА) взаимодействия вируса с клеткой. Это район 321-466 ао белка Е ВЗН, несущий эпитопы для МКА, нейтрализующих все исследуемые штаммы ВЗН, и включающий домен III (305-394 ао) белка Е ВЗН. Второй район взаимодействия нейтрализующих МКА был локализован между 1-126 ао, которые включают аминокислотные остатки I и II доменов Е белка и, в частности, пептид слияния (98-113 ао) белка Е ВЗН, который участвует в проникновении вируса в клетку.
В результате сравнительного изучения иммунобиологических свойств МКА 9Е2 и их рекомбинантных аналогов (одноцепочечных и гуманизированных антител) было обнаружено, что рекомбинантные аналоги сохранили конформацию вариабельного домена исходных гибридомных антител, определяющего способность взаимодействовать с эпитопами гликопротеина Е ВЗН и нейтрализовать in vitro инфекционность вирионов ВЗН. Нейтрализующая активность полученных гуманизированных антител Fc-9E2 в разведении 1/1024000 против ВЗН была сравнима с таковой гибридомных антител.
Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены патентами и авторскими свидетельствами: № 2142507; № 2281327; №2265658; № 2144565 и отражены в публикациях в реферируемых отечественных и зарубежных журналах и изданиях.
Практическая ценность работы.
В результате проделанной работы был успешно создан банк гибридом ГНЦ ВБ "Вектор", в котором депонировано более чем 700 гибридом, секретирующих моноклональные антитела (МКА) к различным биологически активным молекулам и к структурным белкам патогенных для человека вирусов: к вирусам Японского энцефалита, Венесуэльского энцефаломиелита лошадей; восточного энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита, к белку р24 вируса иммунодефицита человека типа 1, к вирусу иммунодефицита человека типа 2, к вирусам полиомиелита тип 2, гепатита В,
гепатита А, а также к вирусу Западного Нила, к филовирусам, вирус Марбург и вирус Эбола; к ортопоксвирусам, включая вирус эктромелии, вирус осповакцины, вирусы оспы коров;. Полученные гибридомы и в настоящее время могут быть успешно использованы, как штаммы-продуценты для получения МКА.
Сформированная коллекция гибридом и полученные наборы МКА с изученными свойствами, панели МКА, к структурным белкам вирусов могут быть использованы для развития прикладных исследований в области иммунодиагностики вирусных инфекций:
в диагностических целях для создания диагностических препаратов и тест-систем;
в качестве средств контроля в производстве иммунобиологических препаратов;
в качестве лигандов для аффинной хроматографии и с целью очистки биомолекул из сложных биологических смесей.
В то же время, представленные научные результаты по изучению антигенной структуры и функций вирусных белков могут способствовать развитию и созданию не только иммунодиагностических, но и иммубиологических препаратов для профилактики и защиты от патогенных для человека вирусов.
Исследуемые в работе рекомбинантные белки и полипептиды филовирусов (вирусы Марбург и Эбола), ортопоксвирусов (ВНО и ВЭм) и флавивирусов (ВЗН) могут быть использованы в качестве антигена, как для разработки иммунодиагностических тест-систем, так и профилактических препаратов.
Полученные и описанные в работе гуманизированные вируснейтрализующие антитела против ВЗН являются, на наш взгляд, перспективными для разработки препаратов нового поколения для профилактики и терапии лихорадки Западного Нила.
В представляемой диссертационной работе на защиту выносятся следующие положения:
-
Создание оригинальной коллекции гибридом, которые и в настоящее время могут быть успешно использованы как штаммы-продуценты, секретирующие моноклональные антитела к структурным белкам вирусов патогенных для человека, позволяет обеспечивать научные и экспериментально-производственные исследования стабильными, очищенными, гомогенными и высокоаффинными препаратами антител с определенной специфичностью.
-
Наборы очищенных препаратов МКА с изученными свойствами, панели МКА, могут быть успешно использованы для изучения структурных белков вирусов патогенных для человека, включая филовирусы (вирусы Марбург и Эбола), флавивирусы (вирус Западного Нила), ортопоксвирусы (ВЭм, ВОВ, ВОК и ВНО).
