Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере бактериофага N15 Дорохов Борис Дмитриевич

Содержание к диссертации

Введение

Обзор литературы

Бактериофаг Pi -9-

Плазмида F - Ю -

Плазмида Ri -12 -

Плазмида RK2 -13 -

Внутриклеточная локализация плазмид -15-

Модель функционирования механизма сегрегационной стабильности..

Особенности генетической организации и устройства сегрегационной системы бактериофага N15 - 20 -

Цели и задачи работы -24 -

Задачи работы: - 24 -

Материалы и методы - 25 -

Среды, реактивы, ферменты и синтетические олигонуклеотиды - 25 -

Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды - 26 -

Плазмиды, используемые для экспрессии генов N15 - 26 -

Плазмиды и штаммы, используемые для экспериментов с репортерными геном при анализе транскрипции sop оперона N15 - 27 -

Плазмиды и штаммы, используемые для Northern-blot и primer extension анализа транскрипции sop оперона N15 -28-

Плазмиды, используемые в эксперименте по изучению регуляции экспрессии гена протеломеразы бактериофага N15 - 28 -

Плазмиды, используемые для определения скорости потери линейных репликонов N15 - 29 -

Плазмиды, используемые для определения внутриклеточной локализации линейных репликонов - 30 -

Трансформация E.coli -32-

Выделение плазмидной ДНК -32-

Электрофорез ДНК -32

Определение активности sop промотора -33"

Анализ транскриптов с помощью ОТ-ПЦР -33-

Определение активности Ptel промотора - зб -

Определение эффективности трансформации -Зб-

Флуоресцентная микроскопия -зб-

Определение скорости потери линейных плазмид -37-

Результаты - 39 -

Регуляция экспрессии sop оперона N15 - 39 -

Структура sop оперонаплазмиды N15 -39-

Связывание Sop белков N15 с sopPi промотором -41-

ОТ-ПЦР анализ транскриптов sop оперона N15 -48-

Структурная организация промоторной области гена протеломеразы - 51 -

Регуляция экспрессии промотора протеломеразы - 52 -

Роль протеломеразы в стабилизации концов линейной ДНК -54 -

Внутриклеточная локализация. Многокопийное состояние - 57 -

Внутриклеточная локализация. Однокопийное состояние - 62 -

Определение скорости потери линейных плазмид с разным количеством центромерных сайтов, основанных на репликоне N15 64-

Обсуждение -69-

Регуляция экспрессии sop оперона -70-

Внутриклеточная локализация плазмид -J2-

Роль числа и расположения центромер в эффективной работе механизма сегрегационной стабильности линейной плазмиды 75 -

Список публикаций по теме диссертации

• Внутриклеточная локализация плазмид
• Плазмиды и штаммы, используемые для экспериментов с репортерными геном при анализе транскрипции sop оперона N15
• Связывание Sop белков N15 с sopPi промотором
• Роль числа и расположения центромер в эффективной работе механизма сегрегационной стабильности линейной плазмиды

Введение к работе

Стабильное наследование бактериальных хромосом и низкокопийных плазмид обеспечивается правильным распределением реплицированных молекул между дочерними клетками перед клеточным делением. Функционально этот процесс аналогичен митозу у эукариот. Как правило, стабильное наследование обеспечивается опероном из двух генов (sopA и sopB) и центромерным сайтом (sopC). Репликация плазмид сопровождается формированием сегрегационных комплексов (Sop белки, связанные с центромерами); реплицированные молекулы образуют пары за счет взаимодействия этих комплексов. После завершения репликации происходит разделение пар и активный транспорт плазмид к противоположным концам клетки. Механизм активной сегрегации бактериальных хромосом принципиально аналогичен. Эта модель является результатом исследования механизмов стабильного наследования кольцевых бактериальных репликонов (хромосом и плазмид), в первую очередь, плазмид F и Pi Escherichia coli. Однако, известны и прокариотические организмы, имеющие линейные плазмиды и хромосомы с ковалентно замкнутыми концами (теломерами), К их числу относятся возбудитель боррелиоза (болезни Лайма) Borrelia burgdorferi, патоген растений Agrobacterium tumefaciens, линейные плазмиды рЫКог, pY54 и N15- Механизмы стабильного наследования линейных бактериальных репликонов в настоящее время малоизучены. Мы исследуем явление стабильного наследования на примере бактериофага N15, особенностью которого является то, что в лизогенном состоянии он не интегрируется в хромосому Escherichia coli, а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми концами. Стабильное наследование плазмиды N15 обеспечивается sop локусом, имеющим гомологию с sop локусом плазмиды F, но центромерный сайт N15 не представляет собой несколько кластерированных инвертированных повторов, расположенных непосредственно рядом с sop опероном, как в плазмиде F, а представлен четырьмя повторами, распределенными в геноме, причем каждый из этих сайтов функционирует в качестве центромеры (Ravin and Lane, 1999; Grigoriev and Lobocka, 2001). В то время sop опероны кольцевых плазмид являются функционально изолированными генетическими модулями; имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что sop оперон N15, помимо обеспечения сегрегационной стабильности профага, имеет функции, связанные с контролем репликации ДНК и контроля экспрессии генов фага. Изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих правильное распределение линейных низкокопийных плазмид в бактериальных клетках, внесет важный вклад в понимание механизмов наследования генетического материала у прокариот.

Обзор литературы

Механизм распределения бактериальных плазмид и хромосом между будущими дочерними клетками при делении, наряду с работой аппарата репликации ДНК, является необходимым для стабильного наследования генетического материала. Высококопийные плазмиды не требуют наличия специальных механизмов сегрегационной стабильности для гарантированного распределения их реплицированных копий между дочерними клетками при делении. Случайного пассивного распределения вполне достаточно, чтобы, как минимум, одна копия оказалась в каждой из дочерних клеток. Низкокопийные плазмиды должны обладать специальным механизмом для обеспечения гарантированного наследования. Первые работы по изучению активного процесса сегрегации и связанных с этим явлением генов были проведены для низкокопийных плазмид Escherichia coli Pi и F. (Ogura and Hiraga, 1983; Austin and Abeles, 1983). В дальнейшем, в плазмидах разнообразных бактерий экспериментально, и/или компьютерным анализом последовательностей геномов были найдены аналогичные, обнаруженным у Pi и F сегрегационные модули, ответственные за стабильное наследование.

Обычно сегрегационный модуль состоит из двух генов, кодирующих транс-активные белки, способные образовывать комплекс на цис-активном центромерном сайте ДНК. Первый из двух генов в опероне кодирует белок, как правило, называемый РагА, второй ген кодирует белок, который является ДНК-связывающим фактором (РагВ). Существует значительная неоднородность в размерах и последовательности РагА белков, но одни из них обладают слабой АТФ-азной активностью и содержат Walker-type АТФ-азный мотив (РагА), другие же являются актиноподобными белками (РагМ) (Surtees and Funnell, 2003; Gerdes et al, 2004). В случае плазмиды Ri, кодирующей РагМ актиновый гомолог, АТФ-опосредованная двунаправленная полимеризация этого белка обеспечивает внутриклеточный транспорт прикрепленных плазмид к центрам будущих дочерних клеток (Moller-Jensen et al., 2002; van den Ent et al., 2002; Moller-Jensen et al., 2003; Gainer et al., 2004). Известные на настоящий момент данные говорят о том, что и белок РагА также управляет распределением плазмид за счет активного процесса полимеризации (Ebersbach and Gerdes, 2004; Barilla et al., 2005; Lim et al., 2005; Adachi et al., 2006), однако

молекул яркы-з механизма, їювлєчєішью в процесс сегрегационной стабильности, есе егде недостаточно кзучйшд.

Начадькой стадией процесса сегрегации является сборка нукгк-опротеииозого комплекта на дентромере, гак называемой еегроеомы. Ме>;зшззм наиболее хорошо азучеЕі на примере бактериофагов Pi и Р?. Эти фзги яшшотея родственными, содержат кротяжеЕЕвкїе участки гомологии (ом. Утаї and Yanpnek; 1977Л a s ліезошіком состоянии не интегрируются н хромосому . сой", а предета;>ля;От собой кольцезые нязкокопкйны'е плазмиды. Все компож-петы системы сегрегшщотгоії стабильности локализованы в одном локуее, par СЛ!;,?еіп ало Abeles, 1983«, Ь; Ludike ef ії/., ї-9&>.?- Этот локуе еіключжт авт>зрегуяпруемъш опорой, состоящий из дну:< геиов, /вдгА и pay#, а т;пока as--денетвующпй сайт parS, следующий за геном parll ParS (яслючает два тзша последовательностей, узнаваемых ParS (Davis, е ue\, -.990), расположенных no обеим сторонам сайта сйяоьяхшхея бактериального белка Ш?.

Рисунок і. ОрїШїизацнж сеЕтшационного модуля. Ояерон состоит еїз дяук генов, кодвруюпш>: Walker-type «ли актшюподобЕгую АТФ-азу ('показано серым цветом) и бело;-:, способный связиваться с цеї-щюмеро'8 {к рз єн мй). Происходит сборка комплекса па центромере (белый каадрат), расноложешж еіосдє илїі жпед опероном. Фактор связывания с центромерой вовлекает АТФ-азу, которая, в сьою очередь п^ли^ерйзуетея ї-т направляет плазмиду к центру будущей дочерней клітки (Hayes and ВзгШа. іюов).

Основная їїоелеяоьйїольжлть. обеспечивающая связывание РагВ, - ато гептамер (attteac). вазиваемый Во:;с А. Имеется четыре копіш Кокса А. два из которых образуют нннергнровавтЕвш повтор в правой ееолоіяшє parS. мишзмалыгую ЕїОСледоійїТїУіьксй.ть. необходимую для связывания ParS (Martin

б-

et al._t 1991). Второй последовательностью, участвующей в связывании РагВ, является гептамер (tcgcca), называемый Боксом В (Davis et al, 1990)-Связывание IHF с parS вызывает изгиб ДНК, центр которого находится в сайте связывания IHF. Фгот изгиб способствует специфическому свзыванию РагВ с parS (См, Рис. 2 b.) (Davis and Austin, 1988; Funnell, 1988b, 1991; Funnel! and Gagnier, 1993, Radnedge et ah, 1996).

N-концевой участок белка РагВ включает последовательность, обеспечивающую взаимодействие с РагА, в то время как С-конец содержит последовательность, существенную как для связывания с центромерой parS, так и для димеризации. РагВ образует семь a-helix районов (helix-turn-helix [НТН] домен), соединенных четырьмя подвижными аминокислотными линкерами с отдельным доменом, который содержит три антипараллельные р цепи и С-концевой a-helix (димерный домен). Димеризация РагВ происходит за счет упаковки [3 цепей и С-конечного участка (Schumacher and Funnell, 2005).

Хотя сегрегационные модули плазмид, как правило, организованы в соответствии с описанной выше схемой, центромерные сайты могут иметь весьма разнообразную структуру. Обычно, центромера представляет собой набор из прямых повторов, но также может включать инвертированные повторы и/или прямые повторы с внутренней симметрией. Центромера parS бактериофага Pi представляет собой набор прямых повторов, расположенных после генов, отвечающих за сегрегационную стабильность. Однако, число повторов, их длина, расстояние между ними, нуклеотидная последовательность, - всё это может сильно различаться в структурной организации других известных центромер (Рис. 2 a.) (Hayes and Barilla, 2006).

;;>СЫ:

І-ХЧХ'І

-ss>Js-

рїДЙВй.'ї. -№$----S$--—№ Sfij,——SSj -К>—"*Ф—«ф—S:"^ ^ «$"S:'₄V—-S;t"

:>tAVi!№4^J -«&» Sft'J-^S-

Рисунок 2, Разнообразие строения иеитромерных сайтов бактериальных ялазмнд.

a. Ноказз.ны наиболее изучєншіШ центромеры различных "«лззмид. Огрелками
показаны .тшвторы, дльша и число которых рналичко у разных центромер. Для
?\ ptirS повторы бахїл. А и бокса В хшкзззнел серым и красиьш еответт'ненно.
Сайг связываний ШР показан еиакк прямоугольником. Масштаб для
центромеры ^урСклазмнды F отличается от других центромер.

b. Схематическое изображение молекулярной организации шроеомы Pi.
содержащей parS последовательность ДНК, ^ которой в;«іимоде%чгвует 1KF
(фиолетовый), образуя тто ДНК. РзгВ (зеленый) ы-аимодействует і:
гатгачерііьїмв и гекезмерными последовательностями на обои к концах />аг.
ParA (ісрзенші) вовлекается в сегроеому за слет азаимодейш'інїя с Par В.

К примеру, кодируемый идазмидой F бшюк ЗорВ, яшіачовшйся гомологом РагВ. распознает <:айт скязывзшш, предетакляхшп-ш собой двенадцать последовательно расположенных конторой длиной 43 ^т' ifiopC). Для ераьиения, белок KorB цлазмвды RK2 связыиаетея с полшщромом длиной )3 в? (ОзЗ)- Последние ясодедовзяия структуры. ДНКч;вя:швающего домена бедка КогВ изъявили консервативный ЙТИ мотив, а также необычный механизм распознавания бел;*»* центромеры. Механизм основан на двустороннем взаимодеке';"яші бе-ака с двумя «арами нуклеотидов, смежными ео ередной парой тринадцати нукдеотидиого сайта связывания (Kliare еї ai_f УООа). Волее гот, s отди'ши от РагВ фагз Рї.. процесе дїжернзздии КогЕ за ечет взаимодействия С-концевых районов бед їси приводит к суш&стве'нному узелкменпю способности связываться є ДНК. (Deibrue3< ? al, 2004)- SorB-0 Н'ГН мотив связывается <: центромерой, изменяя вторичную «руктуру ДНК ь месте контакта. Ы--кота:зой район КогВ мавмодействуйт с родственным аналогом РагА белка (ІпеО), который, в єною очередь, после связывания коре-срывает часть последовательности цектромерного сайта. Таким образом, РзїВ и КогВ, являясь по сути белками* екязы&пощимиея с центромерой и

-о¹-

гомологами, используют различный механизм как для олигомеризации, так и для связывания с ДНК. Каждый из этих двух белков распознает свои центромеры, которые у Pi и RK2 различаются как организацией повторов, так и нуклеотидными последовательностями. В последнее время было идентифицировано множество ДНК-связывающих белков, осуществляющих функции, аналогичные РагВ, но структурно отличающихся от него, а также существенные различия в механизмах формирования ДНК-белкового комплекса. Несмотря на такое разнообразие в организации центромер, РагВ белки выполняют главную функцию - формируют ДНК-белковые комплексы и обеспечивают специфичное связывание родственных РагА белков с образованием сегрегационного комплекса. Стоит отметить, что в большинстве случаев системы сегрегационной стабильности плазмиды самостоятельно обеспечивают правильное распределение репл^цированных молекул перед делением. Скорее всего, этот процесс не связан с компактизациеи ДНК, как в случае распределения бактериальных хромосом, и происходит независимо от сегрегации нуклеоидов Сем. обзор Прозоров, 2005), так^гмутантном штамме mukB плазмида F распределяется правильным образом (Hiraga, 1992)-

Бактериофаг Pi

В настоящий момент наиболее хорошо изучена организация сегрегационного модуля бактериофага Pi. Сайт parS представляет собой последовательность - 8о нт, расположенную следом за генами рагАВ. Центромерный сайт parS состоит из двух частей, разделенных сайтом связывания IHF. Каждая из частей содержит несимметрично расположенные гептамерные и гексамерные мотивы, с которыми может связываться РагВ (Hayes and Austin, 1994; Davis and Austin, 1988; Surtess and Funnell 2001). Белок IHF, связываясь с ДНК, вызывает изгиб в области parS, тем самым способствуя взаимодействию РагВ с сайтами связывания обоих частей центромеры (Funnell, 199¹)- Подобные конформационные изменения необходимы для образования сегросомы и правильного функционирования механизма сегрегационной стабильности Pi. Однако стоит отметить, что участие IHF или других структурных белков, кодируемых клеткой, в формировании нуклеопротеиновых комплексов на центромерах других бактериальных репликонов пока не было описано.

Белок РагА обладает АТФ-зной активностью и выполняет две функции: во-первых, он репрессирует промотор par оперона и, во-вторых, является компонентом собственно механизма сегрегационной стабильности (Davis et al., 1992 Friedman and Austin, 1988, Davis et al, 1996). РагА образуют димеры, связываясь с ATP или ADP, причем связывание с АТР приводит к изменению конфигурации РагА, делая возможным специфичное взаимодействие с SopB и включение в структуру сегросомы (Bouet and Funnell. 1999)- Описана точечная мутация в РагА, не влияющйпо на репрессию промотора par оперона, но нарушающая стабильность высококопиинои плазмиды, содержащей parS (Youngren and Austin, 1997). Анализ свойств этого мутанта позволил выдвинуть гипотезу об образовании после репликации ориентированных пар плазмид, которые разделяются и транспортируются к противоположным концам делящейся клетки. Если контакт между плазмидами осуществляется в parS сайтах, а функция РагА состоит в разделении пар, то описанная мутация, нарушающая эту функцию, фактически приводит к снижению эффективного числа копий плазмиды вдвое, что и наблюдалось.

Второй важной функцией РагА является регуляция экспрессии par оперона, что обеспечивает контролируемую продукцию Par белков. Повышенный уровень их экспрессии нарушает работу механизма сегрегационной стабильности (Funnell, 1988а Hayes et al, 1994)- РагА репрессирует транскрипцию, связываясь с районом, перекрывающим промотор оперона (Abeles et al, 1985), а именно, участком длиной около 140 нт, центром которого является АТ-богатый палиндром длиной 42 нт (Davis et al, 199²)-Аналогичным образом соответствующий промотор репрессирует РагА белок фага Ту. РагА белки содержат ДНК-связываюший helix-turn-helix мотив в N-концевом участке (аминокислоты 43^_б2 в Pi и 44-63 ^в Р7)> замена этого мотива в РагА Pi на эквивалентный мотив из РагА Vj приводит к смене специфичности репрессии промотора (Hayes etal, 1994)-

Плазмида F

F-фактор является низкокопийной конъюгативной плазмидой, кодирующей собственный механизм сегрегеционной стабильности, или sop-систему. Подобно parS сайту Pi, центромера sopC плазмиды F расположена после генов sopA и sopB, гомологичных рагАВ. Однако существуют различия в организации центромер: sopC представляет собой двенадцать

-ю-

последовательных элементов (повторов) длиной 43 нт (Mori et al., 1986), каждый из которых способен сам по себе полностью стабилизировать плазмиду в присутствии SopAB (Biek and Shi, 1994)- Индивидуальный элемент sopC содержит инвертированный повтор длиной 7+7 нуклеотидов, разделенных двумя нуклеотидами, и зеркальный повтор 9+9 нуклеотидов, разделенный одним нуклеотидом. Белок SopB является гомологом РагВ и может связываться с центромерным сайтом sopC, что приводит к снижению уровня отрицательной суперскрученности в этом районе ДНК. Также было показано явление двунаправленного распространения SopB белков по ДНК, начиная от области связывания с sopC, приводящее к сайленсингу близлежащих к центромере последовательностей (Lynch and Wang, 1995; Rodionov et ah, 1999). Вероятно, это явление отражает конфигурацию нуклеопротеинового комплекса, окружающего последовательности вне сайта sopC, и может иметь некое вторичное, пока не установленное значение, для обеспечения сегрегационной стабильности (Rodionov and Yarmolinsky, 2004).

