Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Вирус кори как возбудитель нейротропной инфекции 12
1.1 Корь, история и истоки заболевания 12
1.2 Структурная организация частицы вируса кори и жизненный цикл 13
1.3 Клеточные рецепторы вируса кори и пути заражения 19
1.4 Вирусная персистенция в ЦНС и ассоциированные заболевания 22
1.5 Заболевания ЦНС, ассоциированные с персистенцией ВК 25
1.6 Особенности заболевания подострого склерозирующего панэнцефалита (ПСПЭ) 27
Глава 2. Модельная система заболевания ПСПЭ 30
2.1 Трансгенные HCE-CD46+ мыпш являются восприимчивыми к заражению ВК 30
2.2 Заражение вирусом кори ЦНС in vivo и in vitro не приводит к гибели нейронов 33
2.3 Отсутствие классического распространения ВК между нейронами, вирусные титры в культуре, проблемы почкования и формирования синцития 35
2.4 Распространение ВК между нейронами происходит через синапс и является С046-независимым 37
Глава 3. Ингибиторы слияния ВК с клетками 39
3.1 Механизмы слияния вирусов использующих гликопротеин - белок слияния 39
3.2 Особенности процесса слияния ВК с клеткой 42
3.3 Слияние-ингибирующий пептид (СИП), воздействие на различные вирусы и предполагаемый механизм действия 44
3.4 Представители семейства нейротахикининовых пептидов (НТП): субстанция П, нейрокинин-А, нейрокинин-Б ингибируют распространение ВК в нейронах 46
Глава 4. Рецепторы нейротахикининовых пептидов (НТП) 49
Строение, экспрессия, сигнальная трансдукция и физиологические функции рецепторов семейства нейротахикининовых пептидов: НК-1, НК-2 и НК-3 49
Обсуждение результатов 95
Выводы 112
Список литературы 114
- Структурная организация частицы вируса кори и жизненный цикл
- Заражение вирусом кори ЦНС in vivo и in vitro не приводит к гибели нейронов
- Особенности процесса слияния ВК с клеткой
- Строение, экспрессия, сигнальная трансдукция и физиологические функции рецепторов семейства нейротахикининовых пептидов: НК-1, НК-2 и НК-3
Введение к работе
Несмотря на существование вакцины, вирус кори (ВК) входит в первую десятку наиболее опасных инфекций и приводит к смерти около 1 миллиона человек ежегодно во всём мире в результате иммуносупрессии и по причине постинфекционных осложнений центральной нервной системы (ЦНС). Из всех случаев заболеваний корью за год, примерно у одного из десяти тысяч пациентов развиваются осложнения в виде заболеваний мозга (обзор Rail GF., 2003, Takasu 2003). Наиболее хорошо изученным из таких осложнений ЦНС является подострый склерозирующий панэнцефалит (ПСПЭ): медленнотекущее, прогрессирующее заболевание, которое может проявиться спустя месяцы или даже годы после завершения острой коревой инфекции. Оно характеризуется прогрессирующей деменцией с последующими моторными нарушениями и всегда приводит к смерти больного (Manchester М. and Rail GF. 2001* Schneider-Schaulies S, ter Meulen V. 1999). ПСПЭ обладает рядом особенностей, не характерных для продуктивной инфекции ВК, в мозге отсутствуют зрелые вирусные частицы, но присутствует большое количество нуклеокапсидов ВК и противовирусных антител. Инфекция не вызывает гибели нейронов, тем не менее заболевание смертельно для больного (Anlar В, 2001). Все эти особенности указывают на то, что механизм патогенеза коревой инфекции в ЦНС отличается от инфекционного процесса в других тканях организма, и причиной смерти от ПСПЭ является, скорее, нарушение функции нервных клеток, а не их гибель. Исходя из этого, изучение особенностей патогенеза коревой вирусной инфекции в ЦНС является важной задачей биомедицины и может облегчить понимание многих других персистирующих заболеваний мозга, вызываемых нейротропными вирусами.