3. Нуклеокапсидные, NP и VP35, и матриксные VP40 белки
филовирусов играют значительную роль в формировании защитного
иммунного ответа организма: так в процессе развития филовирусной
инфекции иммунный ответ у переболевших животных формируется, прежде
всего, на нуклеокапсидные, NP и VP35, и VP40 матриксный белки
филовирусов, что, возможно, является определяющим фактором выживания.
-
Белки слияния ВЭм (ген 129L), ВОВ (ген A27L), ВОК и ВНО (ген A30L) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против ВОВ и вируса натуральной оспы.
-
Современные штаммы ВЗН, циркулирующие в Евразии, обладают значительными антигенными отличиями: с помощью панели МКА против штамма Vlg99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, на структурных белках ВЗН выделено не менее 13 различных эпитопов (11 из которых расположено на Е гликопротеине). Кроме того, выявлены максимальные антигенные различия в реакции нейтрализации у штаммов Нр-94 (год выделении 1963) и Tur-2914 (год выделении 1973), у которых, по-видимому, изменено по 7 эпитопов на белке Е ВЗН.
6. Получены МКА, которые обладают нейтрализующей активностью
против 7 исследованных штаммов ВЗН, являются перспективными для
создания иммунодиагностических наборов и, возможно, для разработки
препаратов для иммунотерапии тяжелых случаев лихорадки Западного Нила.
Так, на наш взгляд, высоко активные нейтрализующие гуманизированные
антитела Fc-9E2 привлекательны для будущего конструирования и создания
нового антивирусного препарата для лечения лихорадки Западного Нила.
7. Используемая нами методология, включающая объединенное
применение двух инструментов исследования, панели МКА и набора
антисывороток, а также рекомбинантных белков и их фрагментов, с
изученными свойствами, позволяет расширить наши возможности при
картировании и перейти к локализации эпитопов связывания с МКА на
аминокислотной последовательности вирусных белков.
Апробация работы Материалы диссертационной работы были представлены на следующих международных или всесоюзных конференциях, симпозиумах, семинарах: Third Congress of the European Society for Veterinary Virology, Immunobiology of Viral Infection, Interlaken, Switzerland, September 4-7, 1994; First European Meeting of Virology, Wurzburg, Germany, September 10-13, 1995; Vth International Congress on the Impact of Viral Diseases in the Developing World, Johannesburg, South Africa, July9-14, 1995; Xth International Congress of Virology (Jerusalem, Izrael, 1996); Russian-German colloquium on filovirases: the modern state of problem (Koltsovo, Novosibirsk region, Russia, 1997); Vlth Biological Medical Defense Conference (Munich, Germany, 1999); Inauguration of the Swedish Containment Laboratories (Stockholm, Sweden, 2000); IX
Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии (Крым, Гурзуф, Украина, 2001); VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций, ИБХ РАН (Москва, Россия, 2001); 3-й Ежегодный семинар, посвященный рассмотрению программы научных исследований в области биозащиты (Санкт-Петербург, Россия, 2003).