Избыточное количество SopA может дестабилизировать плазмиду, содержащую sopC; подобный эффект был выявлен и в случае чрезмерной продукции РагА для плазмид, несущих parS (Abels ег ah, 1985). SopA снижает уровень положительной суперскрученности плазмидной ДНК, вызываемой связыванием белка SopB с центромерным сайтом sopC и образованием сегрегационного комплекса. Для этого процесса требуется свободный сайт связывания АТР белка SopA, наличие которого свидетельствует, что связывание SopA с ДНК имеет существенное влияние на структуру и организацию сегросомы, образуемой на sopC (Lemonnier et ah, 2000).

Как и РагА, SopA принимает участие, как в регуляции экспрессии оперона, так и в работе собственно механизма сегрегационной стабильности. SopA связывается с четырьмя последовательностями CTTTGC, перекрывающими промотор, и, тем самым, репрессирует его (Mori et al., 1989). Уровень репрессии возрастает в присутствие SopB и дополнительно возрастает в присутствие sopC (Yates et ah, 1999). Однако, как и в случае с РагА, белок SopA не может напрямую взаимодействовать с центромерой sopC, и его роль в изменении организации сегросомы опосредована взаимодействием с SopB (Lemonnier et ah, 2000).

Плазмида Ri

Par локус плазмиды Ri является аналогом, но не гомологом par/sop лоуксов F и Pi. В этом случае центромерныи сайт рагС расположен не после оперона, состоящего из генов рагМ и parR, а перед ним (Dam and Gerdes, 1994. Gerdes and Molin 1986). Сайт рагС включает в себя два набора итеронов длиной 11 нт, повторяющихся тандемно пять раз. Между наборами располагается последовательность из 39 ^нт> содержащая промотор pavMR, перекрывающийся двумя итеронами, с которыми связывается ParR. (Jensen R.B. et ah, 1998; Breuner et ah, 1996; Jensen et ah, 1994). Связывание ParR с итеронами необходимо как для репрессии, так и собственно для работы механизма сегрегационной стабильности, причем для обеспечения этих функций требуется вся последовательность рагС. Актиноподобный белок РагМ, обладающий АТФазнои активностью, является неотъемлемой частью par-системы плазмиды Ri (Jensen and Gerdes, 1997) и может взаимодействовать с комплексом ParR-рагС используя АТР-зависимый механизм. Таким образом, образование сегрегационного комплекса плазмиды Ri напоминает формирование сегросомы на parS у Pi и на центромерных сайтах других плазмид, вовлекающих в нуклеопротеиновый комплекс Walket-type АТР-азу (Moller-Jensen et ah, 2003). В отличие от SopA/ParA, РагМ не принимает участие в регуляции активности par промотора. Было установлено, что образование сегрегационного комплекса у рагС приводит к образованию пар плазмид, контактирующих в районе этих сайтов.

Длина (т.п.н.) 12 3

I I I —

Р1 Р"¹ ********** * <=*=^ ">

^ ^ oarS

рагА

рагВ

репрессиятранскрипции

связывание с центром врой

SOpA

F ^р»^пГ ************ -ш—і

sopC

реп рвссия тра искрил ции

связывание с центромерой

связывание с центроыерои

Рисунок 3- Организация сегрегационных оперонов плазмид Pi, F и Ri. Заштрихованый прямоугольник - транскрипт; Черные прямоугольники, элементарные единицы центромерных сайтов.

Плазмида RK2

Особый механизм, обеспечивающий сегрегацию ДНК в делящейся бактериальной клетке для имеющих широкий круг хозяев плазмид из группы несовместимости Р (ШсР), требует отдельного рассмотрения. Эти плазмиды стабильно поддерживаются в различных грамотрицательных бактериях. Для понимания того, как IncP плазмиды могут существовать в различных видах бактерий, необходимо определить их стратегию стабильного наследования и изучить, как их системы взаимодействуют с хозяйской клеткой. По сравнению с описанными системами сегрегационной стабильности, локус плазмиды RK2, отвечающий за стабильное наследование, имеет много общего с ними, однако, существуют и важные отличия.

-із-

Процесс активной сегрегации для ІпсР плазмид был впервые описан Mayer and Hinds, 1982, которые обнаружили фактор несовместимости функции стабильного наследования в когА опероне RK2, кодирующем репрессор транскрипции КогА и КогВ. Ген incC, ответственный за несовместимость, перекрывается с геном когА по различным рамкам считывания и продолжается до гена korB (Thomas and Smith, 1986) (См. Рис. 4)

КогА КогВ

Рисунок 4- Организация когА сегрегационного оперона плазмиды RK2 Ген когА расположен с пределах incC, но кодируется с другой рамки считывания. incC2 кодирует белок 1псС2 с внутреннего сайта инициации. korFn korG гены «основных» белков с неустановленными функциями. Р - промотор; Од и Ов - сайты связывания КогА и КогВ соответственно. Стрелкой отмечен сайт начала транскрипции (Siddique and Figurski, 2001).

Ген incC экспрессирует два полипептида: длинный IncC и короткий ІпсСг, инициируемые с внутреннего сайта трансляции. Оба белка являются АТР-азами, сходными с РагА плазмиды Pi (Gerdes et al, 2000). Изучение внутриклеточной локализации RK2 плазмид в Escherichia coli с помощью флуоресцентной микроскопии показало наличие системы активной сегрегации. Было установлено, что белок IncC может взаимодействовать с КогВ in vivo и in vitro, а ІпсСг, КогВ и сайт связывания КогВ (Ов) играют важнейшую роль в процессе сегрегации. РагВ гомолог КогВ связывается с 12 сайтами Ов, расположенными от области -35 промотора когА оперона до 198 нт после точки начала транскрипции, причем КогВ, связываясь с ними, может репрессировать транскрипцию промотора, Белок IncC, являясь гомологом РагА, способен усиливать репрессию, вызванную КогВ, при этом нет данных о том, что белок сам способен связываться с ДНК. Работы по изучению активности промоторов показали, что эффект репрессии связан с белком КогВ, при этом происходит изменение конформации ДНК в месте взаимодействия с белком. Такие конформационные изменения, по всей видимости, снижают активность промотра, а связывание IncC с КогВ приводит к усилению репрессии (Jagura-Berdzy et al, 1999). Таким образом, существует двойной контроль промотора

оперона когА, с помощью белка КогА и совместного действия белков KorB-IncC. Белок 1псС2 являясь АТР-азой способен связываться с комплексом КогВ-Ов и полимеризовываться, обеспечивая транспорт плазмид (Siddique and Figurski, 2001).

Внутриклеточная локализация плазмид

Использование флуоресцентных зондов для изучения внутриклеточной локализации плазмид в последние годы существенно облегчило анализ механизмов сегрегационной стабильности плазмид и хромосом. Было установлено, что перемещение новой реплицированнои ДНК является не пассивным процессом, связанным с увеличением клеточной стенки, а активным и достаточно быстрым (относительно периода клеточного цикла) процессом (Sharpe and Errington, 1999J Jensen and Shapiro, 1999). Изучение внутриклеточной локализации плазмид позволяет лучше понять, как функционируют механизмы сегрегационной стабильности и какие процессы происходят в клетке перед делением. В работах по изучению par систем плазмид Pi (in vivo) и Ri (in vitro) было установлено (Edgar et ah, 2001; Jensen et ah, 1998), что центромеры реплицированных плазмид «спариваются», причем взаимодействие двух плазмид происходит в центре клетки за счет взаимодействия комплексов, образованных на центромерных сайтах ДНК-связывающими сегрегационными белками (Li et ah, 2004)- Образование такого комплекса в центре клетки недостаточно для успешной сегрегации плазмид, только включение в нуклеопротеиновыи комплекс белка АТР-азы приводит к правильной работе сегрегационного аппарата и, как предполагается, является первой стадией процесса сегрегации (Funnell, 2005). В случае плазмиды Ri для спаривания копий достаточно взаимодействия центромеры рагС с белком ParR, однако РагМ может способствовать этому процессу (Jensen et al, 1998)-Возникает вопрос, почему именно центр клетки является местом для спаривания дочерних плазмид после репликации? Возможно, репликация плазмид в клеточном центре обеспечивает правильное пространственное расположение сегрегационных комплексов за счет взаимодействия с клеточными факторами, влияние которых на процесс сегрегационной стабильности требует дополнительного изучения.

Усовершенствованые в последнее время методы внутриклеточной локализации макромолекулярных комплексов позволили установить, что

положения аізутри клетки Оелкоа РагА/SopA. ParB/SopB и еайгочз parS/щуС шагшосззязах-ш (Erdmann et ві. 3999; Li of «?„ 2004; Nik! and Hiraga, x99?3-Вкуграклеточкая локализац&а плйзмйя F її Рї в жир.ых клетках была їіеследошта с помоіцьіо флуорес -рентного бел if з О PP. Для этого з гезом плазшхд был тітщт^оіінн їас-о аератор, о которым связывался гибридный беле»: GFFMad. :жещ?еееируемьзй s той же зілєткє (Оозтіозх el аі, і99?"_; Benson and (їєгсієй, 3999)- Авадогачїше паттерхшг еиучркклеточкой локализации хтлазмид была выявлены в экспериментах с использованвеч fluorescent if: situ hybridisation (FISH) (Niki and Hiraga^ 1997). Правильная в Езутри клеточная локализация нлазмйды F ;>;ш«:йт от футециозгарованш 5'^е? - системы (Nile? and Hlraga. 1997)- 8 клетках, содержа-цих одну К ила Рї зхлаамнду. флуорееде-гиша екгцал локализуется б районе центра клетуи, в то &рем.ч как в клетках, содержащих две пдазхгады (результат репликации), они расположены в положениях -/л и -Л по длине клетки. TasfKiSi образом, .можно предположить, что ззлазмнды реплщирузотон в яентре хлетзеи, а затем траікко^пруіотея п хіоложеаня положениях V* и ^:ik, т.е. в хучзтры будущих дочерних клеток. f-де они и находятся зо завершения клеточного делений. Отсутствие фдуоресзіекгпш: фокуаш зї других ноложєеїкях езїндеті'льетзїует о том, что этот перенос

КрОТЙКаеТ ДОСТЙТОЧЕЗО бьХСТрО ПО Сра-ЇКеНЗЖ С ДЛИТеЛЪНОСПпО КЛЕТОЧНОГО ЦИІСЛ&.

что кредзюлаз'ает актншхый транеззорт плазмид.

Риеумогс. 5- Внутриклеточз*ая локализация "нлаамид Рх. Фяуореецештз-зя микроскопия и реагПїЕіох: зременн. На пераом зтаззе фокусы объединены и локализуются ії иеатре клетки незадолго до клеточного деления. Далее кроксходвт быстрое разделение пар а деунаправлеш'ЫЙ транспорт плазмвд. Дзлааейтаее образоеанве клеточной етеїзки разделяет нлазжхды, оставляя каждую us е)їе:< :. ejosoh дочетжей з-:летке (1-і arid Austin, аооз).

-іб -

Также была исследована внутриклеточная локализация SopB и РагВ (Erdmann ег al 1999, Kim and Wang, 1998). Гибридный белок SopB-GFP локализуется в положениях Уа и ²/а, что позволяет предположить, что именно он обуславливает аналогичную внутриклеточную локализацию sopC-содержащей плазмиды. Аналогичным образом было установлено, что РагВ локализуется в положениях Ул и ³/4, образование точечного фокуса зависело от присутствия parS, в то время как его правильное положение зависело также и от РагА (Erdmann er al 1999)- В работе Li et al, 2004 было показано, что для правильной локализации плазмид с сайтом parS требуется наличие как РагА, так и РагВ белка. РагВ требуется для позиционирования плазмид в центре клетки, а РагА требуется для последующего их транспорта к противоположным полюсам перед клеточным делением. Мутации, снижающие АТР-азную активность РагА, приводили к возникновению аберраций в положении плазмид. Аналогичные результаты были получены при изучении механизмов сегрегации плазмиды RK2, кодирующей РагА и РагВ гомологи 1псС2 и КогВ (Bignell etal, 1999)-

Модель функционирования механизма сегрегационной стабильности

Полученные в последние годы результаты (Niki and Hiraga, 1997» *999; Jensen et al, 1998; Jensen and Gerdes 1997) свидетельствуют в пользу следующей модели функционирования механизма сегрегационной стабильности (Рис. 6, Moller-Jensen et ah, 2000), принципиально аналогичной митозу у эукариот. Репликация плазмид, локализованных в районе центра клетки, сопровождается формированием сегрегационных комплексов; реплицированные молекулы плазмид образуют пары за счет взаимодействия сегрегационных комплексов, связанных с их центромерами. После завершения репликации происходит разделение пар (в случае плазмиды F эту функцию, выполняет SopA) и активный транспорт плазмид. Образование пар плазмидами Ri in vitro зависит от белков ParR и РагМ (Jensen et al, 1998). Следовательно, сборка сегрегационного комплекса является необходимым предварительным условием для последующей работы гипотетического митотического аппарата. Колокализация плазмид и белков, связывающихся с центромерами (РагВ, SopB и РагМ Ri), предполагает, что эти белки связывают транспортируемые плазмиды со специфическими клеточными структурами, сохраняя их в определенной позиции до завершения клеточного деления, хотя существует

гипотеза, о том, что сегрегация Ri не зависит от клеточных факторов и локализация сегрегационного комплекса в центре клетки связана лишь с репликацией (Moller-Jensen et ai, 2003)*

Сегрегация хромосом является более сложным процессом. Флуоресцентная детекция хромосомной ДНК показала, что реплицированные оп-сайты быстро разделяются за счет движения к противоположным полюсам клетки. Это согласуется с тем, что хромосомные аналоги sop/par семейства специфически связываются с последовательностями, расположенными вблизи огьсайтов. Будучи клонированными в плазмидах, хромосомные и плазмидные sop/par системы работают одинаково эффективно. Поэтому вероятно, что плазмидные и хромосомные sop/pav системы моїуг функционировать сходным образом, т.е. может происходить образование спаренных огіС-районов, которые затем разделяются и транспортируются к противоположным полюсам.

Moller-Jensen и соавторы (200о) предложили следующую модель сегрегации бактериальных хромосом. В только что образовавшейся клетке, oriC перемещается к центру клетки, где происходит сборка реплисомы. Позднее, одновременно с репликацией, oriC активно транспортируется к полюсам клетки, к которым затем прикрепляются. Эта модель является некоторым упрощением реальной ситуации, поскольку она не принимает во внимание наличие нескольких репликационных вилок в быстро растущей бактериальной культуре. Более того, факты отсутствия par/sop гомологов в некоторых бактериальных геномах (например, Е. eoli) требуют дальнейшего изучения. Последующие исследования показали, что важнейшую роль в активном транспорте плазмид играет ParA/SopA и их гомологи. Сборка сегросомы подразумевает взаимодействие ParB/SopB с центромерным сайтом. Сам нуклеопротеиновый комплекс при этом локализуется в центре клетки. Включение в комплекс ParA/SopA обеспечивает разделение пар и полимеризацию белков с включением в реакцию АТР, тем самым, создавая структуру, расталкивающую плазмиды двунаправлено. Белки ParB/SopB могут включаться в создаваемую структуру, способствуя её правильной сборке (Barilla et qL, 2005). После завершения клеточного деления, по всей видимости, образованная ParA/SopA структура деполимеризуеется.

^18-

Рисудаж 6* Предшлагяешя модель сегрегации идазшил содержащих par/sop оперой.

Вслед за репликацией, копии ттшш&ы образуют пары в центре клетки заечет юйийюдейстштя с^здгадишшях SopB белков {желтый}* связанных с цаітромерой (краотый)* (l) SopA белок (синий) включается в еетрегациопішй компдаш (а) и, етазъшая АТР, двушшравлено дшшжризуетея между двумя дашромерами* тем самым, расталкивая шшзміїдьі к* ііротвдоволожш-вд ЕШїюсам клетки (J). SopB белки могут корректировать образование филамштов (4)^ Посміє окончания клеточного деления илйз»иды отазмйаются їіравильтіо распределены в дочерние клетью. Образованные SopA полимерные цепшки разрушаются <$)* (Hayes and Barilla, 2006).

Особенности генетической организации и устройства сегрегационной системы бактериофага N15

Бактериофаг N15 был выделен и описан В.К. Разиным в 1964 г (Голуб и Равин, 1967)- Фаг N15 имеет линейную двунитевую ДНК молекулярной массой 30 МД, частота лизогеннзации около 50%, урожай фага около юо, латентный период 45 мин (Равин, 197*)- Бактериофаги N15 и лямбда имеют схожую структуру вириона, около $0% ДНК N15 гибридизуется с ДНК фага лямбда (Ravin and Shulga, 1970). На основании этого N15 был отнесен к семейству лямбдоидных фагов. Как было показано В.К. Равиным и сотрудниками в 1967-70 гг, особенностью N15 является то, что в лиэогенном состоянии он не интегрируется в хромосому, а представляет собой автономно реплицирующуюся плазмиду (Ravin and Shulga, 1970)-

Следующий важный шаг в изучении генетики фага N15 был сделан проф. В.Н. Рыбчиным и сотрудниками, которые показали, что профаг N15 представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми концами (теломерами). Вывод о линейности профага N15 был сделан на основе физического картирования ДНК фага и профага, которое показало, что (і) обе молекулы ДНК линейны и имеют длину 46-3 тпн и (г) рестрикционная карта профага является результатом циклической пермутации карты фага (Сварчевский и Рыбчин, 1984b}-

Концы профага N15 (теломеры), назвываемые telL и telR> представляют собой шпилечные структуры, т.е. две нити ДНК ковалентно связаны однонитевыми участками. Шпилечная структура теломер профага N15 была установлена в работе (Сварчевский и Рьтбчин, 1984b). В работах (Малинин и др., 1992а, 1992b) были определены нуклеотидные последовательности концевых районов профага и соответствующего неразрезанного сайта в фаговой ДНК, telRL, представляющего собой палиндром длиной 56 н. Схема образования плазмидной ДНК из фаговой, впервые предложенная в работе (Малинин и др., 1992а), показана на рисунке 7- После проникновения фаговой ДНК в клетку она замыкается в кольцо по когезивным концам, однонитевые разрывы зашиваются ДНК-лигазой. Затем гипотетический фаговый фермент, впоследствии названный протеломеразой (прокариотическая теломераза), вносит ступенчатый разрыв в фаговой ДНК в области telRL.

load

totFI terfg^ teafff

TcwCWA *1m ЇЛЧСАСДАС* «W TITUCfJC* ЯКГ TCTCCT&M* Які ІЬТТйЮТТС Я4І- ІСГГСПТвЛ

Ьмцсмчсияитт>тккктцкіци»яя^ц?>

ци^упяривцчяі

teJRL

разрез* не fotRl сайта протепомеразой н образование ковалентно замкнутых тепомер

ДНК линейного гсрэфага

te/R

fe/L

teiR - дтлотатстсттоюзрбштиссе

_о

fe/R

двунаправленная репликация с внутреннего сг/сайта

/elL ( С кольцевой ДИмер

teff?R

образование шпи/>ечньх телоиер лротепонераэой

te/R

fc&

^о

Рисунок 7-А — преобразование фаговой ДНК в линейную плазмиду после инфекции. cosL, cosR — однонитевые когезивные концы; cosRL, cos — сайт после замыкания и лигирования; telRL — сайт действия протеломеразы; telL и telR — левая и правая шпилечные теломеры профага, образуемые при помощи протеломеразы; tosLl, tosL2, toslfi, tosRl, tosR2 и tosRg — предполагаемые сайты связывания протеломеразы; В — модель репликации линейного плазмидного профага.