Первичный контакт ВК и клетки-мишени осуществляется за счёт взаимодействия гликопротеина оболочки вируса - геммаглютинина (ГА) с одним из двух своих клеточных рецепторов CD46 или SLAM, после чего другой
вирусный гликопротеин - белок слияния (БС) претерпевает конформационные изменения, инициирующие слияние мембраны вируса и клеточной мембраны. Так происходит проникновение вирусного капсида в клетку. Наряду с этим, распространение ВК происходит при слиянии заражённых клеток с незаражёнными клетками, при этом образуется характерный для коревой инфекции многоядерный синцитий. Образование синцития происходит за счёт взаимодействия вирусных гликопротеинов, экспрессированных на поверхности заражённых клеток с рецепторами на незаражённых клетках (Lawrence DM, 2000). Вирус кори способен заражать лишь клетки человека, содержащие поверхностные белки CD46 и SLAM, исполняющие роль рецепторов к этому вирусу. Так как молекулы CD46 и SLAM есть лишь у клеток приматов и отсутствуют у других животных, то, до недавнего времени, только приматы могли быть использованы как экспериментальные животные для изучения-патогенеза ВК в ЦНС, включая редкое смертельное заболевание ЦНС - ПСПЭ (Dhiman N, 2004). Отсутствие достаточно дешёвых доступных животных моделей существенно затрудняло исследование заболеваний ЦНС, индуцируемых корью. Изучение механизмов патогенного действия ВК в тканях мозга стало возможным благодаря созданию трансгенных животных моделей! Поскольку в природе мыши не являются восприимчивыми к заражению ВК, то для изучения патогенеза ПСПЭ in vivo в 1997 году создали и охарактеризовали первую трансгенную мышиную модель вирусной инфекции клеток нервной системы. Мыши линии HCE-CD46+ экспрессируют молекулы CD46 человека, являющиеся рецепторами к ВК под контролем специфического для нейронов промотора — нейрон-специфической енолазы (НСЕ). Таким образом, только мозг HCE-CD46+ трансгенных мышей является восприимчивым к заражению ВК, поскольку рецептор CD46 экспрессируется исключительно в нейронах ЦНС (Rail GF, et al, 1997). Эксперименты in vitro показали, что в заражённой первичной культуре нейронов гиппокампа мышей линии HCE-CD46+
отсутствуют зрелые вирусные частицы в среде, тогда как нуклеокапсиды ВК интенсивно распространяются между клетками. При этом нейроны не погибают, и монослой клеток сохраняет свою структуру при любых вирусных титрах и плотности посева клеток. Также было показано, что рецептор CD46 необходим лишь для первичного проникновения ВК в нейроны, тогда как дальнейшее распространение вируса происходит через синапс и не зависит от наличия рецепторов CD46 или SLAM (Lawrence DM, 2000). Таким образом, распространение вируса между нейронами протекает по особому механизму, отличному от пути его изначального проникновения в клетку.
Межнейрональное распространение ВК в отсутствие рецептора CD46 или SLAM может происходить за счёт взаимодействия гликопротеинов оболочки вируса с дополнительными поверхностными молекулами клетки, ещё не идентифицированными в качестве рецепторов к ВК (Hashimoto К et al, 2002* Manchester М et al, 2002). Также не исключено, что эти рецепторы могут связываться с поверхностным гликопротеином ВК, отличным от ГА, например с БС (Takeuchi К et al, 2002). Считают, что процесс слияния частицы ВК с мембраной клетки требует затраты энергии, источниками которой могут являться конформационные изменения ГА, повышение температуры, или взаимодействие БС со своим собственным рецептором на клетке (Dutch RE, et al 2001; Paterson RG, et al 2000). Данные о транссинаптической и CD46-независимой передаче ВК между нейронами, указывают на то, что взаимодействие ГА с его рецептором в области синапса не требуется (Lawrence DM, 2000). Это привело нас к постановке ряда задач по исследованию роли второго гликопротеина вируса кори - БС в нейротрансмиссии.
Впервые на фибробластах было показано, что синтетические пептиды, с последовательностью аминокислотных остатков Phe-X-Gly, сходной с последовательностью остатков аминокислот области N-конца БС парамиксовирусов, препятствуют как проникновению ВК в клетку, так и
вирусиндуцированному слиянию и гемолизу клеток. Синтетический трипептид Phe-X-Gly назвали слияние-ингибирующим пептидом (СИП). По результатам этих работ предположили, что СИП взаимодействует с предполагаемыми рецепторами на клеточной мембране, и подавление заражения осуществляется за счёт конкуренции с БС за эти рецепторы (Richardson CD and Choppin PW, 1983).
Представители семейства нейротахикининовых пептидов (НТП) субстанция П (СП), нейрокинин-А (НК-А) и нейрокинин-Б (НК-Б) в активном центре также имеют аминокислотную последовательность Phe-X-Gly, присутствующую в пептидах СИП и на N-конце белка слияния ВК. В экспериментах проведённых на фибробластах, впервые было показано, что СП обратимо подавляет инфекцию ВК в клеточной культуре, однако механизм этого феномена был невыяснен. Объясняя механизм такой антивирусной активности основывались том, что последовательность трёх аминокислотных остатков активного центра субстанции П является гомологичной последовательности остатков аминокислот синтетического трипептида СИП и N-конца белка слияния ВК. В силу того, что СП является природным нейропептидом, предположили, что молекулой, за связывание с которой идёт конкуренция между синтетическим СИП, нейропептидом СП и белком слияния ВК является рецептор нейрокинин -1 (НК-1) (Schroeder С, 1986).