Связь выполненной работы с планом научных исследований
Работа выполнена в ГНЦ ВБ «Вектор» (1982-2007 гг) в рамках научных тем, выполняемых по Программе Центра по приоритетному направлению «Изучение структурно-функциональной организации и молекулярной эволюции геномов особо опасных вирусов человека и животных» и ряда других научно-исследовательских работ и научно-технических программ Центра. Исследования были также поддержаны государственной программой «Новейшие методы биоинженерии», «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники, подраздел: Защита от патогенов», контракт № 43.035.11.1529 (рук. Чепурнов А.А.); проектами Международного научно-технического центра (МНТЦ) ISTC № 1198 и ISTC № 2087 (рук. Локтев В.Б.), грантами российского фонда фундаментальных исследований № 97-04-49697-а (рук. Разумов И.А.), №98-04-49439-а (рук. Нетесов СВ.), 01-04-49877-а (рук. Качко А.В.), №01-04-48972-а (рук. Разумов И.А.).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 35 статей, получено 4 патента на изобретения штаммов гибридных клеток, представлено более 35 тезисов. Все исследования выполнены в ГНЦ ВБ «Вектор». Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом, под его руководством и в соавторстве с дбн В.Б. Локтевым (глава 3), кбн Е.В. Агапов (раздел 3.1), кбн А.В. Перебоев (раздел З.1., 3.8), Е.Е. Коноваловым (раздел З.1., 3.7), кбн В.А. Святченко (раздел 3.1 и 3.8), кбн Е.В. Протопопова (раздел 3.1 и 3.7), кбн Е.И. Казачинская (раздел 3.1 - 3.5., 3.7 и 3.8), дбн, чл-корр. РАН СВ. Нетесов (раздел 3.1-3.5), кбн А.А. Букреев (раздел 3.2, 3.4 и 3.5), кбн А.А. Чепурнов (раздел 3.2-3.5), кбн А.А. Беланов (раздел 3.2, 3.3 и 3.6), Н.И. Бормотов (раздел 3.2, 3.3 и 3.6), кбн А.В. Качко (раздел 3.4., 3.5., 3.7 и 3.8), кбн А.В. Сорокин (раздел 3.4., 3.5 и 3.8), А.В. Иванова (раздел 3.4., 3.5 и 3.7), дбн Е.И. Рябчикова (раздел 3.4), кбн В.А. Терновой (раздел 3.4 и 3.5), Т.Н. Рудзевич (раздел 3.4 и 3.5), дбн С.Н. Щелкунов (раздел 3.6), кбн И.П. Гилева (раздел 3.6), кбн Г.В. Кочнева (раздел 3.6), М.А. Васильева (раздел 3.6), кбн Т.С. Непомнящих (раздел 3.6), а также с некоторыми другими соавторами, ссылки на которых даны в тексте
данной работы при описании конкретных результатов исследований. Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам за сотрудничество.
Искренне признателен за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту д.б.н., проф. Локтеву Валерию Борисовичу.
Выражаю глубокую благодарность за критические замечания и помощь при оформлении и обсуждении диссертационной работы д.б.н. Татькову Сергею Ивановичу.
Объем и структура работы Диссертация изложена на 329 страницах, включающих 33 рисунка и 51 таблицу и список литературы (316 ссылок). Работа состоит из введения, трех глав (глава 1 - «Обзор данных литературы»; глава 2 - «Экспериментальная часть»; глава 3 - «Результаты и обсуждение исследований»), заключения, выводов, списка литературы и приложения.
Моноклональные антитела: получение и основные свойства.
Используемая нами методология, включающая объединенное применение двух инструментов исследования, панели МКА и набора антисывороток, а также рекомбинантных белков и их фрагментов, с изученными свойствами, позволяет расширить наши возможности при картировании и перейти к локализации эпитопов связывания с МКА на аминокислотной последовательности вирусных белков.
Апробация работы Материалы диссертационной работы были представлены на следующих международных или всесоюзных конференциях, симпозиумах, семинарах:....
Third Congress of the European Society for Veterinary Virology, Immunobiology of Viral Infection, Interlaken, Switzerland, September 4-7, 1994; First European Meeting of Virology, Wurzburg, Germany, September 10-13, 1995; Vth International Congress on the Impact of Viral Diseases in the Developing World, Johannesburg, South Africa, July9-14, 1995; Xth International Congress of Virology (Jerusalem, Izrael, 1996); Russian-German colloquium on filoviruses: the modern state of problem (Koltsovo, Novosibirsk region, Russia, 1997); Vlth Biological Medical Defense Conference (Munich, Germany, 1999); Inauguration of the Swedish Containment Laboratories (Stockholm, Sweden, 2000); IX Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии (Крым, Гурзуф, Украина, 2001); VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций, ИБХ РАН (Москва, Россия, 2001); 3-й Ежегодный семинар, посвященный рассмотрению программы научных исследований в области биозащиты (Санкт-Петербург, Россия, 2003).