Отжиг концевых однонитевых участков, имеющих внутреннюю комплементарность и последующее соединение фосфодиэфирных связей приводит к образованию ковалентно замкнутых теломер.

Некоторые свойства плазмиды N15 были охарактеризованы в работе (Сварчевский и Рыбчин, 1984а). Так ^было установлено, что плазмида N15 является низкокопийной и стабильно наследуемой, - частота ее спонтанной потери не превышает ю** на генерацию, N15 совместим с плаэмидами, представляющими различные группы несовместимости: Pi, pBR322, F-факгором,

В предыдущих частях обзора литературы были рассмотрены принципы функционирования механизмов сегрегационной стабильности, применимые к кольцевым низкокопийным плазмидам и, в ряде случаев, к бактериальным хромосомам. В то же время, механизмы, обеспечивающие стабильное наследование линейных прокариотических репликонов, практически не изучены.

Стабильное наследование плазмиды N15 обеспечивается sop локусом, имеющим гомологию с sop локусом плазмиды F как в области структурных генов (sopA, sopB), так и в районе длиной около 150 нт, предщесгвующем sopA, и содержащем промотор sop оперона, Psop. (Ravin and Lane, 1999). В случае плазмиды F белок SopA обладает АТР-азной активностью, а также может репрессировать Psop, взаимодействуя с сайтами связывания, перекрывающимися с промоторным районом. Функция белка SopB заключается в связывании с центромерным сайтом и образовании сегрегационного комплекса. В то же время исследование механизма сегрегационной стабильности N15 выявило существенные отличия от принятой для кольцевых плазмид модели. Так, центромерный сайт N15 не представляет собой несколько кластерированных инвертированных повторов, расположенных непосредственно рядом с sop опероном, а представлен четырьмя повторами, распределенными в геноме N15 (Рис, 8). Каждый из этих сайтов функционирует в качестве центромеры (Ravin and Lane, 1999; Grigoriev and Lobocka, 2001), Имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что sop оперон N15, помимо обеспечения сегрегационной стабильности профага, имеет функции, связанные с контролем репликации ДНК и контроля экспрессии генов фага. В то же время sop опероны кольцевых плазмид являются функционально изолированными генетическими модулями. Наконец, анализ нуклеотидной последовательности, предшествующей N15 sopA, позволил выявить несколько потенциальных промоторов, помимо Psop_t что является предметом отдельного исследования. Детальное изучение механизмов

функционирования н регуляцш sop системы сегрегационной стабильности N15 является целью настоящей работы.

ГІГ '

я,.?м

pUT

^,,Л V

ї^іЛ

РІИ71

ища і-

purCI

:<Ч-

і і.--.

Организация сегрегационных модулей. Гены, кодирующие

, R,

зелеиъши стрелками. Аналога Part? показшш оранжевыми и темжьеищвди

содержит ген РагМ_; тдізрушщнй гомолог аггашц - показано зтты% и ген ParR_? кодирующий ДНК-связыватщшэ белок,

Организации $ор системы бактериофага №5- Распределивмые $ геноме a (IR) N15

Цели и задачи работы

Целью работы является изучение особенностей структурной и функциональной организации локусов, обеспечивающих сегрегационнуто стабильность линейных бактериальных репликонов на примере профага N15, и установление возможных взаимосвязей меяоду процессами сегрегационной стабильности, репликации ДНК, образованием теломер и контролем экспрессии генов на разных стадиях жизненного цикла фага N15.

Задачи работы:

і) Идентифицировать промоторы sop оперона фага N15 и установить механизмы регуляции их активности.

1. Установить факторы, регулирующие экспрессию sop оперона N15 в лизогенном состоянии и на различных стадиях литического развития,

2. Исследовать возможную роль Sop генов N15 в регуляции репликации и числа копий профага.

3. Методом флуоресцентной микроскопии in vivo исследовать внутриклеточную локализацию профага N15 и влияние на нее Sop белков,

4. Установить значимость и функциональную роль наличия 4~^х центромерных сайтов, расположенных в различных районах генома N15 для стабильного наследования линейной плазмиды.

Материалы и методы

Среды, реактивы, ферменты и синтетические олигонуклеотиды

Бактерии выращивали в LB бульоне или чашках с LB агаром при 37 С или 30С. В случае необходимости в среды добавляли антибиотики: ампициллин (юо мкгр/мл), хлорамфеникола (20мкг/мл), канамицин (50 мкгр/мл), тетрациклина (20 мкг/мл) или спектиномицин (юо мкгр/мл) Pfu ДНК-полимеразае (Promega), щелочная фосфатаза Е. eoli, Т4 DNA лигаза, фрагмент Кленова ДНК полимеразы, Т4 полинуклеотидкиназа (New England Biolabs), бактериальная щелочная фосфатаза (Promega) и эндонуклеазы рестрикции (Promega, New Englan d Biolabs, Сибэнзим) были использованы в соответствии с рекомендациями производителя. Отбор рекомбинантов по цветному тесту на чашках с X-gal и ИПТГ осуществляли по методу (Sambrook et al, 1989).

Были использованы следующие синтетические олигнонуклеотиды: PRi (5' GATGTTAACCTTAACTTTGCGTTTTC); PR3 fe' TTGAATTCCAACGTAAGTAATACCGTTG); PR6 (5' TGATTGTCCAGTGTTGTAAAAAGCGA); PR23 (5' CCGGATCCTGACCGCGATTGATAC); PR23N (5' TCCTGACCGCGATTGATACA); PR34 (5' GCGAATTCGTGTGCTGATATGTTCCG); PR46 (5' CGGGATCCAGCTTCATCTAAGCGCAACG); PR48 (5' CGGGATCCTCTATCTCTTCCGTCTCTA); PR27L (5' CATCATCCAGCTCTCCAACG); PR39R (5' TGTTATGCCCTTCCTTACCC); PR37S1 (5' GGAATTCCCGGGTAGATGATACAATAAC); PR37S2 (5' CATGCCATGGTAACCTTACAAGAATTCTAC); PR37L3 (5' GCTCTAGACCCGGGTTATATCGCCACGGCT); PR28L (5' AACGGAAAGTACAACCGGGT); PR28R (5' GCTGAAAGACTGTATCAATC); Km-Pac (5' GTTAATTAACGTTGTGTCTCAAAATC); Km-Not (5' CGCGGCCGCCGTCCCGTCAAGT); telRL-з (5' CGGAATTCGTGTGCTGATAAGGAGAAC); telRL-l (5' GGGGATCCGTTrCTAAGTCTCTGGAT); IR2-R (5'CCTTAATTAATTAGGAAGTCAGGCGTA);

PR43mutiN (5' CAGTAGCGCCATTCCGTTGCTGTTC);

PR43mut2N (5' TCGTGGCCCAGCCGGAAGAAGAACGT);

IRspi (5' CGCGATATCGTGCGACCATGGTCGCACGGAAT);

IRsp2 (5¹ CCGGATTCCGTGCGACCATGGTCGCAGCATAT);

PR IR3-SexAI (5* CCTGGATATCGTGCGACCATGGTCGCACGGAAT);

PR IR3-BstBI (5' CGATTCCGTGCGACCATGGTCGCACGATAT);

PR IR3_FLl (5' CTGCATATCGTGCGACCATGGTCGCACGGAATC);

PR IR3_FL3 (5^T CTTGGATTCCGTGCGACCATGGTCGCACGATATGCAGGCA);

PR077 (5* GGTGGGACAGAGGTATCGCC).

Бактериальные штаммы, бактериофаги и ппазмиды

Штамм МСюбі (Casadaban and Cohen, 1980) был использован для размножения фагов лямбда и N15, штамм DHioB (Grant et ah, 1990), - в остальных случаях. Для повышения эффективности трансформации при получении линейных плазмид на основе репликона N15 использовали лизогенный по N15 штамм. Нумерация нуклеотидов в геноме N15 приводится в соответствии с последовательностью фага N15, представленной в GenBank (AF064539; Ravin et al, 2000).

Бактериофаг NisKm был получен в результате клонирования гена устойчивости к канамицину (ПЦР фрагмент, полученный с помощью праймеров Кт-Рас и Km-Not на матрице pKRPi2 (Reece and Phillips, 1995)) между уникальными сайтами Расі и Not! профага N15. В результате sop гены N15 были замещены геном устойчивости к канамицину, вследствие чего профаг NisKm не является стабильно наследуемым, а в остальном (частота лизогенизации, урожай, морфология бляшек, число копий и т.п.) эквивалентен исходному N15.

Плазмиды. используемые для экспрессии генов Nik

Плазмиды PDAG408 и pDAG242 были использованы для конститутивной экспрессии sopA и sopA одновременно с sopBj соответственно (Ravin et at, 2003). Плазмида pJDioi (Deneke et al, 2000) использовалась для экспрессии протеломеразы N15 (TelN)_? PDAG242 и pJDioi основаны на разных репликонах и поэтому совместимы. Плазмиды pCAis и pCAi2 использовались для экспрессии СВ репрессора и AntA антирепрессора Ni5_? соответственно.

Плазмида pNC07 использовалась для контролируемой экспрессии гена репликации герА. Для создания этой плазмнды был получен ПЦР фрагмент, содержащий последовательность гена герА N15 с использованием олигонуклеотидов 73S2 и 73L3* Полученный фрагмент был вставлен в экспрессионный вектор pBAD24 (Guzman et ah, 1995) между сайтами рестрикции Ncol и Xbal. Экспрессия AntA и RepA индуцировалась путем добавлением арабинозы в растущую культуру клеток до конечной концентрации o,oi%

Плазмиды и штаммы, используемые для экспериментов с репортерными геном при анализе транскрипции sop оперона Nis

Фрагменты ДНК N15, содержащие промотор sop оперона, были клонированы между ЕсоШ. и ВатпШ сайтами репортерного вектора pRS55i (Simons et al, 1987) на tf конце гена lacZ. Плазмида pNSPoi содержит фрагмент ДНК N15 sopP (от -470 ДО +47 относительно «А» в ATG кодоне гена sopA), полученный при помощи ПЦР с использованием праймеров PR34 ^и PR23-Плазмида pNSPo6 содержит фрагмент sopP2 (от -470 до -148; праймеры PR34 ^и PR46). Плазмида pNSP04 содержит фрагмент sopPi (от -183 до +47; праймеры PR3 и PR23). Репротерные конструкции sopAacZ были перенесены в хромосому Е. coli при помощи рекомбинации in vivo и лизогенизации штамма МСюбі рекомбинантным фагом ARS88 (Simons et aL, 1987), в результате чего были получены штаммы pNSPoichr, pNSP04chr и pNSPo6chr,

Для получения линейной репортерной плазмиды сперва была получена линейная плазмида pG59 на основе N15 путем лигирования Smal фрагмента из плазмиды pKRPn (Reece and Philips» 1995), содержащего ген устойчивости к канамицину, с фрагментом ДНК N15 (с координатами 22733-35000)? полученным ПЦР с использованием олигонуклеотидов PR27L и PR39R- pG59 содержит гены, необходимые для репликации и контроля лизогении (гены 28-38), включая telN, герА и сВ, Удалив из pG5950O нт ВдШ фрагмент, содержащий sopA и sopB гены_? получили плазмиду pG59^ Вставив lacZYA гены из pNSPoi (Расі - Xmalll фрагмент) между Расі и Not! сайтами в pG59> получили pNSP03 - линейную плазмиду, несущую Iqc оперон под контролем промотора sop оперона N15*

Плазмиды и штаммы, используемые для Northern-blot и primer extension анализа транскрипции sop оперона Nifi

Для анализа транскрипции sop оперона N15 использовали плазмиды pNSPoi, pNSP02. Для снижения негативного влияния высокого уровня р-галактозидазы на рост штаммов с плазмидой pNSPoi из этой плазмиды был удален ВатШ-BsrGl фрагмент, содержащий основную часть lac оперона, и получена плазмида pNSP02.9Ta плазмида использовалась как источник РНК дня primer extension анализа- Ті терминатор оперона sop N15 поместили между промоторным фрагментом и LacZ. SopAB-Ti фрагмент был амплифицирован на ДНК N15 с праймерами PRi и PR6 и затем вставлен в сайт Smal в вектор pUC9-Полученную плазмиду обрабатывали ВатШ и Nrul для удаления большей части вставки, за исключением юонт фрагмента с терминатором, обработали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I, а затем лигировали для получения pUC-Ti, Эта плазмида была обработана Saii3A, полученный фрагмент Ті длиной 237 иг вставлен в ВатШ сайт pNSPoi и pNSPoi Таким образом, терминатор Ті был размещен в естественной ориентации после промотора sop оперона. Размер sop-специфичных РНК, которые могли быть получены на этих плазмидах, ожидался от Ц.0 нт (относительно «А» в стартовом кодоне sopA до первой «Т», следующей за инвертированным повтором терминатора Ті) до 6о 1нт (от левого конца sopP до Ті).

Плазмиды. используемые в эксперименте по изучению регуляции экспрессии гена протеломеоазы бактериофага Nis

Плазмида pJDioi (Denke et al_v 2000) была использована для конститутивной экспрессии протеломеразы, а соответствующий «пустой» вектор pMSngEH - в качестве отрицательного контроля, В параллельном эксперименте с той же целью использовали линейную плазмиду pNPoi и соответствующий вектор PZC176 (Ravin et ab₃ 2001). Вектор pZCi76 основан на репликоне плазмиды Pi и содержит гены, необходимые для репликации и стабильного наследования Pi (мини-Pi), pNPoi была получена в результате клонирования фрагмента ДНК N15, содержащего telRL сайт и telN ген, в PZC176, что приводило к ее линеаризации и дальнейшему поддержанию в линейной форме (Ravin et al, 2001).

Линейная плазмида pG59* основана на репликоне N15 и содержит все гены, необходимые для репликации и контроля числа плазмиды N15, включая ген

протеломеразы (см, выше). Кольцевая плазмида pG59!c получена из PG59¹ путем делегирования теломер и telN гена (рестрикция Styl + ВатШ₉ обработка концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы и лигирование с геном устойчивости к тетрациклину, вырезанному из плазмиды pKRPi2 с помощью Srnal). Плазмида pNF04 содержит репликон F-фактора Е. coli, а также теломеры и ген протеломеразы N15 и реплицируется в линейной форме (Ravin etal., 2001).

Фрагмент ДНК N15, содержащий предполагаемый промотор гена протеломеразы Ptel (от -175 ДО -ю нт относительно «А» в ATG кодоне гена telN) был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров telRL-i и telRL-3-Этот фрагмент был клонирован между EcoRI и BamHI сайтами репортерного вектора pRS55l (Simons et at, 1987) на 5^T конце гена lacZ (плазмида pRSsS¹^^)-Поскольку вектор pRS55i основан на репликоне pBR322 и, следовательно, несовместим с плазмидами pJDioi и pMSngEH, имеющими тот же репликон, мы сконструировали производное pRSssiPtel, содержащее совместимый с PBR322 репликон pSOoi, С этой целью Ncol - Seal фрагмент плазмиды pRS55iPtel, содержащий PBR322 ori, заменили Ncol - ЕСІ136ІІ фрагментом плазмиды pZS2i* (Lutz and Bujard, 1997) содержащем репликон плазмиды pSCioi- В результате была получена плазмида pZS-Ptel, совместимая со всеми векторами, использованными для экспрессии генов N15. Для изучения влияние профага N15 на уровень активности Ptel промотора в pZS-Ptel был получен лизогенный штамм DHioB(Ni5)/pZS-Ptel.

Плазмиды. используемые для определения скорости потери линейных репликонов N15

Для изучения влияния количества центромер на процесс стабильного наследования было необходимо создать серию плазмид, содержащих разное число центромер, и определить, какое значение имеет их распределение в геноме N15- За основу была взята линейная плазмида pG59* с одной центромерой внутри гена репликации герА. Для получения не содержащей центромеру плазмиды pG595 было необходимо инактивировать центромеру, при этом не нарушив процесс репликации, что было выполнено с помощью сайт-направленного мутагенеза. ДНК N15 обрабатывали Rsal и, выделенный фрагмент длиной 1200 нт, циркуляризовали путем лигирования с помощью Т4

DNA лигазы. ПЦР фрагмент с использованием олигонуклеотидов PR43mutiN и PR43^mut2N содержащих замены в области инвертированного повтора был получен на лигированной ДНК. Полученный в результате ПЦР продукт лигировали для получения кольцевой молекулы и использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами PR077 ^и 37Si. Получившийся фрагмент обрабатывали EcoRI и вставляли в pG59i (замещая эквивалентный ЕсоВЛ фрагмент, не содержащий мутации), Плазмиды pG593> PG598 и pG599 содержащие дополнительные одну или две центромеры, получали вставкой в Расі сайт плазмид pG59i или pG595 фрагмента, содержащего один или два инвертированных повтора (IR), разделенных последовательностью длиной примерно 2 тпн, предварительно клонированного в векторе pGEM-T, Последовательность, содержащую инвертированный повтор, получали ПЦР на матрице ДНК N15 с праймерами PR3 и IR2-R и вставляли в pGEM-T по сайтам Pstl и Sphl для получения pG593 и PG598. pGEM-IR использовали для создания последовательности, содержащей две инвертированных повтора, разделенных небольшим участком, для этого в вектор по сайту .EcoRV был помещен Seal фрагмент ДНК фага X длиной 2000 нт. Второй центромерный сайт получали отжигом олигонуклеотидов IRspi и IRsp2 между собой и вставляли по сайтам Аде! и BssHLI. Плазмиды pG750, PG751 и pG75² получали на основе pG595> поместив полученный отжигом праймеров PRIR3-SexAI и PRIR3-BstBI инвертированный повтор в сайты SexAI и BstBl. Для изучения влияния длины линейной плазмиды на ее стабильность были получены производные всех использованных плазмид за исключением pG595* содержащие вставку ДНК фага X длиной 22 тпн в сайт BgHL В качестве контроля использовали кольцевую плазмиду pNCio на основе репликона N15 с одной центромерой в герА.