Цель и задачи работы. Целью данной работы является изучение роли молекулы НК-1 в процессе транссинаптической передачи ВК между нейронами ЦНС. Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи:
- установить, является ли способность к CD46 независимому
распространению ВК уникальным свойством нейронов;
- подтвердить наличие экспрессии и изучить локализацию белка слияния
вируса кори в нейронах;
- установить, происходит ли слияние мембран нейронов по типу синцития
в синапсах при заражении вирусом кори
- определить влияние слияние-ингибирующего пептида и НТП на
распространиение ВК в нейронах in vitro
провести сравнительный анализ заражения ВК мышей линии CD46+ и мышей линии CD46+/HK-lKO, полученных путём скрещивания мышей нокаутных по рецептору НК-1 с мышами, трансгенными по рецептору CD46;
провести сравнительный анализ заражения ВК первичных нейронов полученных от мышей линии CD46+/HK-lKO и контрольных нейронов, полученных от мышей линии CD46+;
- провести сравнительный анализ заражения ВК иммунодефицитных
мышей линии CD46+/RAG КО в присутствии и в отсутствие синтетического
антагониста НК-1 рецептора - апрепитант (Emend ).
Структурная организация частицы вируса кори и жизненный цикл
В 1911 году в работах Anderson и Goldberger было показано, что возбудителем коревой инфекции является вирус, позднее вирус кори был выделен учеными Enders J.F. и Peebles Т.С. в 1954 г. из крови David Edmonston, больного вирусом кори в острой фазе (Enders J.F. et al, 1954). Вирус кори - это оболочечный вирус, геном которого представлен негативной одноцепочной РНК. ВК относится к роду Morbillivirus семейства Paramyxoviridae (Kingsbury. D.W. et al. 1978.) В род Morbillivirus входят также вирус чумы плотоядных, вирусы чумы крупного и мелкого рогатого скота, вирус чумы грызунов, вирус чумы тюленей, вирус чумы китовых, морбилливирус белых и полосатых дельфинов и морбилливирус лошадей. Примеры представителей семейства Парамиксовирусов представлены в Таблице 1.
Парамиксовирусы характеризуются низкой частотой генетической рекомбинации и низкой скоростью эволюции. Частота мутаций при репликации вируса составляет 9 10"5 на одно основание за 1 цикл репликации (Schrag SJ, et al, 1999). При хранении, в высушенном состоянии при температуре -20С ВК не теряет активности в течение года. При температуре +37С время его полужизни 2 ч, при +56С вирус гибнет в течение 30 мин а при +60С он погибает мгновенно. Вирусные частицы инактивируются раствором формалина в разведении 1:4000, чувствителены к эфиру и кислой среде (рН ниже 4,5). Частицы вируса кори имеют округлую форму, с диаметром частицы от 150 до 350 нм. Вирус обладает гемагглютинирующей и гемолизирующей активностью. ВК гемолизирует и агглютинирует эритроциты обезьян, но, в отличие от других парамиксовирусов, не вызывает агглютинацию эритроцитов кур, морских свинок, мышей (Агафонов А.П., Нетёсов СП.).
Люди являются единственным естественным резервуаром для ВК. Человекообразные приматы могут быть заражены ВК в лабораторных условиях, и при этом у них развиваются симптомы заболевания сходные с таковыми у людей. Тем не менее, популяции диких приматов, численно являются недостаточными для поддержания трансмиссии ВК. Для поддержания ВК в популяции, количество людей в населенных пунктах должно быть не меньше нескольких сотен тысяч человек, с уровнем рождаемости около 5-10 тысяч детей в год (Moss WJ and Griffin DE, 2006).
Геном вируса кори (Рис. 1) состоит из шестнадцати тысяч нуклеотидов и представляет собой однонитевую несегментированную (-) цепь РНК длиной 1 мкм и диаметром 18-21 нм. Геномная РНК вируса кори содержит 6 транскрипционных единиц разделённых короткими нетранскрибируемыми последовательностями, состоящими из 3 нуклеотидов каждая. В геномной РНК вируса кори 3 лидерная последовательность предшествует шести транскрибционным единицам, а 5 хвостовая последовательность замыкает их ряд. С транскрипционной единицы гена белка фосфопротеина со сдвигом рамки считывания транскрибируются, по меньшей мере, два идентифицированных неструктурных белка С и V. (Griffin DE, 1996, "Fields Virology"). Фермент РНК-зависимая РНК полимераза связывается с участком в области первых 100 нуклеотидов генома ВК расположенных на 3 конце. Терминация транскрипции происходит при распознавании трёхнуклеотидной нетранскрибируемой последовательности в конце гена.
