Введение к работе
Актуальность исследования
Bacillus anthracis - этиологический агент особо опасного инфекционного заболевания - сибирской язвы В настоящее время существует тенденция к ухудшению эпидемиологической обстановки по сибирской язве, что выражается в неуклонном росте эндемичных территорий, регулярном возникновении вспышек заболевания людей и сельскохозяйственных животных, угрозе применения возбудителя сибирской язвы в качестве биологического оружия (Ипатенко НГ, 1996, Онищенко Г Г с соавт, 1999, Черкасский Б Л, 2002, Bush L et al, 2001) В связи с этим, большое внимание уделяется разработке и внедрению в практику иммунопрофилактических препаратов, основанных на использовании видоспецифических антигенов В anthracis
Развитие иммунного ответа макроорганизма обуславливает протек-тивный антиген сибиреязвенного токсина В качестве хромосомных факторов патогенности В anthracis в разное время рассматривались гемолизины, про-теазы, ферменты пигментсинтеза и спорообразования (Цыганкова О И, 1993; Еременко Е И, 1997, Koehler Т et al, 1992) В последнее время внимание отечественных и зарубежных исследователей привлекают упорядоченные поверхностные структуры - S-слои, ввиду их возможного участия в проявлении вирулентных и иммуногенных свойств микроорганизмов (Sleytr U, Messner Р, 1988, Bahl Н et al, 1997, Bevendge Т et al, 1997, Дебабов В Г, 2004)
S-слой (от англ surface — поверхность) представляет собой регулярное паракристаллическое окружение клетки и присутствует у большинства грам-положительных и грамотрицательных эубактерий и архебактерий Расположенный между капсулой и пептидогликаном S-слой возбудителя сибирской язвы представлен двумя белками - Sap (от англ surface array protem) и EAl (от англ extractable antigen I) Белки S-слоя последовательно присутствуют на клеточной поверхности- на начальных стадиях роста in vitro синтезируется Sap, затем в течение стационарной фазы происходит замещение Sap на ЕА1 и выделение Sap в супернатант Синтез S-слоя детерминируется двумя генами sap и eag, расположенными в одинаковой ориентации, один за другим на хромосоме возбудителя сибирской язвы, и координируется AtxA-регулоном, вовлеченным в глобальную регуляцию генов токсина, капсулы и компонентов S-слоя
Среди отечественных работ по изучению поверхностных белков особого внимания заслуживают исследования М В Безносова с соавторами (1997) Из клеточной стенки штамма В anthracis СТИ-1 они экстрагировали белок С По молекулярной массе и биологическим свойствам данный антиген близок к ЕА1 Авторы показали перспективность применения белка С в конструировании диагностических и профилактических сибиреязвенных препаратов
Биоинформационные и протеомные анализы, осуществленные в различное время на модели возбудителя сибирской язвы, продемонстрировали наличие иммуногенных белков, кодируемых хромосомными генами (Ariel N et al, 2003, Chitlaru T et al, 2004, Gat О et al, 2006) Среди них оказались и белки S-слоя - Sap и ЕА1 В пользу иммунологической активности S-слоя т vivo косвенно свидетельствует тот факт, что в сыворотке больных сибирской язвой и иммунизированных людей и животных обнаруживаются антитела к Sap и ЕА1 Изучение вклада поверхностных белков в реализацию иммуногенных свойств В anthracis может быть полезным для конструирования более совершенных средств профилактики сибирской язвы
Все вышеизложенное определило актуальность данной диссертационной работы
Цель исследования выделение и идентификация белков S-слоя В anthracis, изучение их иммуногенного потенциала
Основные задачи исследования:
Селекция сибиреязвенных штаммов, продуцирующих белок S-слоя.
Выделение и очистка белков Sap и ЕА1
Идентификация выделенных белков в качестве компонентов S-слоя с использованием биохимических, электронно-микроскопических и иммуноэлектронно-микроскопических методов
Изучение иммуногенных свойств белков S-слоя
Получение штаммов В anthracis, дефектных по секреции белка Sap
Изучение вклада белка Sap в реализацию протективных свойств микроорганизма на модели сконструированной изогенной системы Sap+ и Sap" штаммов
Научная новизна исследования.
Впервые у штаммов возбудителя сибирской язвы обнаружены различия в продукции in vitro одного из белков S-слоя - Sap. Среди природных изо-лятов и аттенуированных производных В anthracis обнаружены культуры, не продуцирующие Sap в среду выращивания
С помощью биохимических, электронно-микроскопических и имму-ноэлектронно-микроскопических методов исследования получены доказательства принадлежности к структурам S-слоя сибиреязвенного микроба белков, выделенных из культурального фильтрата В anthracis SterneATPrt" и экстрактов клеточных стенок В anthracis СТИДТ.