Плазмиды, используемые для определения внутриклеточной локализации линейных репликонов

Для изучения внутриклеточной локализации использовалась система с двумя гибридными флуоресцентными белками синего (Cfp::CI (cyan fluorescent protein fused to lambda repressor)) и желтого цвета (Yfp::TetR (yellow fluorescent protein fused to Tet repressor)), способными специфично взаимодействовать с сайтами связывания операторов лямбда (L-О) и Tet (Tet-O) соответственно (Lau et аі, 2003). При этом в живой бактериальной клетке образуются фокусы флуоресцентного свечения» соответствующие положению сайтов-мишеней в

лямбда (L-0 23 нт посяедогатетьности оператора, раздельные 5 ^ш ъ&ттшя)

но я изучить возможное взаимодействия цштромернш сайтов между шбои

Плазмйда*мишекь рЬ/ш' tss^j Ravm е( &f_v 20033_? приводящую к нарушений репликации щж %fC и позволяющая достигнуть ирм ірйіурьї от go до з?Х такого гостояшш* жогда ж клетке будет

Е (

жя вставлен инвертированный повтор, шмученпым отжигом двух примеров

вставлен по ш обі

cfp::i

,1 Ei ..J

С"-"-"

prafern

центршернш с#ит

а N15

центромерный еетт; МО array - набор Тй операторов; Ш - набор лямбда

,_ат!----₃ mavM

ыш белок.

Фрагмент ДНК фага X был клонирован в сайт Bgtll_t получена плазмида PDAG707, из которой Not! фрагмент длиной 27937 нт вставили в соответствующий сайт р0595^52 и получили линейную плазмиду мишень

pDAG7ii-

Для экспрессии Sop белков N15 использовали плазмиды PDAG242 (экспрессия SopA одновременно с SopB) и PDAG713 (экспрессия SopB), полученная из PDAG242 путем удаления последовательности гена sopA по сайтам Nsil и Расі, обработкой концов фрагментом Кленова ДНК полимеразы с последующим лигированием.

Плазмида pDAG7>9> использованная для экспрессии обоих гибридных флуоресцентных белков, была получена вставкой Nhel - Stul фрагмента длиной 1527 нт из pRFGii5 в сайт Hindlll с предварительно обработанными фрагментом Кленова ДНК полимеразы концами. Полученная конструкция содержит оперон, включающий в себя гены tetR::Yfp и cI::eCfp под контролем арабинозо-индуцибельного промотора агаРвло. Производные плазмиды pG7ii с одним (pG720) или без центромерных сайтов (pG72i) были получены аналогичным образом, за исключением стадии вставки инвертированного повтора в pG294-

Транеформация Е, coli

Для трансформации использовали стандартную методику (Sambrook et ah, 1989) со следующей модификацией: вместо буфера TFB использовали буфер следующего состава: [СаСЬ 50 mM, КС1100 тМ, МпСЬ Ю тМ, HEPES Ю тМ, рН 6.3].

Выделение плазмиднойДНК

Для выделения плазмидной ДНК использовали стандартные методики, основанные на щелочном лизисе (Sambrook et at, 1989)- Дополнительную очистку плазидной ДНК, в случае необходимости, проводили при помощи наборов Wizard Miniprep (Promega) или Qiagen (Diagen Gmbh.) следуя указаниям производителя.

Электрофорез ДНК

Электрофорез ДНК проводили в іхТАЕ - буфере с использованием агарозы производства фирм Chemapol и Sigma. В качестве маркеров для определения молекулярных масс фрагментов ДНК использовали Hindlll

рестрикционные фрагменты ДНК фага лямбда или GeneRuler DNA Ladder Mix

(Fermentas).

Определение активности sop промотора

Эксперименты проводили, используя штаммы pNSPoichr, pNSP04chr, pNSPo6chr и MCio6i/pNSP03, или тот же штамм, содержащий плазмиды, экспрессирующие различные регуляторные факторы. Бактерии выращивали в LB-бульоне при 37 С до ODboo = 0.2-0-4» активность р-галактозидазы определяли методом Миллера (Miller, 197²)-

Получение радиоактивно-меченых ПЦР фрагментов

Фрагмент ДНК N15 длиной 200 нт,, содержащий промотор sop оперона, был получен с помощью ПЦР с использованием праимеров РКз и PR24-Контрольный ПЦР фрагмент длиной 143 ^ ^не содержащий N15 Psop, был получен при помощи ПЦР с использованием праимеров PR24 и Fi8, и ДНК плазмиды pNR-S0E3 (Ravin et al.₉ 2003) в качестве матрицы. Оба фрагмента были очищены с помощью электрофореза в агарозном геле, концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически.

Для получения радиоактивно-меченых зондов і пмоль ПЦР фрагментов обрабатывали Т4-полинуклеотидкиназой в присутствии 5<эмк Сі у-з*Р АТР, следуя указаниям производителя. Очистку ПЦР-фрагментов от невключившегося изотопа осуществляли посредством двухкратного переосаждения этанолом.

Анализ транскриптов методом Northern blot и primer extension анализ

Выделение РНК, Northern blot, primer extension анализ, приготовление радиоактивно-меченых з*р олигонуклеотидов и гибридизация проводились по методике, описанной ранее (Ravin et al_r 1999)- Меченые зар пробы специфичные для sopPi и sopP2 фрагментов были получены с помощью Prime-a-Gene Labelling kit (Promega). Праймер PR48 использовался в синтезе радиоактивных меченых проб для primer extension анализа.

Анализ транскриптов с помощью ОТ-ПЦР

Выделение РНК для ОТ-ПЦР анализа производилось как описано в работе Ravin et aL, 1999> за исключением того, что образцы РНК были

дополнительно обработаны RNAse free DNAse (Promega) и очищены с помощью набора QIAGEN RNA Easy Mini kit no прилагаемому стандартному протоколу производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили следующим образом: один микрограмм РНК инкубировали в 50мкл MMLV буфера с 400 единицами MMLV reverse transcriptase (Promega), 4мкг случайных хексадиоксирибонуклеотидов и 0,2 мМ dNTPs в присутствии 2 единиц RNAsin (Promega) в течении одного часа при 37С, Затем добавляли десять единиц Т4 DNA ligase и инкубировали 20 минут. Реакцию останавливали нагреванием до 65С и хранили при -20С. Разведения полученной кДНК использовались в качестве матрицы для ПЦР с использованием двух пар праймеров: PR28L+PR1 для амплификации кДНК транскриптов, начинающихся только с Р2 (фрагмент 452 нт, FRi), и PR28L+PR28R для амплификации кДНК, полученной как с Pi, так и с Р2 транскриптов (фрагмент зібнт, FR2). Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и окрашивались этидиум бромидом. Фрагменты не были получены в контрольном эксперименте, когда обратная транскрипция не проводилась. Это служит доказательством того, что полученные продукты ПЦР не являются результатом загрязнения препарата ДНК N15-

Для изучения активности промоторов sop оперона при литическом развитии использовали тот же набор праймеров и условия реакции. Использовали лизогенный по N15 штамм DHioB(Ni5)/pBAD24__3i, индукция гена З¹ с помощью 0,1% арабинозы приводила к инактивации главного репрессора и началу литического развития профага. Образцы РНК выделяли из культуры, отобранной на различных стадиях лизиса (точки: о мин.; ю мин.; 50 мин.; 6о мин. с момента индукции).

Изучение влияния Sop белков на число копий плазмид.

Штамм DHioB содержал линейные плазмиды на основе решшкона N15, не содержащие sop оперон: PG59^{1 с} центромерным сайтом в пределах гена герА или pG595 с инактивированным центромерным сайтом. Влияние Sop белков N15 на число копий изучали, экспрессируя их конститутивно; pZS2i - «пустой» вектор в качестве контроля, pDAG242 - SopAB, PDAG713 - SopB и PDAG408 -SopA. Препараты ДНК выделяли из ночной культуры, кольцевые плазмиды линеаризовывали с помощью NotI, не имеющего сайта в линейных плазмидах, и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Об изменении

числа копий судили, сравнивая интенсивности полос, соответствующих изучаемым плазмидам, с интенсивностью полос, соответствующих референсным плазмидам (pZS2i, pDAG242, PDAG713, PDAG408),

Получение белковых экстрактов

Культуры DHioB/pUC9 и DH10B/PNR213 (pUC9 с клонированными N15 sopA и sopB генами) выращивали при 37С на качалке до СГОбоо=о.з,вносили ИПТГ до імМ и продолжали выращивание в течение следующих з часов. Клетки в количестве, соответствующем юмл раствора СЮбоо=2.о, собирали центрифугированием и ресуспендировали в 450 мкл раствора юмМ Трис рН 8.0, і мМ ЭДТА, юо мМ NaCl, 20% сахарозы. Белковый состав бактериальных культур анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (Sambrook et at, 1989; Watson, 1972).

Для получения препарата белков клетки лизировали, путем внесения лизоцима (0-4 мгр/мл, 15 мин инкубации при +4С) с последующей обработкой ультразвуком. Клеточный дебрис удаляли посредством двухкратного центрифугирования при i4000g в течение 15 мин при +4С.

Концентрацию белков в супернатанте определяли при помощи BioRad Protein Assay Kit (Biorad), следуя указаниям производителя. Полученные препараты белков разводили до концентрации 400 мкгр/мл в реакционном буфере, содержащем 50мМ HEPES-KOH (рН=7-5)> 50mM NaCl, ютМ MgCl_2j 10% глицерина, юо мгкр/мл бычьего сывороточного альбумина, юо мкгр/мл ДНК спермы лосося, и і мМ дитиотритола.

Взаимодействие фрагментов ДНК с белковыми экстрактами

Реакции связывания in vitro проводили, смешивая по 0,01 пмоль опытного и контрольного фрагмента ДНК с 0,125 мкгр, о.25мкгр, 0-5 мкгр, і мкгр, или 2 мкгр. белкового препарата, полученного из DHioB/pUCg (пробы 1-5) или DHioB/pNR2i3 (пробы 6-ю) в ю мкл буфера, содержащего 50мМ HEPES-KOH (pH=7-5)i 5oniM NaCl, ютМ MgCl_s, 10% глицерина, ЮО мкгр/мл бычьего сывороточного альбумина, юо мкгр/мл ДНК спермы лосося, и і мМ дитиотритола. В контрольных экспериментах смешивали 2 мкгр белкового препарата DHioB/pNR2i3 с Psop фрагментом (проба и) или контрольным фрагментом ДНК N15 (проба 12). Реакционные смеси инкубировали при +30С в течение 15 минут и анализировали с помощью электрофореза в 5%

полиакриламидном геле. Электрофорез проводили в ТВЕ-6уфере₃ по окончании электрофореза гель переносили на лист ватмана DE8i, высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой.

Определение активности Ptel промотора

Эксперименты проводили, используя штамм DHioB/pZS-Ptel или тот же штамм, содержащий плазмиды, экспрессирующие TelN. Активность Ptel промотора также измеряли в лизогенном по N15 штамме, DHioB(Ni5)/pZS-Ptel. Бактерии выращивали в LB-бульоне при 37С в течение 12-16 часов до достижения ими стационарной фазы (ОВбоо = 1*0 - 2.0), активность (3-галактозидазы определяли методом Миллера (Miller, 197²)-

Определение эффективности трансформации

Эксперименты по определению эффективности трансформации проводили на штаммах МСюбі {hsdR araDi39 Д (агаАВС-1еи)7б79 A fiw)X74 доШ galK rpsL thi) и DHioB (araDi39 А (ага, hu)j6g7 A lac)X74 galU galK rpsL deoR ф8о lacZ AMIS endAi nupG recAi mcrA A mrr hsdRMS mcr ВС)) . Компетентные клетки готовили согласно (Sambrook et al., 1989) с использованием буфера (50 mM СаСЬ, юо тМ КС1, ю тМ HEPES, і тМ MnCU). Стандартные трансформационные пробы включали 200 ^1 компетентных клеток и од jig, 0,01 \i% или o.ooi (ig плазмидной ДНК.

Флуоресцентная микроскопия

Для получения четких фокусов флуоресцентного свечения в клетках ночную культуру выращивали при 30С, разводили і:юо, выращивали до оптической плотности ОВбоо = 0-2. Индукцию экспрессии гибридных флуоресцентных белков проводили путем добавления в среду ОТ 0,005% до 0,0005% арабинозы и последующего инкубирования в течении зо минут. Экспрессию останавливали добавлением в среду равного количества глюкозы (0,005 - 0,0005%), затем кулыуры выращивали еще в течении двух часов. Для получения одной копии линейной плазмиды в клетке ночную культуру выращивали при 30С, разводили в юо раз и выращивали при 37С без канамицина в течении 4 часов. Индукцию экспрессии гибридных флуоресцентных белков проводили аналогичным образом. Культуру клеток

-зб-

объемом 10 мл концентрировали центрифугированием и ресуспендировали в 1,5 мл. Отбирали з мкл для нанесения на предметное стекло со слоем агарозы (і% агарозы, ю% LB) или на предметное стекло Polysine (Polysine Microscope Slides), фиксировали покровным стеклом. Цифровые изображения получали с помощью микроскопа Olympus IX 81 с хюо объективом, соединенного с фотокамерой Roper Coolsnap HQ (Olympus Corp.). Фотографии получали и анализировали с помощью пакета обработки изображений MetaMorph Imaging System v6.3- Для внутриклеточной локализации флуоресцентных фокусов совмещали желтый и синий цветовые каналы с изображением мембраны клетки, сделанным в белом свете. Расположение фокусов в клетке рассчитывали, измеряя расстояние от полюса, принимая значение одного пикселя цифрового изображения равным 0,064 мкм. Контроль специфичности образования фокусов проводили в культуре клеток, не содержащих плазмиды-мишени с сайтами связывания флуоресцентных белков. Влияние Sop белков N15 на положение фокусов в клетке изучали, введя плазмиды экспрессирующие SopA+SopB (PDAG242) и SopB (pDAG7l3)-

Определение скорости потери линейных плазмид

Стабильность наследования линейных плазмид, основанных на

репликоне Ni5> изучали, определяя скорость их потери в процентах на

генерацию. Оценивали долю клеток, сохранивших устойчивость к антибиотику

при выращивании в среде без селективного фактора, используя стандартный

метод реплик на чашках (Ravin and Lane, 1999)- Эксперимент начинали с

колоний трансформантов, содержащих исследуемые плазмиды. Ночные

культуры, выращенные с антибиотиком, разводили в юз, ю⁶ раз в LB бульоне

без антибиотика, далее выращивали до стационарной фазы и определяли

фракцию клеток, содержащих плазмиду. Для этого культуры рассевали на LB

г* агаре, не содержащем антибиотик, и делали реплики на чашки антибиотиком.

Разведения и выращивание повторяли для того, чтобы получить культуру

клеток от 10 до 100 генераций- В эксперименте по изучению стабильного

наследования в присутствии Sop белков использовали плазмиду pDAG2i6

(Cm+), во всех случаях сохраняя для нее селективный фактор (хлорамфеникол).

Скорость потери линейной плазмиды на одну генерацию (L) определяли по

формуле % L = і - (Ff / Fx)¹^ х 100 где - Fj фракция клеток, содержащих

плазмиду первоначально, a Ff, - фракция клеток, содержащих плазмиду после роста на протяжении N генераций в неселективных условиях.

Для демонстрации того, что sop оперон N15 обеспечивает именно сегрегационную стабильность, а не увеличение числа копий нлазмиды вследствие активации репликации, число копий исследуемых линейных репликонов определяли количественно, сравнивая интенсивности полос линейной и контрольной плазмнды в агарозном геле. Выделенные препараты плазмидной ДНК анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Относительные интенсивности полос на цифровых фотографиях определяли с помощью программы TINA-PCBas или TotalLab v.2,oi и определяли отношения интенсивности полосы, соответствующей тестируемой линейной плазмиде» к полосе, соответствующей стабильной корезидентной плазмиде pBR322, принимая во внимание длины плазмид и долю бесплазмидных клеток, В результате определяли относительное число копий тестируемой плазмиды относительно PBR322, число копий которой постоянно и не зависит от экспрессии Sop белков.

Результаты

Регуляция экспрессии sop оперона N15

Структури sop оперона плазмиды N15

Sop локус N15 расположен в районе правого конца линейной плазмиды (Риси). Оперон включает два гена, sopA и sopB, имеющих 75% и 49% гомологию по аминокислотным последовательностям с соответствующими генами плазмиды F. Участок длиной около 150 нт, предшествующий sopA, также гомологичен соответствующему району плазмиды F и содержит промотор sop оперона, Pisop, (Ravin and Lane, 1999)- Этот район содержит 5 копий последовательности CTTTGC, разделенных А/Т богатыми участками, причем эти повторы перекрывают последовательности -35 ^и ~Ю sop промотора (Риси), Соответствующий фрагмент плазмиды F содержит 4 копии последовательности CTTTGC, расположенных аналогично четырем из пяти соответствующих последовательностей N15» В отличие от F Psop_y промотор sop оперона N15 содержит сайт связывания бактериального белка IHF (integration host factor). Для плазмиды F было показано, что SopA репрессирует Psop, причем величина репрессии многократно увеличивается в присутствии SopB. Более того, Sop белки N15 способны репрессировать F Р$ор_} хотя и в меньшей степени, чем собственные белки плазмиды F (Ravin and Lane, 1999)-

Последовательность длиной 448 нт от правого конца линейного профага N15 ДО начала гена sopA содержит уже известный промотор Pisop (Ravin and Lane, 1999). Транскрипция, инициируемая с этого промотора, ретулируется белком SopA. Последовательность длиной 380 нт перед этим районом не имеет гомологии с последовательностью F, причем компьютерным анализом было предсказано возможное наличие пяти потенциальных промоторов (Ravin et ah, 2000; Grigoriev and Lobocka, 2001), однако существование ни одного из них не было доказано экспериментальным образом.