Вирусная частица состоит из белковых молекул восьми типов (см. рисунок 2), которые можно разделить на две основные группы - белки вирусной оболочки и внутренние белки. Гликопротеины ГА и БС локализованны на поверхности вирусной оболочки, и обуславливают прикрепление и проникновение ВК в чувствительные клетки. Размножение вируса в клетках сопровождается экспозицией синтезированных вирусных белков ГА и БС на поверхности заражённых клеток (Rail G.F., 2003, Review). Молекула ГА является димером, построенным из идентичных субъединиц, связанных дисульфидными мостиками, ГА - вирусный трансмембранный гликопротеин (белок II типа), который связывается с клеточным рецептором к вирусу кори — CD46. Белок слияния является гликозилированным трансмембранным белком I типа, и в комплексе с ГА обеспечивает слияние клеточной и вирусной мембран, что в свою очередь обуславливает проникновение вирусного нуклеокапсида в клетку. БС обладает гемолитической активностью (Lamb RA. et al., 2001, Fields Virology). При протеолитическом расщеплении неактивного предшественника БСо (60 кДа), образуется активный БС-ВК, состоящий из двух субъединиц БСі (41 кДа) и БСг (18 кДа), которые остаются ковалентно связанными между собой единственным дисульфидным мостиком (Griffin DE, 1996, Fields Virology).
Заражение вирусом кори ЦНС in vivo и in vitro не приводит к гибели нейронов
Как описывали выше, нервные клетки мозга после окончательной дифференцировки продолжают своё развитие, и взаимодействуя с дугими нейронами формирут высокоорганизованные регуляторные сети. Восстановление повреждённых нейронов мозга затруднено или невозможно, тогда как в большинстве органов, потеря клеток может компенсироваться тканевой регенерацией. Вирусная инфекция или противовирусный цитолитический иммунный ответ, могут привести к гибели нейронов, что может иметь критическое значение для человека (Rail G.F.,1998, review). На сегодняшний день известно, что нейроны обладают рядом механизмов предотвращающих их гибель, при вирусной инфекции или противовирусным иммунным ответом. Нервные клетки осуществляют эту защиту при помощи рестрикции иммунного ответа, а также перестраивая жизненный цикл высоко цитолитических вирусов (Parra, et al. 1999; Binder and Griffin 2001; Patterson, et al. 2002). Способность нервных клеток подавлять вирулентность патогенов, не изучена до конца. Использование HCE-CD46+ трансгенных мышей, позволило изучать поведение ВК in vivo в мозге животных, а также проводить эксперименты in vitro, выделяя первичные С046+нейроны из ЦНС мышей этой линии.
Поскольку ВК является высокоцитопатогенным вирусом, изучая основы заболевания и причины гибели, взрослых HCE-CD46+/RAGKO животных заражённых ВК, проверили наличие гибели нервных клеток в зонах максимального заражения в ЦНС. К большому удивлению, в областях мозга содержащих большое количество вирусных антигенов, окрашивая срезы мозга по TUNNEL и Annexin V, признаков апоптоза нейронов не обнаруживали. Более того, спустя 48 часов после заражения ВК культуры первичных CD46+ нейронов, выделенных из мозга трансгенных мышей процент инфицированных клеток приближается к 50%, при том, что цитопатогенный эффект вируса отсутствует (Lawrence, et al. 2000).
При заражении иммунокомпетентных мышей линии HCE-CD46+, разрешение от вирусной инфекции in vivo, также происходило без гибели нейронов, несмотря на присутствие большого числа CD4 и CD8 лимфоцитов (Patterson СЕ, et al, 2002). Есть указания, что процессы распространения и отпочковывания ВК в ЦНС, изменены в заражённых нейронах для предотвращения цитолитического исхода. Действительно, CD46+ нейроны, выделенные от трансгенных мышей, продуцируют в 1000 раз меньше вирусных БОЕ/мл при заражении, по сравнению с фибробластами Vero, и в 100 раз меньше по сравнению с клетками аденокарциномы человека линии Hela. Такую же редукцию выброса вирусных частиц наблюдали в клеточной линии дифференцированных нейронов человека NT2. При этом показали, что вирусная продукция не зависит от возможности клеток делиться, так как при добавлении митотических ингибиторов к культурам клеток Vero и Hela, соотношение числа продуцируемых вирусных частиц между описанными выше клеточными типами оставалось прежним (Lawrence DM et al, 2000). Так как отличительной особенностью заболевания ПСПЭ, является отсутствие зрелых вирусных частиц в образцах биопсии мозга (Schneider-Schaulies, et al. 1999), вопрос о том, связано ли, одной и той же причиной отсутствие свободных вирусных частиц при ПСПЭ и в нашей модельной системе, пока остаётся нерешённым. Известно, что вирус кори, ассоциирующийся с ПСПЭ, генетически отличается от вируса, вызывающего острую инфекцию в периферических системах органов (Ayata М, 1989; Baczko К, 1986; Cattaneo R, 1989; Schneider-Schaulies J, 1996; Wong ТС, 1989). Репликация вируса при ПСПЭ протекает с мутациями, так как нуклеотидная последовательность генома ВК, выделенного из мозга больных содержит множество точечных мутаций в генах кодирующих белки вирусной оболочки, а именно в генах кодирующих ГА, БС и МБ (Baczko К, 1986; Cattaneo R and ter Meulen V, 1986). Например, при ПСПЭ всегда регистрируются дефекты белка МБ, которые возможно влияют на поддержание вирусного распространения в ЦНС, и возможно, что выключение функции МБ даже необходимо для установления вирусной персистенции. Причиной отсутствия зрелых вирусных частиц in vitro и in vivo в нашей модельной системе, может являться блокада способности вируса отпочковываться, что было подтверждено при электронно-микроскопическом исследовании. На рисунке 7, видно, что незрелые почки, представляющие собой вирусные нуклеокапсиды, выступают по всей поверхности клеточной мембраны нейронов, тогда как в фибробластах Vero вирус кори отпочковывается очень активно. Эти данные согласуются с результатами, полученными при титровании ВК в среде взятой от заражённых культур нейронов и фибробластов Vero - в культуре нервных клеток зрелые вирусные частицы отсутствуют (Lawrence DM, 2000).