Связь выполненной работы с планом научных исследований
Работа выполнена в ГНЦ ВБ «Вектор» (1982-2007 гг) в рамках научных тем, выполняемых по Программе Центра по приоритетному направлению «Изучение структурно-функциональной организации и молекулярной эволюции геномов особо опасных вирусов человека и животных» и ряда других научно-исследовательских работ и научно-технических программ Центра. Исследования были также поддержаны государственной программой «Новейшие методы биоинженерии», «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники, подраздел: Защита от патогенов», контракт № 43.035.11.1529 (рук. Чепурнов А.А.); проектами Международного научно-технического центра (МНТЦ) ISTC № 1198 (рук. Покровский А.Г.) и ISTC № 2087 (рук. Локтев В.Б.), грантами российского фонда фундаментальных исследований № 97-04-49697-а (рук. Разумов И.А.), №98-04-49439-а (рук. Нетесов СВ.), 01-04-49877-а (рук. Качко А.В,), №01-04-48972-а (рук. Разумов И.А.).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 35 статей, получено 4 патента на изобретения штаммов гибридных клеток, представлено более 35 тезисов. Все исследования выполнены в ГНЦ ВБ «Вектор». Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом, под его руководством и в соавторстве с дбн В.Б. Локтевым (глава 3), кбн Е.В. Агапов (раздел 3.1), кбн А.В. Перебоев (раздел З.1., 3.8), Е.Е. Коноваловым (раздел З.1., 3.7), кбн В.А. Святченко (раздел 3.1 и 3.8), кбн Е.В. Протопопова (раздел 3.1 и 3.7), кбн Е.И. Казачинская (раздел 3.1 - 3.5., 3.7 и 3.8), дбн, чл-корр. РАН СВ. Нетесов (раздел 3.1-3.5), кбн А.А. Букреев (раздел 3.2, 3.4 и 3.5), кбн А.А. Чепурнов (раздел 3.2-3.5), кбн А.А. Беланов (раздел 3.2, 3.3 и 3.6), Н.И. Бормотов (раздел 3.2, 3.3 и 3.6), кбн А.В. Качко (раздел 3.4., 3.5., 3.7 и 3.8), кбн А.В. Сорокин (раздел 3.4., 3.5 и 3.8), А.В. Иванова (раздел 3.4., 3.5 и 3.7), дбн Е.И. Рябчикова (раздел 3.4), кбн В.А. Терновой (раздел 3.4 и 3.5), Т.Н. Рудзевич (раздел 3.4 и 3.5), дбн СН. Щелкунов (раздел 3.6), кбн И.П. Гилева (раздел 3.6), кбн Г.В. Кочнева (раздел 3.6), М.А. Васильева (раздел 3.6), кбн Т.С Непомнящих (раздел 3.6), а также с некоторыми другими соавторами, ссылки на которых даны в тексте данной работы при описании конкретных результатов исследований. Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам за сотрудничество.
Искренне признателен за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту д.б.н., проф. Локтеву Валерию Борисовичу.
Выражаю глубокую благодарность за критические замечания и помощь при обсуждении и оформлении диссертационной работы моим коллегам д.х.н., проф. Малыгину Эрнст Георгиевичу и д.б.н. Татькову Сергею Ивановичу.
Объем и структура работы Диссертация изложена на 329 страницах, включающих 33 рисунка и 51 таблицу и список литературы (316 ссылок). Работа состоит из введения, трех глав (глава 1 - «Обзор данных литературы»; глава 2 — «Экспериментальная часть»; глава 3 - «Результаты и обсуждение исследований»), заключения, выводов, списка литературы и приложения.
Сыворотки и иммуноглобулины
Клеточные культуры Vero и RH (клетки почек эмбриона человека) были получены из музейной коллекции ГНЦ ВБ "Вектор" (Koltsovo, Russia). Клетки культивировали на минимальной среде Игла с 10% фетальной сыворотки и 80 ug/мл сульфата гентамицина.
Культуры клеток мышиной миеломы P3.NS.1/1-Ag4.1 (NS/1) и NS\0 были получены из Онкологического центра РАМН. Клетки культивировали на среде ДМЕМ, содержащей увеличенные количества аргинина до 200 мг/л, фолиевой кислоты до 12 мг/л, аспарагина до 36 мг/л, а также 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 20 мМ HEPES, среда DMEM(M) (ГНЦ ВБ «Вектор») или на среде ]ЩЕМ/\2 (ГНЦ ВБ "Вектор"), с добавлением 10% сыворотки плода коровы и 80 мкг/мл сульфата гентамицина.