ААМ&ССЄАСАТАСвТШветСТТП

РШ "' """--<, "—,

pww pMwm. "" _ч < да

Йй-

а^^ лер оВ Km Шс

,Jgggj _{,щ W,. ^S| J""*T&4 $.щ ад де;

- з:" ї^Ш &йжш- яш&йШФ ЬтпвШі&з' шт&Шй. &№шш&$ шзі&тг&б ькнитъят м^шжї №шш&?

-SDffl

тїїїтйт^її^ хзтотаета таждеаьт з

^4$

«в їлліайі^г г:^зз!шаый аяййал&йля? т^оттаод стгддагїї^

|.v/₅;i

Рисунок 10. Вор район бакхермофага N15 и ршортерные шшмвды А, Участок генома м районе правого конца лїшєйшго ирофага (развернут, чтобы доказать шїірашеїше тршс&ршщии слева шдршюХ поїшжна ковалентно замкнутая тежшера (tdR% Пршвдуголъшшамй отмечен $ор оперон и ген й6. Ті обозначен терминатор транскрипции* ft и Р2 обозначены ршуліірудаьш промоторы, шуч&ешж в натмщей работе; sopO оіраншчЕмгґ район операторов* представленный четырьмя CTTTG мотивами (тжаашы стрелками). Rl_P R2_S S3 шответетаушт сайтам связывания протеломеразы iosRi_? tmRa и i&$R. $$рР$* $орР2 в ЯорР - у частіш «нома Ш& ішошрдаашзьш в репортерам векторе pR$g5&-

Ж Лшеншш репортериав плазмвда pNSPcQ. Ant - оперон антиреиресетра (гены $o_f antA* 3$ сшш на право); тр - район репликации {гены 3 34* 35* $6* герА) і'Ж - огждаюі ршрйсспр фага; Km - газ устойчивости к кашшшщну; lac - лашетннй опарой (гены fca&FZ ориентированы сдева па право)-С- Псмжвдов&теншоеть щтіттдт Sop района соответствует мущвдтадам с 24802 по 24269 генома фага №& включает в себя известный район $ор$Ъ ш находящуюся даред шиш область $арРй (отменено ршштш}. Сайты ишцшцш транс&ршнри* обнаруженные а атой работе (TR 3 З, 4І отмечены стрепшшм. Области -35 и -ю соотаетсгаутщик оромотров показаны пунктиром. Последовательность Shine-Balgarno и s* кшщ юрА отменены рамкой (SD) g пщвлоты серым* «ответственно, Дмшная сгрелш показывает досдедовйтельїюстї* пранжра для ПІД? (Р1Цё и РІІ23ВД и primer e^teo^ioa анализа (PR<|8)* Ко|кянже стретш ожйражашт OTTG сайты свюывавив лс^й.

Помимо оотанциальныж промоторов этот регион содержат три повтори

может взаимодействовать фермент ггротеломераза, отетстешимі т

ага {ішюш

1 *УУУЛ

9 4 Е

І?- -Г?К* .-,1 -,

w. cgtwswh" Асде^зв^ хтй*»вш сх&шж^т ;i:?ir~4L.w. ^^a^L^SIP^^^ ct;.v4^b: с

%Qk %<>№ШГ-Ж ВД/ІШ^А ^ГУ*Ш*№"& І'і'Лі.ТТСІГ МСЖЛТГГ ЭДГ&ЗГЗТЖ Ті'.ЇТаГҐТТЙ. ^/buimw

И*3

&і ' І"'.'¹¹' ^.

-.{.:ьж а^чймі-'і^ЙІ^р-ій^сй^ см^тг.гж^й^^^

г-АТТТТі=Г

№#Ш'1 І

."Т^ЯГТУГЯ йЪ^ГТУИ*

уїштїясг оздйай№і №.ы;г.и-« .'.VyisA

д*т решшішц&ш а сга&шшюго вдедодощшнл шшзюідвого нроцшга; on - точка

посяедшателшоети sop района Nig (соответствует sopPi на Рис. ю) и пл&змвды F. -35 и -ю

гы souA газов вк

ж счет сшізьшшїші с ним ЗорА (РагА)_? причем в случае F Psop SopA защищает CTTTG повторы от расвдетдения де$оксіірвбоеуюі«ой щ №Ш* ?шее было пощшшо (R&vm авд I-аве, 1999)з ^то в случае His SopA белок также шшсобш

репрессировать промотор тр отгона («юта. участку дарР і в обозначении згой работы). Мы адед&ли предположение а тощ что эта репрессия достигается связывание^! Sop бшжов с CTTTG - операторами в промоторном уч&ат №&адр- Для проверки этой гапотезы вами был жіюлшовш метод задержки в гале. В качестве источника Sap белков мы использовали бактерии штамма DHioB, содержащие плашвду рККаїз {Ravin & aL> 2003}- Эпга тжжтт ііредсшушет вдбой р^шмбиншзетый вектор рИС9₉ в мотором кдомнрошшы гены трА и ворВ, Их транскрипция осуществляется с Pfoc промотора веггара, транскрипция которого может быть индуцирована с помощи* ЇРГС* При этом уровни зкепржии белков достигает 1-5 общего &ж& но ,?щнным электрофореза в пошакриланидном геле в присутствии SDS (данные не оредегашіеньї). Экшершенты по задержке в гете нроюдилв с использованием белковых экстрактов^ полученных из иіщуцироішшзж с помощью 1РГО щлшур ВНюВ/pOCg (<щтщ<тьыы& коїщкшь) н ВНюВ/рКЖахз {N15 SopA и SopB). Полученные результаты {Рис, 12) еввдеттаствуют о специфическом йттттшш Шв SopA н/или N15 SapB с фрагментом ДИК Nig, содержащем

SopAB {-)

8орА8{+)

6 ? 8 9 10 11 12

...,^ -,^^-

Ртр-

FwmymoK і2. Смзьшаше Sop белков cPisap їп шїто.

Злe&fpoфQpз продуктов взаиввсдойсгвшй белкошк зкстрздаад о фрагментами

ДНК в $% потщжіштщит геле. Дорожкн 1 * шашодейсгше о.оі шюяь шеси Pisop и контрольного фрагмента ДНК є 0Л2д мкгр, о/г^шжгр, 0,5 ^жгр_: і мкгр, шт % ткгр>_? шзтеетстаеннОг белкового экстракт* полученного из DHioB/pUCg (SopAB-J. Доровдся 6-го - то же wtq ш да дорожкаж 1-& но белковый препарат был талучев из DHwB/pNRl23 (SopAB+), Дорожим и ж I2_f -і*ааамидейсгайе а мкгр белкового зкшракта из DHloB/pNRl23 с 0.01 пмодь Pisop фрагмента иле контрольного фрат&ата, соответственно.

-4й-

Идентификация промоторов sop оперона N15 и анализ соответствующих транснриптов.

Чтобы установить, существуют ли в районе между sop генами и правой теломерой N15 другие промоторы помимо уже известного Ply был проведен Northern blot анализ РНК (См. Рис. із). Для получения транскриптов использовали плазмиды pNSPoi и pNSP04, содержащие гены lacZYA под контролем промотров sop оперона N15» первая из них несет весь изучаемый район sopP_t а вторая - лишь фрагмент sopPi (См. рисю). Транскрипты, получаемые на плазмидах pNSPoi и pNSPoi имели длину более 5тпн, что не позволяло точно определить их размер с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Для уменьшения длины транскрипта и повышения разрешения электрофореза непосредственно после промоторного фрагмента в вектор был вставлен терминатор Ті sop оперона. Полученные плазмиды pNSPoiT и pNSP04T использовали как источник специфичной sop-району РНК с предполагаемым размером от 145 нт (расстояние между стартовым кодоном sopA и Ті) до 620 нт (от левого конца sopP фрагмента до Ті) соответственно. Из штамма МСіОбі, содержавшего плазмиды pNSPoiT или pNSP04T_? или пустой вектор pR355i, выделяли РНК, разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с радиоактивно-меченными пробами ДНК, покрывающими sopP район. В результате были получены несколько специфичных фрагментов. Транскрипт TRi размером 170 +/- ю нт выявляется гибридизацией с последовательностью sopPi, но отсутствует при гибридизации с sopP2, таким образом можно сделать заключение, что он соответствует уже известному промотору Pi. Три других фрагмента (TR 2, % 4) присутствуют в обеих пробах. Полосу наибольшей интенсивности образует транскрипт TR2 длиной примерно 520 нт, предполагаемый промотор которого представлен TTGCAT (-35) и TATGGT (-ю) последовательностями, находящимися по обе стороны от tosR2 сайта. Оставшиеся две интенсивные полосы имеют длину от 520 до 620 нт (TR3 и TR4). Все остальные фрагменты размером более 620 нт, что превышает длину предполагаемого максимального транскрипта, ограниченного Ті и может быть объяснено неполной теминацией транскрипции в сайте Ті. Таким образом, полученные данные показывают, что район, предшествующий промотору Pi, является транскриптционно активным.

Для точной идентификации предполагаемых промоторов в пределах sopP2 района с помощью реакции primer extension были определены положения 5' концов РНК, Препараты РНК выделяли из культуры, содержащей плазмиду pNSP02 (производная плазмиды pRS55i? включающая весь sopP район) и использовали в реакции primer extension с меченым праймером PR48, комплиментарным району предшествующему 5* концу sopPi (См, рис- ю). После разделения в геле полученных фрагментов была локализована интенсивная полоса в положении -365 относительно нуклеотида «А» в стартовом кодоне sopA. Эта полоса соответствует транскришу TR2, начинающемуся с нуклеотида «А», как показано на рисунке т. Это согласуется с расположением Р2 промотора, идентифицированного Northern blot анализом. Кроме этого были получены дополнительные две полосы меньшей интенсивности в положениях - 399 ^и "4²6> вероятно, соответствующие транскриптам TR3 и TR4, обнаруженным в Northern-blot экспериментах (Рис. 13А). В обоих случаях были обнаружены последовательности с умеренной схожестью с каноническими -ю и -35 промоторными мотивами в свойственных им положениях относительно стартовых точек (Рис. ю).

. . -#-

281—^

^

160-*

Рисунок 13-

1 И 2),

е^ротшми. Старшо ж

TR2, TR& ТІЦ>

Меченный пртймер PR48 отжигали с РНК ужкаъ) шши

мРНК указаны относительно 4-і положения яА» is стартовом кодоие sopA.

. С втш целью фрагменты ДНІ N15 (mpP-h &>рРв тли sopP)

et ah, 19B7). В іїолучеішме штаммы вводили ішшіидьі₅ жслреееирушщие гены Nig, &РВД

"45"

в репортерных штаммах, в присутствии этих плазмид, можно судить о влиянии тех или иных регуляторних факторов. В эксперименте исследовали влияние следующих генов N15: sopA (отдельно и совместно с sopB), telN (протеломераза), сВ (репрессор, аналог гена сі фага лямбда), antA (антирепрессор) и герА (репликаза). Результаты эксперимента представлены в Таблице і.

Таблица 1.

Активность бета-галактозидазы в штаммах, содержащих репортерные конструкции sopP:

MU - единицы Миллера,

W присутствие в клетке не содержащего вставки вектора не изменяет уровень

активности бета-галактозидазы более, чем на ю%.

W В пересчете на одну копию плазмиды. Исходное значение, 5030 MU, было

пересчитано с учетом на число копий pNSP03 и фракцию бесплазмидных

клеток.

н/у - не установлено

н/п - не применимо вследствие того, что плазмида pNSP03 уже содержит

гены этих регуляторных факторов и не совместима с профагом N15.

Было установлено, что в отсутствии репрессии промотор Pi значительно слабее Р2 и примерно в семь раз менее активен, нежели суммарная активность всей промоторной области sopP, что согласуется с результатам Northern blot анализа,. Подобно промотору Psop плазмиды F он незначительно репрессируется белком SopA, но эта репрессия существенно увеличивается в

присутствии SopB. Ни один из других регуляторных факторов N15 не оказывал эффекта на Pi, слабое снижение активности в присутствии сВ можно объяснить неспецифичным влиянием, поскольку последовательность sopPi района не содержит известных сайтов связывания сВ (Lobocka et al.₃1996).

В тоже время, промотор Р2 оказался нечувствительным к репрессии Sop белками. Подобный результат был ожидаем вследствие того, что sopP2 район не содержит характерных сайтам связывания белка SopA мотивов. Вместе с тем, было установлено, что Р2 сильно репрессируется (более чем в 500 раз) протеломеразой N15 TelN, а другие регуляторные факторы не оказывают влияния.

Репортерная конструкции содержащая весь фрагмент sopP, позволила выявить более сложную модель регуляции sop оперона. Мы установили, что промотор sopP2 проявляет большую активность, чем sopPi, однако присутствие протеломеразы может снижать транскрипцию со всей области sopP лишь в два раза. В тоже время, присутствие обоих Sop белков не снижает активность бета-галактозидазы. По всей видимости, транскрипционный комплекс, двигающийся от промотора sopP2_f способен смещать SopA белок с сайтов связывания, распложенных в области промотора sopPi, и таким образом устранять вызваннзпо им репрессию sop оперона, В подтвержение высказанного предложения говорит тот факт, что одновременная экспрессия TelN и Sop белков в клетке приводит к существенной репрессии (примерно в 20 раз) транскрипции sopP.

Для проверки справедливости сделанных выше выводов также и для профага в его естественном состоянии линейной молекулы, была создана линейная репортерная плазмида с геном tacZ, получившая название pNSP03-Между геном sopA и концом профага эта плазмида содержит в точности такой же район, что и в N15, но гены sopAB были заменены на lac оперон. (См. рис. ю В), Таким образом, полученная плазмида pNSP03 несет ген telN, но не содержит sop генов. Было установлено, что штамм MCio6i/pNSPo3 производит немногим меньше бета-галактозидазы, нежели эквивалентный sopPi штамм. Промотор в значительной степени репрессирован протеломеразой, но дальнейшей репрессии дополнительным количеством TelN не происходит. Наиболее очевидным объяснением полученных результатов является то, что Р2 промотор в pNSP03 уже полностью репрессирован при естественном базовом уровнем протеломеразы, в то время как Pi остается активным. Простой тест по

определению уровня репрессии Р2 белком TelN не представляется возможным, вследствие необходимости этого белка для поддержания линейной плазмиды в клетке. Полученные данные показывают, что активность и механизм регуляции промотора Pi сходны для линейных и кольцевых векторов и согласуются с существенной репрессией протеломеразой TelN промотора Р2 в обоих типах молекул. На основании результатов этого эксперимента можно предположить, что регуляция sop оперона не связана с топологическими особенностями ДНК, такими как суперскрученность. Вероятно, в лизогенном состоянии Р2 промотор постоянно репрессирован TelN, а большая доля экспрессии sopAB происходит с неполностью репрессированного Pi промотора-

ОТ-ПЦР анализ тпранскриптпов sop оперона N15

На следующем этапе работы была поставлена цель установить - какой вклад вносят оба промотора sop оперона в его транскрипцию в лизогенном состоянии и на различных этапах литического развития фага N15. Для этого из штаммов, содержащих профаг N15 или pG59i* производную мини-плазмиды на основе N15, не содержащую большую часть последовательности sopAB генов (эквивалент pNSP03, но без lacZYA), выделяли тотальную РНК и анализировали ее с помощью ОТ-ПЦР, Полученные амплификацией фрагменты разделяли с помощью электрофореза (См, Рис, 14).

Были использованы две пары праимеров: первая (PRi и 28L) выявляла фрагмент длиной 752 нт (FRi) специфичный для РНК инициируемой с sopP2, в то время как вторая (28R и 28L) - фрагмент (FR2), являющийся продуктом реакции с РНК, инициируемой с обоих фрагментов sopPi и sopP2. Равное количество продукта, амплифицируемого на ДНК N15 в качестве матрицы, демонстрирует, что подобранные две пары праимеров работают с одинаковой эффективностью (Рис 14 С).

A 2 3 4 5

FR1-

fR2-

F«1-

С 1 2 З

FR2-

FR1^ FR2~

Рїіеунок 54ОТ-ПЦР акшшз траяекрішіт

1. Электрофорез юрїщетов ШЧГЩР, шяучшньнс с нраймером PRi із 2UL (FRi) шли 28E. її 28L {FR2)₃ В реакции истолковала^ РНЕ₃ выделенная из штамма DHioB/pGs9b Кшшадешо матрицы для реакции 1-5. 4 икг* 1₅33 піп, 0,-14 пкг_? 0Д5 tikf и о,од п&г исходной РНК соответственно СЗ'^ кратное р$$вдеіївді

2. Аналогично А^ РНК выделана на штамма DHioB/Ni5- Количество матрицы д;ш ре&кщш; ш їШ¹* 44 пет* ^5 &кг, 4*9 нкг н 1,6 іш⁽ свадй РНК гашдагегшщно (3*-& кратаые раэюдешя)*

(C) Зленггрофорез нродуїшш ЇЇЦР., полученных на матрице ДНК фага Hig₃
дорожки 1-5 соответствует шятжщтоту рааведшиш ДОК матрицы.

Полученные результаты (Рис, 14) іюішзшаїот, что тршіекршіх, инициируемый с оромшра Pi_s составляет более 8о% всей РНК* производимой $ї>р оперетам в клетае, содержащей йрофш* Nig (?ш& щ В). Этот результат шотеотетаует данным об уровнях транскрипции lacZ иод контролем рафесеяроюняого промотора (См- Т&бладу і); 8 единиц (0,00017 х 459$ ^д) активности бета-галаггоаидазм і случае 1 щ единицы (0,016 х 1513 ^еД) Д#я Л* В ішешах, содержащих шшииду pG59^ («ть геи 1еШ, во нет генов sopAB), траве&рихгга шшциируежк с Рі, «егашшот еще большую долю в общем кттшт РНК вдр операнд я именно около 95 0*и& ц А)* Полученные данина тадтмрзіедашт предположение о том> что Рй практически полностью ршресшровая базовым урошшш TdN, в to время как Pi остается а&ташьш в отсутствии Sop белков (pGsp) шт частично ими репрессируется (орофаг N15) >

ЦішїзіЮ следующего этапа работы бдао установить, как нроиащнт регулжцил sop промотора при жштчяшж развитии, В зкенеримен'ш жпояьтштш дтшттъш но Nig штамам содержащий вектор pBA024_Ji₃

несущий ген зі (антиредрестер) под ттрожт шздуцирушот арабздашой промотора агаРвда Индукция промотора арабивозой приводила к активации mtmcmavo развитая профагд- Чйрш определенные промежутки йршени с момеїїта начала индукции отбирали образцы культуры? выделяли суммарную РНК и использовали в ОТ-ПЦР ашшш* Проекты ОТ-ШДР получали опжтпьт выше шоеобом и аи&дширов&ш с помощью эяеетрофореза в агаршном imfte (Рис, 15)- Фрагмент FRi является специфичным для РНК, инициируемой с $орРй_: в то время как FR& явладея п|юдуктом реакция ОТ-ЩР с РНК* инициируемой со всей драмохороеой области sopP.