Несмотря на отсутствие внеклеточных вирусных потомков, иммуноцитохимические исследования заражённых нейронов показали, что распространение ВК происходит очень эффективно, например к 2-му дню после заражения, количество нервных клеток содержащих антигены ВК приближается к 50 процентам. В культурах нейронов, инфекция локализована в виде кластеров соседствующих между собой заражённых нейронов, контактирующих между собой через аксоны и дендриты. В противоположность Vero клеткам, ни в культурах первичных нейронов, ни в заражённых нейронах линии NT2, при исследовании с помощью световой микроскопии, не было видно образование синцития в том виде, в котором он формируется в Vero фибробластах, даже при высокой плотности посева и высоких титрах ВК (Lawrence DM, 2000). При этом не исключали возможность, что формирование синцития, возможно, протекает по отличному механизму, и может существовать лишь на участках ограниченных синапсами.
Поскольку при заболевании ПСПЭ, несмотря на обилие антигена ВК в мозге больных, зрелые внеклеточные вирусные частицы из гомогената мозга не были обнаружены (Lawrence DM, 2000) и выделение частиц оказалось возможным только при совместной культивации чуствительных фибробластов с нейронами ПСПЭ эксплантированых из тканей мозга пациентов (Choppin PW, 1980; Payne FE, 1969). Предположили, что в микроокружении ЦНС, ВК действительно адаптируется к совершенно новому, нестандартному пути распространения между нервными клетками - без необходимости отпочковываться и формировать синцитий. (Patterson, et al. 2002).
Если частицы ВК не отпочковываются от мембраны нейронов, как же вирус распространяется в культуре нейронов и по ЦНС? При иммуноцитохимическом анализе было выявлено, что в заражённой культуре антигены ВК присутствуют в нейронах соседствующих между собой, образуя кластеры инфекции. Более длительная инкубация культуры нейронов после заражения приводит к образованию более крупных кластеров. То есть распространение вируса может происходить только в соседние клетки через клеточный контакт, так как зрелые вирусные частицы отсутствуют в среде.
Особенности процесса слияния ВК с клеткой
Тогда как детальный механизм слияния мембраны ВК с мембраной клетки не исследован, считается, что связывание ГА с клеточным рецептором является ключевым событием, запускающим изменение конформации БС, во время которой, замаскированный до этого, гидрофобный домен слияния открывается, и мембрана вируса сливается с клеточной мембраной (Lamb, 1993). Таким образом, механизм определения специфичной клетки-мишени контролируется взаимодействием белка ГА и клеточного рецептора. Исследования структуры взаимодействующих доменов ГА и БС, показали, что ГА является необходимым для слияния, и продемонстрировали необходимость гомотопических ГА и БС гликопротеинов для оптимального заражения (Morrison Т, et al. 1991; Moscona А and Peluso RW, 1991). Несмотря на это, была предложена альтернативная гипотеза, что слияние может происходить также в отсутствие ГА, например, БС белок вируса обезьян SV5 (семейства парамиксовирусов) опосредует слияние мембран вируса и клетки в отсутствие ГА (Horvath CM, et al. 1992; Bagai S and Lamb R, 1995). Более того, рецептор-независимое слияние также было идентифицировано у вируса мышиного гепатита (Gallagher ТМ, et al. 1992). Возможно, ли функционирование белка слияния ВК в области синапса независимо от ГА - является основным вопросом, исследуемым в этой работе. Если ВК-БС связывается со своим собственным рецептором, то, что это за рецептор?