Культуру крысиной миеломы 210RC-Y3-Ag 1.2.3 (Y-3) из коллекции Онкологического центра РАМН поддерживали на среде ДМЕМ(М) с 10% сыворотки плода коровы ("Flow", Англия) и 80-160 мкг/мл сульфата гентамицина.
Сыворотки и иммуноглобулины к филовирусам. В качестве референс-антисывороток против вируса Марбург использовали сыворотку инфицированных вирусом морских свинок (референс-АТ-ВМ), полученную из Белорусского НИИ ЭМ и сыворотку ранее переболевшего лихорадкой Марбург человека (ЧРС), инфицировавшегося при работе с вирусом [Никифоров В.В., и др., 1994]. Коммерческий препарат очищенных лошадиных иммуноглобулинов (Ig-лошадь-ВМ) "Иммуноглобулины против лихорадки Марбург..." был получен из ВЦ НИИМ МО РФ (г. Сергиев Посад). С целью получения иммунных сывороток (АС-ВМ), проводили иммунизацию инактивированным препаратом ВМ мышей BALB/c (виварий ГНЦ ВБ «Вектор»). Референссывороткой против вируса Эбола (референс-АТ-ВЭ) служила сыворотка инфицированных данным вирусом морских свинок, полученная из Белорусского НИИ ЭМ. Препарат очищенных лошадиных иммуноглобулинов (Ig-лошадь-ВЭ) "Иммуноглобулины против лихорадки Эбола" был получен из ВЦ НИИМ МО РФ (г. Сергиев Посад) [Борисевич В.Н., и др., 1996]. С целью получения противовирусных сывороток (АС-ВЭ) проводили иммунизацию инактивированным препаратом ВЭ мышей BALB/c (весом 18-20 г), крыс Lou (весом 180-200г) (виварий ГНЦ ВБ «Вектор»). Иммунные сыворотки морской свинки и кролика любезно предоставил доктор Чепурнов А.А. [Чепурнов А.А., и др,. 1994].
Иммунные сыворотки к ортопоксвирусам. Иммунизацию беспородных белых мышей вирусами ВОВ (штамм ЛИВП), ВОК (штамм GRI-90), проводили по схеме, представленной ранее [Razumov IA et al 1994]. Суммарная доза вводимого антигена составляла 50 мкг/мышь. Через две недели после последней инъекции препарата производили забор крови для последующего тестирования сыворотки в ИФА.
Иммунные сыворотки к вирусу Западного Нила. Поликлональные мышиные антитела против ВЗН получали путем 3-кратной, с интервалом в 2 недели, внутрибрюшинной иммунизации беспородных белых мышей 13 мкг/мышь очищенного ВЗН: первые две иммунизации проводили в смеси с полным адъювантом, а последнюю иммунизацию с неполным адъювантом Фрейнда.
В качестве положительного контроля при постановке реакции нейтрализации ортопоксвирусов использовали моноклональное антитело J2D5, любезно предоставленное Ichihashi Y [Ichihashi Y., Oie M., 1988]. Для идентификации белка 14 к Да ВЭ (ген 129L) были использованы МКА СЗ (тАЬСЗ) к белку 14 кДа (ген A27L) ВОВ, штамм WR, любезно предоставленные д-ром Эстебано [Dallo S et al 1987].
Рекомбинантные белки, полученные в результате экспрессии полноразмерных генов NP, VP35, GP и VP40 ВМ в прокариотической системе (E.coli) [А.В. Качко, и др., 2001; Сорокин А.В., и др., 1999], любезно предоставлены А.В. Качко и А. А. Сорокиным (отдел молекулярной вирусологии НИИ МБ, ГНЦ ВБ «Вектор»). Рекомбинантный белок VP35 ВЭ, полученный в результате экспрессии полноразмерного гена VP35 в системе E.coli [Казачинская Е.И., и др,. 2001], любезно предоставлен Терновым В.А. (отдел молекулярной вирусологии НИИ МБ, ГНЦ ВБ «Вектор»).
Рекомбинантный белок Е ВЗН и его фрагменты, полученные в результате экспрессии полноразмерного гена Е и его делеционных вариантов в системе E.coli [LA. Razumov, et al 2005], любезно предоставлены В.А. Терновым и А.В. Качко (отдел молекулярной вирусологии НИИ МБ, ГНЦ ВБ «Вектор»).