Рисунож *5^ ОТ-П1 \ анализ транскриптов при дитнадском развщтта.

Элсетрофореа продуктов 0Т4ІЦР, полученных с праймером VRi и 28L (FRi) шш 2BR и 2EL (FR2), В р^йкцши использовалась РНК, выделенная из DHioB(NigJ/pBAD24__3i штамма. Ш дорожзш 1-8 показаны проекты, шлучтвыъ последовательным пятикратным разведением исходной матрицы РНК {изначально в реакцию бр&лв матрицу разведенную в 27 раа - дорожка 1% А₃ В_} C_s D шшжжгаует пробам, отобранным ш яизошшом состоянии и поете ю* go и 6о минут после ішдущет литаадс&ош р&здвдия щфчяовой. Щ панели 1) - исходная матрвда РНК была разведена в 6у раз - дорожка і.

Полученные результаты (Рие43 позволяют сделать предположение, что в дродесю лтпчетою щтжтп происходит актимцкя s&pPs? ранее репрессированною протеломеразой. 06 этом свидетельствуют данные об активностях прешотарныж облдаей sopPe и трР после индукции литинтекого развития. Если в лиэогешюм состоянии вклад промотора $орР& невелик (Рис, 15 А) ш сравнению с общим уровнем экспрессии* то через один чве с момента начала лтшческош развития количество синтезируемой РНК_? соответствующей обоим фрагментам, становится ржшмм (Рис. ig В). Подобный

результат может говорить о снятии вызванной TelN репрессии с промотора sopP2,. Такой механизм регуляции sop оперона протеломеразой можно объяснить тем, что на поздних стадиях литического развития активность протеломеразы каким-то образом блокируется, поскольку в противном случае этот фермент разрезал бы линейные фаговые молекулы, готовые к упаковке в вирионы.

Регуляция экспрессии гена протеломеразы бактериофага N15

В предыдущем эксперименте было установлено, что протеломераза N15 может репрессировать Р2 промотор sop оперона и, как следствие, может участвовать в регуляции процесса сегрегационной стабильности линейной молекулы профага N15. Поэтому на следующем этапе мы изучали механизм регуляция экспрессии гена протеломеразы и то, какую роль этот фермент играет в стабилизации концов линейной ДНК.

Структурная организация промогпорной области гена протеломеразы

Ген протеломеразы tetN расположен в районе левого конца линейной плазмиды (Рис. 14 Б). Анализ нуклеотидной последовательности между левой теломерой telL и telN геном показал наличие характерных - 35 ^и -Ю последовательностей а⁷⁰ промоторов Е. сой. Нуклеотидная последовательность между соответствующим промотором Ptel и стартовым кодоном telN содержит сайт связывания рибосом. Помимо промотора, район, предшествующий telN, содержит три последовательности, tosLij tosL2₉ tosL3 (консенсус taacAgaACA), перекрывающие районы -35 и -ю Ptel (См. рис. іб)- Предполагается (Rybchin and Svarchevsky, 1999)» что эти последовательности участвуют в связывании протеломеразы с теломерами.

teC3

201 дам^

Риеушж їй* Нуклсотадншї иоследоплтелыюсть промсгторной оЄшасш гена зіротетоадеразн.

Нумерация нуклеотидов начинается от левого конца линейного шшзмждиого профага* -35 и -ю районы промотора показаны пунктирными яиїтятт* їїа&іштп№\ь湴ь* использованная в качестве іїромо'Юра в экавдримштах є репортаріЕьш гепом, ограничена мыогаугалшшшм* Показана іїродедоштелшоеть предполагаемого сайта связывания рибосом, тамидогачная 5' концу i6S рибосомной РНК (строчные букве, комплементарные гауклеотады шкаваны вертикальным штрихами). Поеледоватеттеостъ гена протеломеразы ft* W шделеїш серым ЦЙЄЇОМ.

Ршщжцш экспрессии пралштвра протвл&меразы

Для атаіерммонтадшого нодиерждешя а&тшшоетн предсказанного промотора Ptel и исследование механизма регуляции его экспрессии, нами был иеролшоэдн метод репортсрвого гена. С згой целью фрагмент ДНК N15? содержащий Ptd (от -175 ДО "^ ит относительно «A» a ATG кодоне гена івШ), был клонировав в траяск^шдисяшом репортеркою векторе pRSs5i (Зїшаш et aL, t$87) на s' конце геиа бета*талаггозвдазы, focZ, ІШ долу^ешя реіюрхерш>ге вектора, имеющего строгай контроль чиста шешй и совмесгаммога с шшзмид&ми, использованными ддя жспресши белков №ff₃ мы заменили ишольздшннніі в pRSss^ ретшикон PBR322 на решшшн р8Сюг. Полученная плазмида, pZS-Ptel, была использована а последующих экспериментах во измерению жтшшосга Ptel промотора» За уровень жгашшеш промотора принимали количество синтезируемой с его помощью Р-гллащтемдшш* активность которой определяли с помощью метода Миллера (Miller, 1972)-

Полученное результаты (Табл. 2) иодтверждшох ншшадс проштарвов активности е исследуемом фрагменте. Поскольку фрагмент содержит только одам набор -35 ^{ш ш1} конешеуетыж госледоватетаноетой, мм предполагаем, что теш протеломеразы транскрибируется е единичного промотора.

Таблица 2. Регуляция промотора протеломеразы.

(і) Среднее из 6 независимых экспериментов, погрешность измерения не превышает 10%.

Поскольку район Ptel промотора содержит предполагаемые сайты связывания протеломеразы, мы предположили, что она контролирует активность Ptel, репрессируя его. Для определения влияния TelN на активность промотора в штамм DHioB/pZS-Ptel вводили плазмиды, экспрессирующие протеломеразу, В качестве таковых были использованы pJDioi, конститутивно экспрессирующий TelN (Deneke et ah, 2000) и линейную плазмиду pNSPoi, основанную на репликоне Pi и содержащую ген telN под контролем его собственного промотора Ptel (Ravin et al., 2001). В контрольных экспериментах были использованы, соответственно, «пустой» вектор pMSngEH и кольцевая плазмида pZCijb, отличающиеся от pJDiOl и pNSPoi только отсутствием telN гена,

В результате было установлено, что N15 Ptel может быть репрессирован протеломеразой в 20-50 раз (см, табл. 2). Следует отметить, что наблюдаемая активность р-галактозидазы несколько снижалась и в присутствии контрольных плазмид (примерно в 2 раза, см. Табл. 2), что может объясняться снижением числа копий репортерной плазмиды pZS-Ptel (данные не представлены). Для определения уровня репрессии Ptel в реальных условиях нами был сконструирован лизогенный штамм DHioB(Ni5)/pZS-Ptel. Измерение активности р-галактозидазы показало, что активность Ptel промотора в этих условиях составляет 12%, т,е, Ptel промотор N15 профага действительно репрессирован в лизогенной культуре.

Роль протеломеразы в стабилизации концов линейной ДНК

Хорошо известно, что шпилечные структуры нестабильны в клетках Е, сой вследствие их расщепления продуками генов sbcC и sbcD (Leach, 1994; Connelly and Leach, 1996; Cromie et al_f 2000; Bzymek and Lovett 2001). SbcC и SbcD образуют SbcCD нуклеазу, обладающую АТФ-зависимой экзонуклеазной активностью на двунитевой ДНК и АТФ-независимой эндонуклеазной активностью на однонитевой ДНК (Connelly and Leach, 1996)- В то же время, профаг N15 стабильно поддерживается в штаммах Е. coli, имеющих активный фермент SbcCD (напр. Е .coli С, МСюбі, DHioB). Защита шпилечных теломер N15 может осуществляться засчет связывания с ними белка, препятствующего действию нуклеазы, или синтеза ингибитора SbcCD. Поскольку мы установили, что протеломераза N15 репрессирует Ptel, вероятно, связываясь с tosLi, tosL2, tosL3 сайтами, было сделано предположение, что именно TelN обеспечивает защиту теломер. Следует отметить, что протеломераза, как было показано ранее (см. раздел «Регуляция экспрессии sop оперона Nl5»)> также связывается с tosR 1,2,3 сайтами, расположенными в районе правой теломеры, и репрессирует ?2 промотор sop оперона.

Для проверки предположения, что протеломераза обеспечивает защиту теломер, мы провели эксперимент, в котором определяли эффективность трансформации штаммов Е, coli, содержащих и не содержащих экспрессирующийся ген протеломеразы, линейными и кольцевыми плазмидами (Табл. з)-

Таблица 3- Эффективность трансформации штаммов E.coli линейными и кольцевыми плазмидами.

В экспериментах были использованы; линейная плазмида pG59i> основанная на репликоне N15 и имеющая шпилечные теломеры, и кольцевая плазмида pG59ic> лишенная теломер и telN гена. Параллельно использовали линейную плазмиду pNFo4, основанную на репликоне F - фактора (Ravin et ai, 2001). Следует отметить, что обе линейные плазмиды содержат ген telN, необходимый для их репликации. В качестве контроля брали кольцевую плазмиду pKRPio, имеющую репликон PBR322 (Reece and Phillips, 1995)-Полученные результаты показывают, что эффективность трансформации клеток Е. сой линейной ДНК со шпилечными теломерами в 50-100 раз ниже, чем кольцевой ДНК того же размера (см. данные для pG59i и pG59i<0- Следует отметить, что такое различие наблюдалось на обоих использованных штаммах,- DHioB и МСюбі. В то же время, присутствие профага N15 или экспрессирующего протеломеразу вектора в трансформируемом штамме повышает эффективность его трансформации линейной ДНК до уровня, полученного при трансформации кольцевыми плазмидами. Вероятно, этот эффект отражает деградацию введенной в клетки ДНК до того, как находящийся на линейных плазмидах ген telN обеспечит синтез достаточного для защиты теломер количества фермента. В случае же использования лизогенного штамма или штамма-продуцента TelN — связывание предсуществующей протеломеразы эффективно предотвращает деградацию теломер.

Определение внутриклеточной локализации линейных плазмид на основе репликона N15* Влияние Sop белков на положение плазмид в клетке

Внутриклеточную локализацию линейных плазмид с разным числом центромер в отсутствии или присутствии Sop белков N15 исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии. Система основана на использовании гибридных флуоресцентных белков желтого и синего цветов, способных специфически связываться с наборами операторов, помещенных вблизи центромер (См, материалы и методы). О влиянии белков SopA и SopB на внутриклеточную локализацию линейной плазмиды судили по положению флуоресцентных фокусов в клетке. Линейная плазмида-мишень содержит температурно-чувствительную мутацию в репликационном гене герА, что позволило изучить внутриклеточную локализацию как для многокопийного состояния, так и в случае, когда в клетке оставалась лишь одна копия линейной плазмиды.

Б норме число копий изучаемой плазмиды при выращивании культуры при зоС составляло от 4 ДО 6 копий на хромосому. При повышении температуры до 37С за счет блокирования репликации уже через 4>5 часа в клетке оставалась одна копия. В эксперименте использовали три плазмиды-мишени PDAG711 (2IR), PDAG720 (1IR) и pDAG72i (без IR), отличающихся друг от друга лишь числом центромерных сайтов. Каяодый штамм содержал экспрессирующую флуоресцентные белки плазмиду PDAG709 и одну из плазмид pDAG242 или PDAG713 ЛДО экспрессии SopA+SopB или только SopB, соответственно, Были получены и проанализированы цифровые изображения; для оценки положения фокуса бактериальную клетку условно разбили на три области: полюс, Уа - % и центр. Расстояние между фокусами определяли из расчета і пиксел изображения = 0,064 мкм, измеряя дистанцию от ближайшего полюса до центра фокуса флуоресцентного свечения.

Внутриклеточная локализация. Многокопийное состояние

В многокопийном состоянии фокусы желтого и синего цвета, образованные на одной линейной молекуле, всегда локализовывались в одном положении (перекрытие составляло от 70% до 100% площади) и далее принимались за один флуоресцентный фокус. Большинство клеток при этом всегда содержат один фокус (Рис. vj В). В отсутствии экспрессии Sop белков в клетке фокусы располагаются неким случайным образом, примерно в равной степени распределяясь по всей длине клетки. При этом в клетке можно было наблюдать от одного до трех фокусов. Примерно в 70% случаев - только один фокус; в 20% - два и в ю% - один. Присутствие одного SopB приводило к появлению одного (86%) или двух (14%) крупных фокусов у полюсов клетки, что можно объяснить образованием сегрегационных комплексов за счет связывания SopB с центромерами и взаимодействию образованных комплексов между собой. При одновременной экспрессии белков SopA и SopB ЁеякоЦ наблюдали увеличение числа фокусов в клетке (один фокус - 51% случаев, два - 29%, три - ю%, четыре - 8%, пять и шесть по 1%). Появление большего числа фокусов можно объяснить нормальной работой аппарата стабильного наследования, который разделяет сегрегационные комплексы, тем самым^ позволяя канодой дочерней клетке получить свою копию линейной плазмиды. В клетках с двумя фокусами, их локализация происходила преимущественно в положениях У\ и ³А длины клетки, что соответствует центрам будущих дочерних клеток, а значит распределенные подобным образом линейные молекулы окажутся расположенными в центрах будущих дочерних клеток, готовые к последующей репликации (Рис 18). Подобное расположение наблюдалось и для состояния, когда в клетке наблюдали четыре фокуса, за исключением того, что образовавшаяся клетка получит уже две копии линейной плазмиды.

yfp efp 1Щ

"".і"! 4

ш W

::

к?

жены ш фотографик того и ошсго каната.

~~F>>-*------------

ги

- D

) С М6Ї

рае№йямн#іл та

-J LJ J

: I

і -1--4---

ІН-Ґ-р - - — - jjeni,v

№..

9\ \# \

Внутриклеточная локализация. Однокопийное состояние

Используемая система с двумя флуоресцентными белками разных цветов позволила изучить, что происходит с линейной плазмидой в однокопийном состоянии и какова роль SopA в процессе сегрегации. В этом эксперименте использовали аналогичные штаммы, но выращенные при 37С (что блокирует процесс репликации плазмиды, вследствие наличия мутации tS52 в герА гене) до достижения однокопийного состояния плазмиды-мишени. В отсутствии Sop белков в клетке желтый и синий фокус располагались в одном положении, а плазмида распределялась случайным образом. Экспрессия SopB приводила к смещению плазмиды к полюсу клетки» при этом положения фокусов обоих цветов совпадали- Наиболее существенные изменения появлялись при одновременной экспрессии SopA и SopB при условии, что плазмиды находятся в однокопийном состоянии. Оказалось, что плазмиды, содержащие центромерные сайты, располагалась преимущественно в центре или в положении V4 длины бактериальной клетки, а в 8о% случаев наблюдали несовпадение синего и желтого фокуса для плазмиды pDAG7ii с двумя центромерами и лишь в ю% случаев — для PDAG720 с одной центромерой (Рис. 2i), Для плазмиды PDAG721, не содержащей центромерных сайтов, не наблюдалось разницы в положении dp и yfp фокусов, и ее внутриклеточная локализация не была выраженной.

Полученный результат позволяет сделать предположение, что одной из функций SopA является разделение сегрегационных комплексов, образованных SopB на центромерах, с дальнейшим распределением реплицированных молекул в правильные положения. Роль SopA N15, таким образом, оказывается аналогичной роли РагА согласно теории работы сегрегационного аппарата, предложенной для кольцевых плазмид (Barilla et ah_f 2005), а именно — обеспечение активного транспорта реплицированных молекул в противоположные направления, Поскольку N15 обладает четырьмя центромерами, возникает вопрос, как осуществляется разделение сегрегационных комплексов и почему все центромерные сайты одной плазмиды двигаются в одном направлении? Мы предполагаем, что в естественном состоянии, когда число копий профага составляет от з до 5 на хромосому, внутримолекулярные сегрегационные комплексы оказываются прочнее межмолекулярных, и SopA предпочтительнее разделяет последние.

am ті

процесе сегрегации.

ь

і-.ЧЛґ

. .V*"

І.рЯ

1*1

* * і

* 1

є? && і.е ss а,з jls ^

Ї1ЇЄШК

енйташі (одеоконййное состояние)* Показано нєсошшдсние желтого и ответа

іа^ї.їіз'їїїііії'.

.ітлааміща pDAG7U SopAB+), В) Сравняете райределе>іиїі флуреецентеы^

Определение скорости потери линейных плазмид с разным количеством центромерных сайтов, основанных на репликоне N15

На основании полученых данных о внутриклеточной локализации линейных плазмид было установлено, что центромеры необходимы ддя правильного позиционирования реплицированных плазмидных молекул в клетке, что необходимо для их стабильного наследования. На следующем этапе работы предстояло выяснить, какую роль играет множественность центромер N15 для эффективности работы механизма сегрегационной стабильности и имеет ли значение их распределенное расположение в линейной молекуле.

Для изучения влияния числа и положения центромерных сайтов на стабильность линейных репликонов определяли скорость их потери при выращивании в среде без антибиотика. Для этого эксперимента был создан набор линейных плазмид на основе минимального репликона N15, которые содержали ген репликации герА и ген репрессор с, контролирующего его транскрипцию. В пределах последовательности герА располагается сайт инициации репликации и центромерный сайт (IRi). Кольцевая плазмида pNCiO, использованая в этом эксперименте для сравнения с линейными производными, не содержит sop оперон, обеспечивающий функции стабильного наследования, и таким образом, в отсутствии отбора на канамицине, теряется при делении клеток (Ravin and Lane, 1999)- Ранее было установлено, что экспрессия Sop белков в клетке приводит к полной стабилизации pNCiO (< 0.01% потери на генерацию), в то время как эквивалентная линейная плазмида (с геном telN и ковалентно замкнутыми концами) стабилизируется неполностью (Ravin et al, 2003)- В эксперименте использовали мини-плазмиду pG59^{x на} основе репликона N15, имеющую один центромерный сайт в пределах гена герА, но не содержащую большую часть последовательности sopAB генов, Чтобы оценить значение числа центромер и их расположения для процесса сегрегационной стабильности линейных плазмид, была определена скорость потери различных производных плазмиды PG59¹* различающихся количеством и расположением центромер, а также общей длиной плазмиды в присутствии и отсутствии в клетке Sop белков, В эксперименте использовали плазмиду pDAG2i6 для экспрессии Sop белков на

уровне, не превышающим естественный. В таблице 4 показаны схемы плазмид и приведены результаты эксперимента.