Ранее появились предпосылки, что молекула, являющаяся рецептором СП, также может являться рецептором и для ВК. Было продемонстрировано, что синтетический олигопептид -Phe-Phe-Gly- с последовательностью аминокислотных остатков сходной с последовательностью аминокислотных остатоков N-конца БС-ВК, ингибирует размножение и распространение ВК в фибробластах (Richardson CD, et al, 1980). Это вещество назвали слияние-ингибирующим пептидом (СИП). Интересно, что последовательность аминокислотных остатков N-конеца БС-ВК, также является гомологичной активному центру нейропептида - субстанции П (СП). И было показано, что, как и добавление синтетического олигопептида СИП (Richardson CD and Choppin PW., 1983), добавление в заражённую культуру субстанции П, обратимо подавляет инфекцию ВК в клеточной культуре, однако механизм этого феномена был невыяснен (Schroeder С, 1986). В дальнейших работах показали, что ВК и СП специфически взаимодействуют с 52-58 кДа белковым комплексом на IM-9 лимфобластах человека, включающим в себя рецептор СП. Более того, ВК и субстанция П связавшись с поверхностью клетки способны взаимно вытеснять друг друга с рецепторных участков, и антитела к СП способны ингибировать распространение ВК между клетками. Объясняя механизм антивирусной активности в своих работах, Шредер основывался том, что последовательность аминокислотных остатков активного центра субстанции П является гомологичной аминокислотной последовательности синтетического СИП и белка слияния ВК. В силу того, что СП является природным нейропептидом, предположили, что молекулой, за связывание с которой идёт конкуренция между синтетическим СИП, нейропептидом СП и белком слияния ВК-является рецептор НК-1 (Schroeder С, 1986, Harrowe and Payan, 1990).
Заражение вирусом кори HCE-CD46 мышей или выделенных из их мозга первичных культур нейронов не приводит к гибели нейронов или формированию синцития - двух характерных событий при заражении ВК любых других клеток не нейронального происхождения (Lawrence DM, et al, 2000).
Предварительно было показано, что ВК локализован в области синаптическимх соединений и его распространение в культурах нейронов через клеточный контакт, не зависимо от присутствия рецепторов CD46 или SLAM (Lawrence DM, et al, 2000).
Ранее было показано, что синтетический трипептид СИП (-Phe-Phe-Gly), блокирует проникновение некоторых вирусов в клетки, и особенно эффективен в отношении ВК (Norrby, Е, et al, 1971). В лаборатории Чопина, показали, что синтетические пептиды, с последовательностью аминокислотных остатков, сходной с последовательностью аминокислотных остатков области N-конца БС полипептида парамиксовирусов, способны ингибировать функцию БС, обеспечивающую слияние мембран, и таким образом препятствуют как проникновению ВК в клетку, так и вирусиндуцированному слиянию и гемолизу клеток. Обработка клеток при 4С радиоактивно меченными синтетическими ингибиторами показала, что эти ингибиторы связываются с клеткой, а не с вирусными частицами, так как обработка пептидами вирусных частиц не вызывала ингибирования. По результатам этих работ предположили, что СИП взаимодействует с предполагаемыми рецепторами на клеточной мембране и подавление заражения осуществляется за счёт конкуренции с БС за эти рецепторы (Richardson CD and Choppin PW, 1983).
Нейротахикининовые пептиды (НТП) представляют собой одно из самых больших семейств нейропептидов у Metazoa, и представлены у большинства животных начиная от беспозвоночных и заканчивая млекопитающими. Нейротахикинины и их рецепторы являются высококонсервативными в течение эволюции и представлены у большинства видов Bilateria. Такой уровень консервативности в течение миллионов лет, говорит о необычайно важной функции, которая на сегодняшний день, исследована только частично (Pennefather JN, 2004, review).
Нейропептид СП наиболее широко представлен среди других нейрокининов в ЦНС и обладает различными функциями. СП синтезируется в нейронах и транспортируется к синаптическим пузырькам. Выброс СП происходит по кальций-зависимому механизму и обладает деполяризующим воздействием на клетки (Malek-Ahmadi, 1992). Высвобождение СП происходит из чувствительных нейронов кожи в ответ на повреждение, аксонные рефлексы и антидромную стимуляцию (Lembeck and Gamse, 1982). СП играет роль в воспалении (Рауап, 1989). СП участвует в воспалительном ответе вызванным респираторно синцитиальным вирусом, такое воспаление можно блокировать введением антител против СП (Tripp et al., 2003). СП может расширять сосуды, и, вызывая экссудацию плазмы, приводить к отёку (Nieber et al., 1992). СП как и некоторые другие нейропептиды являются модуляторами реакций гипречувствительности, стимулируя высвобождение гистамина из тучных клеток (Matsuda et al., 1989). В ЦНС, функция СП ассоциируется с регуляцией болезней настроения, беспокойства, стресса, адаптации, нейрогенеза, дыхательного ритма, нейротоксичности, тошноты/рвоты и боли. Субстанция П также является потенциальным сосудорасширителем, действуя через высвобождение оксида азота в эндотелии, что приводит к понижению давления. Рвотный центр в стволе мозга содержит СП и её рецептор в высоких концентрациях, наряду с такими нейротрансмиттерами, как холин, гистамин, допамин, серотонин и опиоидные пептиды. Их активация стимулирует рвотный рефлекс через различные пути, при этом, СП вовлечена в конечный этап регулирования рвотного рефлекса (Hornby PJ, 2001). Синтетический антагонист рецептора субстанции П НК-1 - апрепитант недавно был представлен на рынке лекарственной продукции, компанией Merck Pharmaceuticals, в качестве противорвотного средства, нашедшего применение в курсе химиотерапии. Субстанция П вовлечена в передачу болевых импульсов от периферических рецепторов нервной системы. Предполагают, что СП влияет на возникновение фибромиалгии. Хроническое воспаление и хроническая боль ассоциируются со многими заболеваниями, и было предложено, что СП высвобождаемая из первичных афферентных нервных окончаний играет роль в их возникновении (OMIM database).