Впервые показано, что условия температурной элиминации плазмид способствуют возникновению спонтанных Sap* мутаций Получены штаммы,
дефектные по экскреции белка Sap, за счет инсерции транспозона (Тп9/7) в последовательность хромосомных генов
Сконструирована изогенная система штаммов В anthracis продуцирующих и непродуцирующих белок S-слоя - Sap На ее основе получены доказательства участия белков S-слоя в обеспечении иммуногенности токсино-продуцирующих штаммов В anthracis Установлено, что штамм, дефектный по секретируемому синтезу белка Sap, обладает индексом иммунитета в три раза ниже по сравнению с Sap+ изогенным вариантом
Показано, что белки S-слоя являются дополнительными факторами иммуногенности при главенствующей роли протективного антигена сибиреязвенного микроба
Практическая ценность.
Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" штаммы сибиреязвенного микроба КМ93 и КМ94, дефектные по секреции белка Sap Характерными особенностями штамма В anthracis КМ93 (В anthracis SterneATSap") являются нарушение выделения белка Sap в супер-натант, отсутствие плазмид токсинообразования и капсулопродукции Характерные особенности В anthracis КМ94 (В anthracis SterneATtp5Sap"Prt") - нарушение секреции белка Sap в супернатант, отсутствие плазмид токсинообразования и капсулопродукции, наличие маркеров антибиотикорезистентности (ЕпЛлп1), низкая активностью протеолитических ферментов Штаммы предназначены для изучения влияния Sap" мутации на иммуногенность сибиреязвенного микроба
Среди бесплазмидных штаммов В anthracis селектированы эффективные доноры белка Sap - штаммы В anthracis SterneAT и В anthracis 2-ая вакцина Ценковского pf и получены их протеазодефицитные производные Продуценты со сниженной активностью протеолитических ферментов позволяют свести к минимуму возможные потери белка S-слоя в процессе его выделения и очистки
Предложен способ селекции штаммов сибиреязвенного микроба, продуцирующих белок S-слоя В его основу положены обнаруженные различия культурально-морфологических свойств Sap+ и Sap" изогенных вариантов. Использование признаков, для которых возможна прямая селекция, существенно ускоряет и удешевляет процедуру рутинного отбора, сводящегося только к скринингу белковых профилей культуральных фильтратов различных культур По материалам диссертации составлены методические рекомендации "Селекция штаммов сибиреязвенного микроба, продуцирующих белок Sap S-слоя", одобренные Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" № б от 27 июня 2007 г ) и утвержденные директором РосНИПЧИ "Микроб"
Материалы диссертации используются в лекциях по генетике бакте-
рий на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб»
Основные положения, выносимые на защиту:
Штаммы В anthraas различаются по способности к продукции одного из белков S-слоя - Sap
Эффективными донорами белка Sap являются бесплазмидные производные штаммов В anthracis Sterne 34F2 и В anthraas 2-ая вакцина Цен-ковского На их основе получены протеазонегативные продуценты
3. Бесплазмидный производный вакцинного штамма В anthracis
СТИ-1 при культивировании in vitro характеризуется нарушением экскреции белка Sap
Белки, выделенные из культурального фильтрата штамма В anthracis SterneATPrf и экстракта клеточных стенок В anthracis СТИДТ относятся к структурам S-слоя сибиреязвенного микроба - Sap и ЕА1, на основании их молекулярной массы, особенностей аминокислотного состава, паракри-сталлической ультраструктуры, иммунореактивности и локализации на поверхности клетки
Белки S-слоя возбудителя сибирской язвы обладают протек-тивным эффектом и являются дополнительными факторами иммуногенности при главенствующей роли протективного антигена Токсинопродуцирующий штамм, дефектный по секретируемому синтезу белка Sap, обладает индексом иммунитета в три раза меньшим по сравнению с Sap+ изогенным вариантом
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 1 Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), IX Всероссийской научно-практическая конференции "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2004), XX Российской конференции по электронной микроскопии (г. Черноголовка, 2004), а также на ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2003,2004)
Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из которых 4 статьи в рекомендованных ВАК изданиях
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 33 отечественных и 174 зарубежных источников Общий объем диссертации составляет 137 страниц машинописного текста Текст иллюстрирован 5 таблицами и 17 рисунками