Рекомбинантные аналоги белков слияния вирусов эктромелии (ген 129L) и натуральной оспы (ген A30L) [И. А. Разумов и др., 2005] любезно предоставлены И.П. Гилевой (ГНЦ ВБ «Вектор», руководитель отдела Щелкунов С.Н).
Рекомбинантные одноцепочечные scFv 9Е2 и химерные Fc 9Е2 антитела [Pereboev A, et al 2008] (аналоги МКА 9Е2) любезно предоставлены А.В. Перебоевым (Division of Human Gene Therapy, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, USA и ГНЦ ВБ «Вектор», руководитель отдела В.Б. Локтев ).
Иммунизацию мышей (BALB/c) препаратами ВМ и ВЭ проводили в течение двух недель (таблица 2) в общей дозе для ВМ - 98 мкг/мышь и для ВЭ -120 мкг/мышь. На 14-е сутки селезенки иммунизированных животных использовали для получения лимфоцитов.
Особенности технологии получения гибридом - продуцентов МКА к возбудителям особо опасных инфекций и изучение свойств антител
Существуют определенные трудности в получении гибридом, продуцирующих МКА к возбудителям особо опасных инфекций (ООИ), к которым относится ВНО и филовирусы Марбург и Эбола используемые в данной работе. В первую очередь, это связано с опасностью работы с этими патогенами и с методическими проблемами получения значительных количеств очищенного агента ООИ. Во-вторых, с приготовлением и тестированием препаратов инактивированного патогена на сохранность антигенной структуры, то есть с определением антигенных свойств (активности взаимодействия в серологических тестах с сыворотками от иммунных и переболевших животных) и иммуногенных свойств (иммуногенности или способности индуцировать иммунный ответ при введении в организм).
Так как очень сложно и опасно осуществить технологию получения гибридом в условиях лабораторий 1 (Р-4) уровня защиты, то для создания гибридом, секретирующих МКА к возбудителям особо опасных инфекций, по-видимому, целесообразно иммунизацию животных, доноров-спленоцитов, проводить инактивированными препаратами вирусов. Вместе с тем, основной недостаток процессов инактивации инфекционных агентов заключается в сложности стандартизации этой процедуры, что вызывает необходимость проведения контроля (в условиях лабораторий 1 уровня защиты) каждой вновь приготовленной партии инактивированного препарата на инфекционность вирионов.
Процесс инактивации должен гарантированно устранять инфекционность возбудителя, и вместе с тем, не нарушать структуру его антигенных детерминант. Оптимальными, исходя из механизмов действия различных физических и химических факторов, следует считать методы инактивации (например, ультрафиолетовыми лучами или гамма-излучением), которые воздействуют непосредственно на геномную нуклеиновую кислоту возбудителя, не затрагивая структуру вириона. В тоже время, необходимо учитывать, что процедура инактивации в той или иной степени неизбежно воздействует на конформационную структуру вирусных белков. В связи с этим, проверка целостности и сохранности антигенной структуры вирусных белков в инактивированных препаратах, используемых в гибридомной технологии, также является, на наш взгляд, необходимым элементом контроля антигенов или иммуногенов, полученных в результате инактивации агентов
Исследование инактивированных различными способами препаратов филовирусов, ВМ и ВЭ, было необходимо для проверки сохранности их антигеной структуры и для прогнозирования спектра моноклональных антител, которые могут быть получены при использовании в гибридизации селезеночных лимфоцитов, от иммунизированных данными антигенами животных.
Были исследованы препараты вируса Марбург, обозначенные как ВМ-1, ВМ-2 и ВМ-3, полученные из сыворотки крови морских свинок [Букреев А.А., и др., 1995] и инактивированные тремя различными способами: 1 - кипячением в течение 2 минут в растворе, содержащем Р-меркаптоэтанол (до 5%) и додецилсульфатом натрия (до 1%); 2 - димером этиленимина (до 0,17%) с инкубацией при 8-10С в течение 24 ч и добавлением тритона Х-100 (до 0,5%); 3 - димером этиленимина (до 0,17% ) с инкубацией при 8-10С в течение 24 ч и дальнейшим прогреванием при 60 С в течение 1 ч, как описано [Mitchel SW, McCormickJB, 1984].