Строение, экспрессия, сигнальная трансдукция и физиологические функции рецепторов семейства нейротахикининовых пептидов: НК-1, НК-2 и НК-3
Представители семейства НТП характеризуются наличием мотива состоящего их аминокислотных остатков -Phe-X-Gly-, где X может быть представлен ароматической или алифатической аминокислотой (Lecci А, 2003, review).
Начиная с 1980 года фармакологи стали интенсивно изучать тахикинины млекопитающих и беспозвоночных, а также их селективные агонисты и антагонисты. Реголли предположил, что существует три тахикининовых рецептора (ТР), которые он обозначил — НК-1, НК-2 и НК-3 (Regoli D, 1987). Между 1980 и началом 1990 годов, его гипотезу подтвердили, так как были клонированы гены рецепторов НК-1, -2 и -3 различных видов млекопитающих учёными лаборатории Nakanishi и другими независимыми группами (Masu Y, 1987, Yokota Y, 1989, Ingi T, 1991). В течение следующих десяти лет, синтез мощных селективных пептидных и непептидных антагонистов ТР позволил значительно расширить представления о роли, которую играют ТР при физиологических и патологических условиях. На сегодняшний день, тахикинины являются наиболее изучаемыми пептидами, фундаментальные и прикладные исследования в данной области до сих пор являются важной задачей, поскольку тахикинины и их рецепторы регулируют огромное число функций, как в ЦНС, так и на периферии организма (Lecci А, 2003, review).
Все три ТР представляют собой семейство гомологичных рецепторов, принадлежащих суперсемейству родопсино-подобных рецепторов ассоциированных с G-белком. Это суперсемейство включает в себя большое количество мембранных рецепторов, содержащих структурный мотив - группу из семи трансмембранных доменов с тремя внеклеточными петлями и тремя внутриклеточными петлями. У родопсиноподобных рецепторв NH2 группа расположена на дистальном внеклеточном конце, и карбоксильный конец обращен в цитоплазму (Regoli D, et al, 1994; Krause JE, et al, 1994; Maggi С A, 1995). Смотри рисунок 9. VII - трансмембранные домены, участки Еь Ег и Е3 - внеклеточные петли, участки Сі, Сг и Сз - внутриклеточные петли. Области рецептора, кодируемые экзонами 1, 3, 5 обозначены серым цветом, области экзонов 2 и 4 показаны белым цветом. Такое расположение экзонов является аналогичным для НК-1 и НК-3 рецепторов. (Pennefather JN, 2004)
Тахикининовые рецепторы НК-1 и НК-2 человека являются белками, состоящими из 407 и 398 аминокислот соответственно, рецептор НК-3 содержит 465 аминокислотных остатков, и является самым длинным из трёх рецепторов, будучи "растянутым", в области NH2 конца. Гены, кодирующие три ТР млекопитающих, имеют сходную структуру организации и содержат 5 экзонов, прерываемых нитронами в идентичных позициях, которые кодируют нуклеотидную последовательность белка (Hershey AD, et al, 1991; Gerard NP, et al, 1993; Krause JE, 1994). В целом, семейство ТР одно из немногих, среди суперсемейства рецепторов ассоциированных с G-белком, сохранивших интроны. Тогда как большинство человеческих генов содержат интроны, во всех генах рецепторов ассоциированных с G-белками они составляют менее 10% (Minneman КР, 2001). Считают, что сплайсинг экзонов в генах ТР млекопитающих может предоставлять выбор различных структурн-функциональных единиц для синтезируемого белка (Hershey AD, et al., 1991).
Для каждого НТП соответствует свой рецептор, для СП рецептором является НК-1, НК-А связывается с НК-2, а для НК-Б соответствует молекула НК-3. Различия в последовательностях аминокислотных остатков в активных центрах неиропептидов семейства НТП определяет афинность к соответствующему рецептору. Смотри таблицу 2 (McLean S, 2005).