Для всех изучаемых плазмид было определено число копий и показано, что стабилизация в присутствии в клетке Sop белков не является следствием увеличения числа копий. Было установлено, что единичный центромерный сайт, расположенный как в своем естественом положении в пределах гена герА (PG59¹)»^{так и в} другой части молекулы (PG598, PG750X может обеспечить лишь частичную стабилизацию плазмиды. Вставка второй центромеры на растоянии 4 тпн от первой (pG593) или на растоянии 8,7 тнп (pG75i) приводит к существенному увеличению стабильности этих плазмид, однако, когда вторая центромера расположена на незначительном удалении от первой, — 1,7 тнп CpG599) подобного эффекта стабилизации не наблюдалось. Скорость потери была определена и для производных большей длины, полученных вставкой фрагмента ДНК фага лямбда длиной 22 тпн, что привело к увеличению размера линейной плазмиды примерно в три раза. Было установлено, что единичный центромерный сайт обеспечивает меньшую стабильность такой плазмиды по сравнению с коротким аналогом (pG59il* и pG598L), однако в случае pG750L скорость потери была меньше по сравнению с коротким предшественником. Можно предположить, что эффективность единичного центромерного сайта зависит и от его расположения в молекуле. В остальных случаях для длинных плазмид наблюдался сходный эффект стабилизации в зависимости от расположения второй центромеры (pG593L и pG75iL), а степень стабилизации pG599L, по сравнению с ее коротким аналогом, был незначительным. Вставка третьей центромеры на растоянии і,у тпн от второй не увеличивает существенно стабильность по сравнению с плазмидой уже содержащей два центромерных сайта (pG752 и PG752L), однако стоит отметить, что плазмида PG752L по уровню стабилизации приближается к кольцевой pNCiO. Таким образом, число и расположение центромер в линейной молекуле является определяющим фактором стабильного наследования.

ТНбдиця 4- Віщяние количества и положения центромер и& ^тймлшт наследование шнеЙЕда влазмдд на основе Шх$,

Іїї>ТЄрН

о,о6

Jk*

о.Вз

ом

0.13

-M-Q

о,Б$

о л

0.01

оа

ол$

0-0І

'&-:-Ум-:.-м-:-.-м-:-.-м+.-м+.-.\*.+.+.±і

Сжорооъ потери пл&жнда при жшртаии SopA и SopB» вйш генерацию, Сшросгь потери шшерядв в шта&ше DHioB* содержащем линейную плазмвду на основе решткова Nig (Rm+) я яспольэгуеиый Апя экспрессов Sop белков вектор pDA02i6 (Cm+) млн шттт DHiOB без pDAGai6 для оырвдедедаи

скорости потери в охстутсгаи Sop бшшов* Делали еершо разведеїшй ночной «уннуры в жидкой среде без жтжттт с таким расчетом, чтобы жлетаж прошли ю, 20_s 4 6о_: 8а млн юо генераций. Втлр&щешме таким способрм мулмуры расшшш то чашкам без шжштцтт, & полученные шшштш & томощш метода реплик тершоешш ва ч&шжш с ттмшщтм и определшж количество клеток без линейным гошзмид.

Шлжтт Sop бедвдв на число коїти тжтштшм Ш$

Шстджу некоторые та цштрамер Ыщ р&етолаг&ютсл в областях ответственных за решшшціда и контроль яшшшшії* мм предоложшш* что они шгу? принимать участие в регуляции шшх процессов. Так, одад ш цешромер Nis (Шї) отходится в пределах гена трА, кодирующего ріхшшщконішй бедок, что пшдадяет тщшшугь гипотезу о км, что Sop бетіш могут принимать участие в регуляции репликации, щшішдейетвув е этим центромернъга гайтом. Для проверки Шйшаного предположения был проведем экашрииавт, в котором мм исследовали влишше Sop белков на чиояо копий лишенной мішишшшидм pGg% тодйржшцей герА* В качестве контроля была использована жвивалштяаж минишшмида, содержащая мутацию в сайте JRx Оказалось^ что повышенная экснреосиж обош Sop белков приводит к увелштшию числа копий для пладмвдц, еодерж&щей центромеру в гене герА. Если центромера ешктвирова,на_? подового явления ее наблшдади (Рие, 22, дорожки %т.4І

т$иш 22. Влияние Вор бешов на ршлигащш линейных репликонош Mis LP обозначает лшеміме їілетидьі на ишове ренлнмшм Nig рОдїД & центромерой (IIU) ш repA и ее аналог pG95 иншшзвироватам щштромерньш сайтом (Ш~%

RP обоаш^ет р^феремиую шшмвду констшугаїшо зкаїреесирующую регулямрный фактор, К - ковтрльная пл&змида pZS2i; SopAB - pDAG24&; SopB - pDAG7l3; SopA - PDAG40B.

Так же было показано, что именно SopB белок, способный связываться с инвертированным повтором (IRi) внутри гена, способствует активации репликации, a SopA сам по себе не оказывает видимого влияния (Рис, 22, дорожки 5> 6 и 7» 8 соответственно). Таким образом, эффект активации репликации Sop белками и возможная регуляторная роль продуктов sop оперона обусловлена с взаимодействием SopB с центромерой, расположеной в герАш

Обсуждение

Последние данные об организации и функционировании систем сегрегационной стабильности плазмид показывают их высокую степень автономности как на функциональном, так и на регуляторном уровне. Эти системы полностью обеспечивают стабильное наследование плазмид и, как правило, экспрессия соответствующих sop/par оперонов находится под негативным контролем продуктов этого оперона. Большинство знаний в области механизмов сегрегационной стабильности относятся к кольцевым бактериальных репликонам. Эти системы хорошо описаны и изучены. В токе время существуют линейные репликоны, дня которых механизмы, обеспечивающие правильное распределение и стабильное наследование, а также способы регуляции экспресии соответствующих генов, еще не достаточно исследованы. В обзоре литературы подробно рассматривалось устройство сегрегационных модулей кольцевых плазмид и разнообразие строения центромерных сайтов. Большинство этих модулей представлены двумя генами, кодирующими сегрегационные белки, один из которых способен репрессировать промотор оперона, а второй может связываться с расположенным рядом центромерным сайтом и образовывать сегрегационный комплекс. На примере бактериофага N15 мы изучаем устройство сегрегационного аппарата линейных плазмид, выполняющего аналогичные функции и имеющего сходное строение с кольцевыми репликонами, однако, обладающего рядом принципиальных отличий- Основные их них: а) оперон. ответственный за стабильное наследование, может регулироваться не только своими продуктами; б) центромерный сайт представлен четырьмя инвертированными повторами, распределенными в геноме; в) центромеры расположены в районах, ответственных за репликацию и литическое развитие инфекции, а значит, сегрегационные белки могут участвовать в регуляции этих процессов.

Отметим, что эти особенности организации sop оперона храрактерны не только для фага N15, но и для двух других известных в настоящее время линейных плазмид - рЫК02 и pY54- Так, рЫКо2 содержит 4> ^а pY54 - 8 центромерных сайтов, в обоих случаях один из них расположен в репликационном гене. Механизмы регуляции экспрессии sop оперонов в этих случаях не были исследованы, но компьютерный анализ позволяет

предположить наличие более, чем одного промотора. Поэтому, множественность центромер и сложный механизм регуляции экспрессии sop оперона являются не специфическими свойствами N15, а отражают общие требования, предъявляемые линейной конформацией плазмид к работе механизма сегрегационной стабильности.

Регуляция экспрессии sop оперона

Ранее было установлено, что стабильное наследование плазмиды N15 обеспечивается sop локусом, имеющим гомологию с sop локусом плазмиды F как в области структурньк генов (sopA, sopB), так и в районе промотора sop оперона. (Ravin and Lane, 1999)- В то же время, эти исследования выявили существенные отличия механизма сегрегационной стабильности N15 от принятой для кольцевых плазмид модели (см. выше). В частности. Sop белки N15 способны репрессировать F Psop, но не наоборот (Ravin and Lane, 1999)-Анализ нуклеотидных последовательностей промоторов sop оперонов F и N15 выявил ряд различий, которые моїуг быть ответственны за эту ассимметрию. Так, последовательность N15 Psop содержит пять, а не четыре последовательностей CTTTGC, а также сайт связывания бактериального белка IHR Этот регуляторний фактор принимает участие во взаимодействии различных белков Е. coli с их сайтами связывания и, во многих случаях, принимает участие в регуляции активности близкорасположенных промоторов (см. обзор Goosen and van de Putte), Роль IHF в регуляции экспрессии N15 Psop является предметом дальнейшего изучения,

В настоящей работе было показано, что регуляция sop оперона N15 осуществляется не только продуктами оперона, но вовлекает другие регуляторные факторы профага N15- Экспрессия sop оперона N15 находится под контролем двух основных промоторов. Один из них, Pi, является гомологом промотора sop оперона плазмиды F и регулируется сходным образом: слабо репрессируется белком SopA; степень репрессии значительно увеличивается, когда помимо SopA, в клетке присутствует SopB белок. В ходе экспериментов по взаимодействию Sop белков с промотором sop оперона N15 было продемонстрировано специфическое связывание SopA и/или SopB с Pi in vitro. Последующие эксперименты с репортерными конструкциями позволяют сделать вывод, что именно SopA связывается с Рі. В то же время SopB

многократно усиливает репрессию промотора. Следует отметить, что в физиологических условиях Sop белки образуют сегрегационный комплекс в составе SopA и SopB, который является наиболее эффективным репрессором.

Второй промотор, Р2, не содержит последовательности, сходной с сайтами связывания SopA и, как следствие, не чувствителен к SopA и SopB белкам- Более того, транскрипция, инициируемая с Р2> возможно, способна «спихивать» SopA белок, связанный с операторами в районе Pi_t приводя к высокому уровню экспрессии оперона даже в присутствии Sop белков. Несмотря на этот факт, экспрессия sop оперона не является конститутивной по причине высокого уровня репрессии Р2 протеломеразой N15. Вероятно, такая репрессия является следствием связывания TelN с тремя tosR последовательностями в районе P2_f одна из которых (tosR2) расположена между -35 и -10 боксами промотора Р2 (См. рис. ю). Таким образом, TelN может выполнять функцию репрессора sop оперона и в тоже время быть регуляторным фактором транскрипции собственного гена telN под контролем промотора Ptel (Дорохов и др. 2004)- В большинстве случаев par (sop) опероны кольцевых бактериальных плазмид транскрибируются с одного негативно-регулируемого промотора, в то время как транскрипция рагАВ линейной хромосомы Streptomyces coelicolor находится под контролем двух промоторов с разными механизмами регуляции (Kim et al, 2000). В чем может быть биологический смысл подобной системы с более сложной системой реіуляции? Вовлечение в регуляцию sop оперона TelN позволяет предположить, что и Sop белки могут принимать участие в процессах, ответственных за репликацию и литическое развитие профага N15. Некоторые экспериментальные данные говорят в пользу этого предположения. Увеличение экспрессии Sop белков приводит к увеличению числа копий линейной плазмиды, повидимому, это явление связано со связыванием Sop белков с центромерным сайтом, расположенным в гене репликации repA (Ravin et al, 2003). Способность белка SopB, как N15, так и F снижать экспрессию расположеных поблизости с центромерой генов (Lynch and Wang, 1995; Grigoriev et al_r 2001) позволяет предположить, что Sop белки N15 могут реіулировать не только собственную экспрессию, но также являться глобальными регуляторами транскрипции N15. Два центромерных сайта N15 находятся вблизи предсказанных компьютерным анализом потенциальных промоторов поздних генов, а значит Sop белки могут принимать участие в регуляции логического развития фага N15. Вероятно,

сразу после инфекции sop промотор и промотор telN полностью активны, и уровень их экспрессии очень высок. В клетке быстро создается необходимый уровень SopA и SopB белков и протеломеразы. Sop белки обеспечивают эффективную передачу профага в дочерние клетки, а также, взаимодействуя с IRi сайтом в гене герА, стимулируют репликацию, что приводит к появлению нескольких копий плазмиды в клетке. TelN обеспечивает образование ковалентно замкнутых концов у линейной молекулы профага. На этой стадии развития оба этих процесса обеспечивают быстрое накопление молекул ДНК N15 в делящихся клетках. В тоже время Sop белки связываются с центромерными сайтами вблизи промоторной области поздних генов и не позволяют инфекции пойти по литическому пути развития. Позднее, в установившемся лизогенном состоянии, TelN репрессирует сильный Р2 промотор sop оперона, что приводит к дальнейшей регуляции экспрессии sopAB только по механизму отрицательной обратной связи с промотора Pi. Репрессия Р2 снимается лишь при литическом развитии, когда, по всей видимости, уровень протеломеразы в клетке снижается. Результатом является повышенная экспрессия sop генов, приводящая, в свою очередь, к активации репликации, требуемой для литического развития. Этот результат согласуется с предложенной моделью репликации ДНК N15 на поздних стадиях развития инфекции, предполагающей переход от линейной формы плазмиды N15 к преимущественно кольцевой, Б таком состоянии в TelN больше нет необходимости, поскольку не происходит образования ковалентно замкнутых концов линейной плазмиды.

Внутриклеточная локализация плазмид

В разделе, посвященном внутриклеточной локализации линейных плазмид, мы показали важную роль Sop белков N15 в правильном позиционировании плазмиды и, тем самым, в процессе распределения реплицированных молекул перед делением. Последние данные о механизмах взаимодействия Par(Sop) белков между собою и участии их в активном транспорте плазмид говорят о наличие сложной структуры, сформированной сегрегационными белками. Главной задачей такой структуры является разделение копий и гарантированная доставка их к центрам будущих дочерних клеток, что является условием для стабильного наследования, при этом

Внутриклеточная локализация плазмид

Полученные в последние годы результаты (Niki and Hiraga, 1997» 999; Jensen et al, 1998; Jensen and Gerdes 1997) свидетельствуют в пользу следующей модели функционирования механизма сегрегационной стабильности (Рис. 6, Moller-Jensen et ah, 2000), принципиально аналогичной митозу у эукариот. Репликация плазмид, локализованных в районе центра клетки, сопровождается формированием сегрегационных комплексов; реплицированные молекулы плазмид образуют пары за счет взаимодействия сегрегационных комплексов, связанных с их центромерами. После завершения репликации происходит разделение пар (в случае плазмиды F эту функцию, выполняет SopA) и активный транспорт плазмид. Образование пар плазмидами Ri in vitro зависит от белков ParR и РагМ (Jensen et al, 1998). Следовательно, сборка сегрегационного комплекса является необходимым предварительным условием для последующей работы гипотетического митотического аппарата. Колокализация плазмид и белков, связывающихся с центромерами (РагВ, SopB и РагМ Ri), предполагает, что эти белки связывают транспортируемые плазмиды со специфическими клеточными структурами, сохраняя их в определенной позиции до завершения клеточного деления, хотя существует гипотеза, о том, что сегрегация Ri не зависит от клеточных факторов и локализация сегрегационного комплекса в центре клетки связана лишь с репликацией (Moller-Jensen et ai, 2003) Сегрегация хромосом является более сложным процессом. Флуоресцентная детекция хромосомной ДНК показала, что реплицированные оп-сайты быстро разделяются за счет движения к противоположным полюсам клетки. Это согласуется с тем, что хромосомные аналоги sop/par семейства специфически связываются с последовательностями, расположенными вблизи огьсайтов. Будучи клонированными в плазмидах, хромосомные и плазмидные sop/par системы работают одинаково эффективно. Поэтому вероятно, что плазмидные и хромосомные sop/pav системы моїуг функционировать сходным образом, т.е. может происходить образование спаренных огіС-районов, которые затем разделяются и транспортируются к противоположным полюсам.

Moller-Jensen и соавторы (200о) предложили следующую модель сегрегации бактериальных хромосом. В только что образовавшейся клетке, oriC перемещается к центру клетки, где происходит сборка реплисомы. Позднее, одновременно с репликацией, oriC активно транспортируется к полюсам клетки, к которым затем прикрепляются. Эта модель является некоторым упрощением реальной ситуации, поскольку она не принимает во внимание наличие нескольких репликационных вилок в быстро растущей бактериальной культуре. Более того, факты отсутствия par/sop гомологов в некоторых бактериальных геномах (например, Е. eoli) требуют дальнейшего изучения. Последующие исследования показали, что важнейшую роль в активном транспорте плазмид играет ParA/SopA и их гомологи. Сборка сегросомы подразумевает взаимодействие ParB/SopB с центромерным сайтом. Сам нуклеопротеиновый комплекс при этом локализуется в центре клетки. Включение в комплекс ParA/SopA обеспечивает разделение пар и полимеризацию белков с включением в реакцию АТР, тем самым, создавая структуру, расталкивающую плазмиды двунаправлено. Белки ParB/SopB могут включаться в создаваемую структуру, способствуя её правильной сборке (Barilla et QL, 2005). После завершения клеточного деления, по всей видимости, образованная ParA/SopA структура деполимеризуеется.

Бактериофаг N15 был выделен и описан В.К. Разиным в 1964 г (Голуб и Равин, 1967)- Фаг N15 имеет линейную двунитевую ДНК молекулярной массой 30 МД, частота лизогеннзации около 50%, урожай фага около юо, латентный период 45 мин (Равин, 197 )- Бактериофаги N15 и лямбда имеют схожую структуру вириона, около $0% ДНК N15 гибридизуется с ДНК фага лямбда (Ravin and Shulga, 1970). На основании этого N15 был отнесен к семейству лямбдоидных фагов. Как было показано В.К. Равиным и сотрудниками в 1967-70 гг, особенностью N15 является то, что в лиэогенном состоянии он не интегрируется в хромосому, а представляет собой автономно реплицирующуюся плазмиду (Ravin and Shulga, 1970) Следующий важный шаг в изучении генетики фага N15 был сделан проф. В.Н. Рыбчиным и сотрудниками, которые показали, что профаг N15 представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми концами (теломерами). Вывод о линейности профага N15 был сделан на основе физического картирования ДНК фага и профага, которое показало, что (і) обе молекулы ДНК линейны и имеют длину 46-3 тпн и (г) рестрикционная карта профага является результатом циклической пермутации карты фага (Сварчевский и Рыбчин, 1984b} Концы профага N15 (теломеры), назвываемые telL и telR представляют собой шпилечные структуры, т.е. две нити ДНК ковалентно связаны однонитевыми участками. Шпилечная структура теломер профага N15 была установлена в работе (Сварчевский и Рьтбчин, 1984b). В работах (Малинин и др., 1992а, 1992b) были определены нуклеотидные последовательности концевых районов профага и соответствующего неразрезанного сайта в фаговой ДНК, telRL, представляющего собой палиндром длиной 56 н. Схема образования плазмидной ДНК из фаговой, впервые предложенная в работе (Малинин и др., 1992а), показана на рисунке 7- После проникновения фаговой ДНК в клетку она замыкается в кольцо по когезивным концам, однонитевые разрывы зашиваются ДНК-лигазой. Затем гипотетический фаговый фермент, впоследствии названный протеломеразой (прокариотическая теломераза), вносит ступенчатый разрыв в фаговой ДНК в области telRL.