С этой целью был проведен анализ электрофоретического профиля белков вируса Марбург и сравнение с маркерными белками известной молекулярной массы ( Рис. 1) описанными ранее [Kiley MP, 1988]. Наблюдаемые отклонения в молекулярной массе белков от литературных данных, укладываются в ошибку метода ее определения [Остерман А.А., 1981]. Все структурные вирусные белки препарата ВМ-3, перенесенные на нитроцеллюлозную мембрану после электрофоретического разделения, выявлялись методом иммуноблота антителами сыворотки реконвалесцента (рисунок 2).
Для оценки целостности антигенной структуры белков ВМ после инактивации, был проведен твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА) полученных вирусных препаратов с использованием референс-сыворотки от реконвалесцента. Данная сыворотка содержит антитела, которые отражают иммунное распознавание антигенных детерминант ВМ в течение естественной инфекции человека. На рисунке ЗА представлены кривые титрования вирусного антигена, инактивированного тремя способами. Кривая титрования ВМ-3, построенная по значениям оптической плотности соответствующих разведений антигена, значительно отличается от кривых титрования ВМ-1 и ВМ-2 и показывает более высокий уровень образования специфических комплексов АГ+АТ. На Рис. ЗВ представлен график титрования сыворотки реконвалесцента в ТИФА на этих трех антигенах, использованных в одинаковой концентрации. Проведенный анализ взаимодействия антител данной сыворотки с препаратами ВМ показал, что наиболее полная сохранность антигенной структуры белков наблюдается при третьем варианте инактивации: димером этиленимина (до 0,17%) с инкубацией при 8-10С в течение 24 ч и последующим прогреванием при 60С в течение 1 ч.
Дальнейший антигенный анализ полученного препарата ВМ был проведен с использованием набора сывороток от иммунных и инфицированных животных в ТИФА (Таблица 3). Результаты специфического взаимодействия антител с ВМ показали высокую антигенную активность филовирусных белков с противовирусными антителами. Наиболее высокий титр антител 1/218700, был обнаружен в сыворотке лошади, иммунизированной инактивированным, а затем нативным вирусом.
Изучение белков филовирусов и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических поликлональных и моноклональных антител
Использование моноклональных антител для сравнительного изучения иммуногенных и антигенных свойств белка VP35 вируса Эбола и его рекомбинантного аналога. Белок VP35 ВЭ, вместе с белками NP, VP30 и L, входит в состав рибонуклеокапсидного комплекса, образуется на ранних стадиях репликации вируса и в качестве кофактора вирусной полимеразы L участвует в процессах транскрипции и репликации вируса подобно Р-белку рабдовирусов и парамиксовирусов [Peters, C.J et al., 1996; Sanchez, A., et al., 1993; Bukreyev A.A., et al., 1993; Feldman H., Kiley M.P. 1999]. Было показано, что белок VP35 ВЭ способен ингибировать действие интерферона I типа, то есть, возможно, является фактором вирулентности при данной инфекции [Basler C.F., et al., 2000]. На участие белка VP35 филовирусов в индукции иммунного ответа указывают работы по иммунизации лабораторных животных вирусными белками [Казачинская Е.И.„ и др. 2000; Чепурнов А.А., и др.,1994]. Имеется сообщение об иммуногенных свойствах белка VP35 вируса Марбург и его рекомбинантного аналога [Сорокин А.В., и др., 1999]. Исследование антигенной структуры VP35 вируса Эбола представлялось нам полезным для оценки роли белка в формировании иммунного ответа, для изучения возможности использования рекомбинантного VP35 в качестве антигена при создании диагностических тест-систем; а также с целью локализации антигенной структуры на аминокислотной последовательности данного белка.
Целью проведенных исследований явилось изучение антигенной структуры белка VP35 ВЭ (штамм Mayinga) его рекомбинантного аналога, полученного В.А. Терновым [Рудзевич Т.Н., и др., 2003] в результате экспрессии полноразмерного гена VP35 в прокариотической системе, путем использования набора сывороток специфичных к вирусу Эбола и моноклональных антител к VP35 ВЭ, описанных нами ранее [Казачинская Е.И., и др., 2000].