Смысл такой дупликации может обеспечить не только основу для эволюции и приобретения новых функций, но и что более важно для организма, стабильное закрепление функции. Иначе говоря, основным назначением такой избыточности функции может служить замещение работы определённого потерянного гена. Этим можно объяснить результаты, полученные с некоторыми нокаутными мышами, например, нормально протекающие роды у мышей с удалённым геном окситоцина, (Nishimori et al., 1996); или даже неубедительные результаты, полученные с определёнными антагонистами тахикининов в обзоре (Lecci and Maggi, 2003), используемыми для лечения болезней человека. Система тахикининов и ТР представляет собой типичный пример дупликации (Maggi СА, 2000). Во-первых, все тахикинины могут действовать как полные агонисты для всех трёх известных рецепторов (Maggi and Schwartz, 1997; Bellucci et al., 2002). Во-вторых, отличия профиля экспрессии в различных тканях у различных видов (Lecci and Maggi, 2001; Pennefather et al., 1993; Candenas et al., 2001; Patak et al., 2002, 2003), лишь подтверждают функциональное сходство рецепторов.
НК-1 рецептор широко представлен как в ЦНС, так и на периферии, и присутствует на нейронах, эндотелиальных клетках сосудов, мышцах и различных типах иммунных клеток (Stewart-Lee and Burnstock, 1989; Tsuchida et al., 1990; Ho et al., 1997; Lai et al., 1998; Patacchini and Maggi, 2001). На всех этих клетках рецептор экспрессируется конституитивно, а в клетках костного мозга может быть индуцибельным (Bandari et al., 2002). В ЦНС, рецептор НК-1 преимущественно расположен в полосатом теле, ольфакторной луковице, зубчатом теле, locus coeruleus и спинном мозге (Watson S and Arkinstall S, 1994). Рецептор НК-1 присутствует не на всех нервных клетках ЦНС (Mantyh PW, 2002), при этом, он был обнаружен хотя бы в небольшом количестве во многих центральных структурах мозга. На нейронах, рецептор НК-1 представлен на их поверхности, но основная доля НК рецепторов нервных клеток сконцентрирована в области синапсов (Bozic, CR and Lu В, et al,1996).
Рецептор HK-2 обнаружен в основном на периферии организма, и его экспрессия в ЦНС была показана только в мозговых ядрах (Naline et al., 1989; Tsuchida et al., 1990; Pennefather et al., 1993; Croci et al., 1998; Saffroy et al., 2001, 2003). При этом, наличие рецептора НК-2 в других отделах мозга, до сих пор остаётся не исследованным (Hong JS, 1983; Wray S, Hoffman GE, 1983). Несмотря на это, антагонист рецептора НК-2 - саредутант (SR48968), уже зарекомендован в качестве антидепрессанта и анксиолитика на модельных системах животных (Maubach КА, 2001; Воусе S, 2001), и на сегодняшний день проходит тестированию в клинике у пациентов с депрессией (McLean S., 2005).
НК-3 рецепторы располагаются почти исключительно в ЦНС (Spooren W, 2005), хотя, в следовых количествах они находятся и в периферических тканях: в матке, скелетной мускулатуре, портальной и мезентеральной артериях, в лёгких, печени и на некоторых видах нейронов кишечника (Tsuchida et al., 1990; Massi et al., 2000; Page and Bell, 2002; Patak et al, 2003; Fioramonti et al, 2003; Lecci and Maggi, 2003). Экспрессия НК-3 рецепторов варьирует между низкой и очень низкой, поэтому однозначно ещё не были идентифицированы участки его распределения в ЦНС. Небольшие модификации в последовательности аминокислотных остатков трансмембранной области НК-3 рецептора у различных млекопитающих, дополнительно усложняют изучение этого рецептора (Almeida ТА et al, 2004). Эти модификации значительно влияют на афинность радиоактивно меченых лигандов, каждый раз изменяя картину результатов по распределению рецепторов в секциях мозга (Wu LH, et al, 1994). Несмотря на эти несоответствия, существует некоторое соглашение об экспрессии НК-3 рецепторов - их мРНК постоянно определяют в областях, frontal, parietal and cingulate коры мозга, в различных ядрах амигдалоидного тела, в гиппокампусе и, что является наиболее важным, в структурах среднего мозга — чёрном теле, крыше желудочка и ядре Raphe (Spooren W, 2005). Рецептор НК-3, будучи широко распространенным, в ЦНС, модулирует активность допаминэргических, норадренэргических и холинэргических систем (Emonds-Alt X, 2002; Bannon MJ, 1995). Было показано, что антагонисты НК-3 рецептора обладают антипсихозным воздействием на человека (Nalivaiko Е, 1997; Emonds-Alt X, 1995). Фармацевтическими компаниями Sanofi and Glaxo было опубликовано, что селективные антагонисты рецептора НК-3 — осанетант (SR142801) и талнетант (SKB) на данный момент, находятся во II фазе клинических испытаний при шизофрении.