Плазмиды и штаммы, используемые для экспериментов с репортерными геном при анализе транскрипции sop оперона N15

Плазмиды и штаммы, используемые для экспериментов с репортерными геном при анализе транскрипции sop оперона Nis

Фрагменты ДНК N15, содержащие промотор sop оперона, были клонированы между ЕсоШ. и ВатпШ сайтами репортерного вектора pRS55i (Simons et al, 1987) на tf конце гена lacZ. Плазмида pNSPoi содержит фрагмент ДНК N15 sopP (от -470 ДО +47 относительно «А» в ATG кодоне гена sopA), полученный при помощи ПЦР с использованием праймеров PR34 и PR23-Плазмида pNSPo6 содержит фрагмент sopP2 (от -470 до -148; праймеры PR34 и PR46). Плазмида pNSP04 содержит фрагмент sopPi (от -183 до +47; праймеры PR3 и PR23). Репротерные конструкции sopAacZ были перенесены в хромосому Е. coli при помощи рекомбинации in vivo и лизогенизации штамма МСюбі рекомбинантным фагом ARS88 (Simons et aL, 1987), в результате чего были получены штаммы pNSPoichr, pNSP04chr и pNSPo6chr,

Для получения линейной репортерной плазмиды сперва была получена линейная плазмида pG59 на основе N15 путем лигирования Smal фрагмента из плазмиды pKRPn (Reece and Philips» 1995), содержащего ген устойчивости к канамицину, с фрагментом ДНК N15 (с координатами 22733-35000)? полученным ПЦР с использованием олигонуклеотидов PR27L и PR39R- pG59 содержит гены, необходимые для репликации и контроля лизогении (гены 28-38), включая telN, герА и сВ, Удалив из pG5950O нт ВдШ фрагмент, содержащий sopA и sopB гены? получили плазмиду pG59 Вставив lacZYA гены из pNSPoi (Расі - Xmalll фрагмент) между Расі и Not! сайтами в pG59 получили pNSP03 - линейную плазмиду, несущую IQC оперон под контролем промотора sop оперона N15 Плазмиды и штаммы, используемые для Northern-blot и primer extension анализа транскрипции sop оперона Nifi

Для анализа транскрипции sop оперона N15 использовали плазмиды pNSPoi, pNSP02. Для снижения негативного влияния высокого уровня р-галактозидазы на рост штаммов с плазмидой pNSPoi из этой плазмиды был удален ВатШ-BsrGl фрагмент, содержащий основную часть lac оперона, и получена плазмида pNSP02.9Ta плазмида использовалась как источник РНК дня primer extension анализа- Ті терминатор оперона sop N15 поместили между промоторным фрагментом и LacZ. SopABi фрагмент был амплифицирован на ДНК N15 с праймерами PRi и PR6 и затем вставлен в сайт Smal в вектор pUC9-Полученную плазмиду обрабатывали ВатШ и Nrul для удаления большей части вставки, за исключением юонт фрагмента с терминатором, обработали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I, а затем лигировали для получения pUCi, Эта плазмида была обработана Saii3A, полученный фрагмент Ті длиной 237 иг вставлен в ВатШ сайт pNSPoi и pNSPoi Таким образом, терминатор Ті был размещен в естественной ориентации после промотора sop оперона. Размер sop-специфичных РНК, которые могли быть получены на этих плазмидах, ожидался от Ц.0 нт (относительно «А» в стартовом кодоне sopA до первой «Т», следующей за инвертированным повтором терминатора Ті) до 6о 1нт (от левого конца sopP до Ті).

Плазмиды. используемые в эксперименте по изучению регуляции экспрессии гена протеломеоазы бактериофага Nis

Плазмида pJDioi (Denke et alv 2000) была использована для конститутивной экспрессии протеломеразы, а соответствующий «пустой» вектор pMSngEH - в качестве отрицательного контроля, В параллельном эксперименте с той же целью использовали линейную плазмиду pNPoi и соответствующий вектор PZC176 (Ravin et ab3 2001). Вектор pZCi76 основан на репликоне плазмиды Pi и содержит гены, необходимые для репликации и стабильного наследования Pi (мини-Pi), pNPoi была получена в результате клонирования фрагмента ДНК N15, содержащего telRL сайт и telN ген, в PZC176, что приводило к ее линеаризации и дальнейшему поддержанию в линейной форме (Ravin et al, 2001).

Линейная плазмида pG59 основана на репликоне N15 и содержит все гены, необходимые для репликации и контроля числа плазмиды N15, включая ген протеломеразы (см, выше). Кольцевая плазмида pG59!c получена из PG591 путем делегирования теломер и telN гена (рестрикция Styl + ВатШ9 обработка концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы и лигирование с геном устойчивости к тетрациклину, вырезанному из плазмиды pKRPi2 с помощью Srnal). Плазмида pNF04 содержит репликон F-фактора Е. coli, а также теломеры и ген протеломеразы N15 и реплицируется в линейной форме (Ravin etal., 2001).

Фрагмент ДНК N15, содержащий предполагаемый промотор гена протеломеразы Ptel (от -175 ДО -ю нт относительно «А» в ATG кодоне гена telN) был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров telRL-i и telRL-3-Этот фрагмент был клонирован между EcoRI и BamHI сайтами репортерного вектора pRS55l (Simons et at, 1987) на 5T конце гена lacZ (плазмида pRSsS1 )-Поскольку вектор pRS55i основан на репликоне pBR322 и, следовательно, несовместим с плазмидами pJDioi и pMSngEH, имеющими тот же репликон, мы сконструировали производное pRSssiPtel, содержащее совместимый с PBR322 репликон pSOoi, С этой целью Ncol - Seal фрагмент плазмиды pRS55iPtel, содержащий PBR322 ori, заменили Ncol - ЕСІ136ІІ фрагментом плазмиды pZS2i (Lutz and Bujard, 1997) содержащем репликон плазмиды pSCioi- В результате была получена плазмида pZS-Ptel, совместимая со всеми векторами, использованными для экспрессии генов N15. Для изучения влияние профага N15 на уровень активности Ptel промотора в pZS-Ptel был получен лизогенный штамм DHioB(Ni5)/pZS-Ptel.

Связывание Sop белков N15 с sopPi промотором

Sop локус N15 расположен в районе правого конца линейной плазмиды (Риси). Оперон включает два гена, sopA и sopB, имеющих 75% и 49% гомологию по аминокислотным последовательностям с соответствующими генами плазмиды F. Участок длиной около 150 нт, предшествующий sopA, также гомологичен соответствующему району плазмиды F и содержит промотор sop оперона, Pisop, (Ravin and Lane, 1999)- Этот район содержит 5 копий последовательности CTTTGC, разделенных А/Т богатыми участками, причем эти повторы перекрывают последовательности -35 и Ю sop промотора (Риси), Соответствующий фрагмент плазмиды F содержит 4 копии последовательности CTTTGC, расположенных аналогично четырем из пяти соответствующих последовательностей N15» В отличие от F Psopy промотор sop оперона N15 содержит сайт связывания бактериального белка IHF (integration host factor). Для плазмиды F было показано, что SopA репрессирует Psop, причем величина репрессии многократно увеличивается в присутствии SopB. Более того, Sop белки N15 способны репрессировать F Р$ор} хотя и в меньшей степени, чем собственные белки плазмиды F (Ravin and Lane, 1999) Последовательность длиной 448 нт от правого конца линейного профага N15 ДО начала гена sopA содержит уже известный промотор Pisop (Ravin and Lane, 1999). Транскрипция, инициируемая с этого промотора, ретулируется белком SopA. Последовательность длиной 380 нт перед этим районом не имеет гомологии с последовательностью F, причем компьютерным анализом было предсказано возможное наличие пяти потенциальных промоторов (Ravin et ah, 2000; Grigoriev and Lobocka, 2001), однако существование ни одного из них не было доказано экспериментальным образом. репрессировать промотор тр отгона («юта. участку дарР і в обозначении згой работы). Мы адед&ли предположение а тощ что эта репрессия достигается связывание ! Sop бшжов с CTTTG - операторами в промоторном уч&ат №&адр- Для проверки этой гапотезы вами был жіюлшовш метод задержки в гале. В качестве источника Sap белков мы использовали бактерии штамма DHioB, содержащие плашвду рККаїз {Ravin & aL 2003}- Эпга тжжтт ііредсшушет вдбой р шмбиншзетый вектор рИС99 в мотором кдомнрошшы гены трА и ворВ, Их транскрипция осуществляется с Pfoc промотора веггара, транскрипция которого может быть индуцирована с помощи ЇРГС При этом уровни зкепржии белков достигает 1-5 общего &ж& но ,?щнным электрофореза в пошакриланидном геле в присутствии SDS (данные не оредегашіеньї). Экшершенты по задержке в гете нроюдилв с использованием белковых экстрактов полученных из иіщуцироішшзж с помощью 1РГО щлшур ВНюВ/pOCg ( щтщ тьыы& КОЇЩКШЬ) Н ВНюВ/рКЖахз {N15 SopA и SopB). Полученные результаты {Рис, 12) еввдеттаствуют о специфическом йттттшш Шв SopA н/или N15 SapB с фрагментом ДИК Nig, содержащем Идентификация промоторов sop оперона N15 и анализ соответствующих транснриптов.

Чтобы установить, существуют ли в районе между sop генами и правой теломерой N15 другие промоторы помимо уже известного Ply был проведен Northern blot анализ РНК (См. Рис. із). Для получения транскриптов использовали плазмиды pNSPoi и pNSP04, содержащие гены lacZYA под контролем промотров sop оперона N15» первая из них несет весь изучаемый район sopPt а вторая - лишь фрагмент sopPi (См. рисю). Транскрипты, получаемые на плазмидах pNSPoi и pNSPoi имели длину более 5тпн, что не позволяло точно определить их размер с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Для уменьшения длины транскрипта и повышения разрешения электрофореза непосредственно после промоторного фрагмента в вектор был вставлен терминатор Ті sop оперона. Полученные плазмиды pNSPoiT и pNSP04T использовали как источник специфичной sop-району РНК с предполагаемым размером от 145 нт (расстояние между стартовым кодоном sopA и Ті) до 620 нт (от левого конца sopP фрагмента до Ті) соответственно. Из штамма МСіОбі, содержавшего плазмиды pNSPoiT или pNSP04T? или пустой вектор pR355i, выделяли РНК, разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с радиоактивно-меченными пробами ДНК, покрывающими sopP район. В результате были получены несколько специфичных фрагментов. Транскрипт TRi размером 170 +/- ю нт выявляется гибридизацией с последовательностью sopPi, но отсутствует при гибридизации с sopP2, таким образом можно сделать заключение, что он соответствует уже известному промотору Pi. Три других фрагмента (TR 2, % 4) присутствуют в обеих пробах. Полосу наибольшей интенсивности образует транскрипт TR2 длиной примерно 520 нт, предполагаемый промотор которого представлен TTGCAT (-35) и TATGGT (-ю) последовательностями, находящимися по обе стороны от tosR2 сайта. Оставшиеся две интенсивные полосы имеют длину от 520 до 620 нт (TR3 и TR4). Все остальные фрагменты размером более 620 нт, что превышает длину предполагаемого максимального транскрипта, ограниченного Ті и может быть объяснено неполной теминацией транскрипции в сайте Ті. Таким образом, полученные данные показывают, что район, предшествующий промотору Pi, является транскриптционно активным.

Для точной идентификации предполагаемых промоторов в пределах sopP2 района с помощью реакции primer extension были определены положения 5 концов РНК, Препараты РНК выделяли из культуры, содержащей плазмиду pNSP02 (производная плазмиды pRS55i? включающая весь sopP район) и использовали в реакции primer extension с меченым праймером PR48, комплиментарным району предшествующему 5 концу sopPi (См, рис- ю). После разделения в геле полученных фрагментов была локализована интенсивная полоса в положении -365 относительно нуклеотида «А» в стартовом кодоне sopA. Эта полоса соответствует транскришу TR2, начинающемуся с нуклеотида «А», как показано на рисунке т. Это согласуется с расположением Р2 промотора, идентифицированного Northern blot анализом. Кроме этого были получены дополнительные две полосы меньшей интенсивности в положениях - 399 и "426 вероятно, соответствующие транскриптам TR3 и TR4, обнаруженным в Northern-blot экспериментах (Рис. 13А). В обоих случаях были обнаружены последовательности с умеренной схожестью с каноническими -ю и -35 промоторными мотивами в свойственных им положениях относительно стартовых точек (Рис. ю).

Роль числа и расположения центромер в эффективной работе механизма сегрегационной стабильности линейной плазмиды

Для проверки предположения о том, что SopA способен разделять сегрегационные комплексы, были созданы условия даія получения в клетке однокопийного состояния линейной плазмиды с двумя центромерами. Без Sop белков или в присутствии только SopB положения синего и желтого фокуса совпадали. При одновременной экспрессии SopA и SopB мы наблюдали расхождение в положении флуоресцентных фокусов разного цвета, Это свидетельствует о том, что одной из функций SopA является взаимодействие с сегрегационными комплексами, образованным SopB у каждого центромерного сайта плазмиды, и разделение этих комплексов с целью обеспечить активный транспорт реплецированных молекул к центрам будущих дочерних клеток. Мы сравнили данные о внутриклеточной локализации линейных плазмид в одно- и многокопийном состоянии. Оказалось, что в отличии от многокопийного состояния, когда реплицированные плазмиды активно транспортировались в положения У4 и % длины бактериальной клетки, единственную копию линейной плазмиды можно было локализовать преимущественно в центре. Это соответствует данным о том, что сразу после клеточного деления, плазмида локализуется преимущественно в центре клетки, (Lemon and Grossman, 1998, 2000).

Возникает вопрос, почему в многокопийном состоянии, когда линейная плазмида содержит два и более центромерных сайта, не происходит разделение внутримолекулярных сегрегационных комплексов? Почему сегрегационные комплексы одной плазмиды всегда транспортируются в одном направлении перед делением? Мы предполагаем, что разделение межмолекулярных сегрегационных комплексов происходит предпочтительнее, нежели внутримолекулярных комплексов линейной плазмиды. Также необходимо отметить, что разделение внутримолекулярных комплексов можно было наблюдать, когда в клетке находилась только одна копия линейной плазмиды, а такое состояние не является естественным для плазмид на основе репликона N15. Можно сделать предположение, что SopB белок, связываясь с каждой из четырех центромер профага N15, образует «единый» достаточно стабильный сегрегационный комплекс. После репликации такой «единый» сегрегационный комплекс одной из дочерних линейных плазмид связан с аналогичным комплексом второй дочерней плазмиды за счет взаимодействия SopB белков между собой. Если в клетке присутствует несколько копий линейной плазмиды, белок SopA разделяет преимущественно связи между дочерними плазмидами и обеспечивает их активный транспорт в противоположном направлении к центрам будущих дочерних клеток. Аналогичный механизм описан для кольцевых бактериальных репликонов (Barilla et al, 2005), содержащих один центромерный сайт.

Роль числа и расположения центромер в эффективной работе механизма сегрегационной стабильности линейной плазмиды N15

В геноме N15 содержится четыре центромерньтх сайта, причем плазмиды с двумя сайтами позиционируются Sop белками в клетке более эффективно, чем с одним. Однако, у N15 центромерный сайт не просто состоит из нескольких повторов, но, в отличие от кольцевых плазмид, эти повторы не кластерированы, а располагаются в различных районах генома. Поэтому на следующем этапе мы исследовали вопрос о том, как не только число, но и взаимное положение центромер может влиять на стабильное наследование линейных плазмид. В ходе экспериментов по изучению скорости потери плазмид было установлено, что одной центромеры недостаточно для стабильного наследования линейной плазмиды, в то время как стабильность кольцевой плазмиды может обеспечить один центромерный сайт. Нами было показано, что только несколько центромерных сайтов, расположенных на достаточном расстоянии друг от друга, способны обеспечить стабильное наследование линейной молекулы. Причем степень стабилизации может зависеть от того, в какой части плазмиды расположена центромера. Исходя из этих результатов, мы сделали предположение о том, что образование внутримолекулярного «единого» сегрегационного комплекса с вовлечением в него всех центромер обеспечивает некую компактную форму линейной молекулы, облегчая активный транспорт в делящейся клетке. В тфсе время, сформированный сегрегационный комплекс может выступать в роли одной центромеры. Благодаря этому, не происходит нарушения в процессе активного транспорта, и центромерные сайты одной плазмиды всегда двигаются в одном направлении, что позволяет сегрегационному аппарату точно разделить пары после репликации и гарантировано доставить копии линейных плазмид к центрам будущих дочерних клеток.

В данной работе удалось показать, что расположение центромер в определенных районах генома N15 может иметь значение для регуляции других его жизненно важных функций. Так, одна из центромер (IR2) расположенна в районе промотора поздних генов и, таким образом, может участвовать в регуляции литического развития, другая (IRi) находится в гене репликации герА. Показанный в настоящей работе эффект увеличения числа копий при повышенной экспрессии Sop белков связан именно с взаимодействием SopB с центромерным сайтом IRi- Можно высказать предположение, что такой механизм регуляции репликации с помощью продуктов сегрегационного модуля реализуется при литическом развитии инфекции, когда снимается репрессия sop оперона, что должно приводить к его повышенной экспрессии. Как было показано, повышенная экспрессия Sop белков может приводить к существенному увеличению числа копий, наблюдающемуся в ходе логической репликации.

Похожие диссертации на Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере бактериофага N15

Антирестрикционный белок ArdA, кодируемый трансмиссивной плазмидой IncI группы: мутационный анализ и изучение механизма действияНекрасов Сергей Вячеславович

Изучение механизма сайт-специфического действия Dam ДНК-{N6-аденин}-метилтрансферазы бактериофага Т4Евдокимов Алексей Альбертович

Изучение механизма транскрипции на примере этапов транскрипционного цикла РНК полимеразы бактериофага Т7 Escherichia coli Кукарин Александр Вячеславович

Изучение механизма действия нового коактиватора транскрипцииВоробьева Надежда Евгеньевна

Изучение механизмов АНТИ-ВИЧ активности производных высших тритерпенов и хинонов Ильина Татьяна Валерьевна

Изучение механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1Лябин Дмитрий Николаевич

Изучение молекулярного механизма ассоциации некоторых антибиотиков с сывороточным альбумином человекаШрайбер, Наум Фридрихович

Изучение механизма образования и стабильности биологически-активных продуктов фотоокисления псораленаМалахов Михаил Валентинович

Функциональная характеристика репликона бактериофага N15 и конструирование на его основе экспрессионных векторов с регулируемым числом копийМарданов Андрей Владимирович

Линейные прокариотические репликоны с ковалентно замкнутыми теломерами: молекулярная генетика и механизм репликации ДНК бактериофага N15 Равин Николай Викторович