Для получения очищенного белка, необходимого для использования в иммунологических реакциях, рекомбинантный белок VP35 (рек.УР35) был выделен из клеточных лизатов методом аффинной хроматографии на сорбенте Ni-NTA в денатурирующих условиях. Анализ очищенных препаратов, проведенный с помощью электрофореза в 12 % ДСН-ПААГ, выявил наличие белка с молекулярным весом приблизительно 35 кДа (рис. 8), что соответствует расчетному молекулярному весу для рек.УР35. При этом белок рек.УР35 отсутствовал в лизате клеток, содержащих векторную плазмиду pQE31. Степень чистоты препарата рек.УР35, которую оценивали визуально по результатам электрофореза в ДСН-ПААГ, составила, как видно на рисунке 8, около 90 %. Концентрация VP35 в препарате, очищенном при денатурирующих условиях очистки, была приблизительно 5 мг/мл раствора. Общий выход рекомбинантного белка составил 30 мг из расчета на 1 л культуральной жидкости.
Определение иммуногенных свойств белка VP35 ВЭ и его рекомбинантного аналога. С целью определения иммуногенности природного и рекомбинантного белков VP35 ВЭ была проведена иммунизация мышей белком рек.\Т35 и инактивированным ВЭ. Сыворотки, полученные при иммунизации животных разными дозами антигена, исследовались на специфичность, динамику наработки антител в организме в разные сроки после иммунизации и перекрестную реактивность с рекомбинантным белком и белком VP35 вируса Эбола. Полученные результаты ТИФА, представленные в таблице 15, показывают, что в результате иммунизации животных очищенными антигенами, содержащими рек.\Ф35, у всех животных был получен специфический иммунный ответ на этот белок. Титры антител иммунных сывороток (антисыворотки 1, 2, 3 к белку рек.\Т35) при титровании с гомологичным антигеном, рек.\Т35, и гетерологичным, VP35 белком в составе антигена ВЭ, оказались относительно высокими, хотя и значительно отличались в зависимости от используемого в ИФА антигена. Данный факт можно объяснить различной концентрацией антигенов, иммобилизованных на планшете, так как концентрация используемого для сорбции ВЭ - 1 мкг/мл; концентрация очищенного рек. VP35 белка составила 2 мкг/мл. Высокие титры специфических антител к рекомбинантному VP35 белку в сыворотке животных были зафиксированы через месяц после первой иммунизации и возрастали далее без дополнительной дозы антигена в течение недели. Дополнительное введение 20 мкг антигена в каждое животное подопытной группы не вызвало дальнейшего повышения титра специфических антител. Анализ белок-специфичности сывороток, полученных против рекомбинантного VP35 белка, проведенный методом ИБ (рис. 9), подтвердил перекрестную реактивность антител иммунных сывороток мышей как с рекомбинантным белком, так и с белком VP35 вируса Эбола.
С целью сравнения антигенных свойств белка VP35 ВЭ со свойствами его рекомбинантного аналога, полученного в результате экспрессии полноразмерного гена VP35 в прокариотической системе, проводили оценку иммунологической реактивности антивирусных сывороток с рекомбинантным белком и ВЭ (таблица 16). Специфичность перекрестных реакций антиген-антитело, обнаруженных методом ТИФА при использовании рекомбинантного VP35, подтверждалась методом ИБ. Как показали результаты иммуноблота, представленные на рисунке 10, противовирусные антитела переболевшей морской свинки (Референс-АТ-ВЭ) и очищенные иммуноглобулины гипериммунизированной лошади, а так же антитела иммунных сывороток и гибридомные МКА к VP35 ВЭ взаимодействовали с рек.УР35 белком. Вместе с тем, необходимо отметить, что референс сыворотка морских свинок, которая не реагировала с белком VP35 ВЭ в иммуноблоте (таблица 12), взаимодействовала с рек.УР35 белком как в ИФА (таблица 16), так и в иммуноблоте (рис. 10). Итак, определение методом ТИФА взаимодействия сывороток к ВЭ, взятых от иммунизированных и инфицированных животных, выявило во всех исследуемых сыворотках высокий уровень противовирусных антител, реагирующих с рекомбинантным белком.
Похожие диссертации на Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека вирусов
