Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 13
1.1. Общая характеристика экогруппы базидиальных ксилотрофов 13
1.1.1. Биологически активные вещества, обуславливающие полезные свойства базидиальных ксилотрофов 15
1.1.2. Grifolafrondosa как типичный трутовик - ксилотроф 17
1.2. Общие представления о лектинах 19
1.3. Лектины с позиций современной гликобиологии 20
1.3.1. Лектины: попытки классификации 20
1.3.2. Лектины и углеводный код 24
1.3.3. Факторы лектиновой активности 26
1.3.3.1. Субъединичная структура лектинов . 26
1.3.3.2. Посттрансляционная модификация и множественные формы лектинов 28
1.3.3.3. Расширенный центр связывания лектина с рецептором: конфигурационная и конформационная селективность связывающих сайтов 31
1.3.3.4. Гидрофобное связывание 3 7
1.3.4. Лектин-рецепторная система как реализация эпигенетического углеводного кода: организация и функционирование 38
1.4. Лектины базидиальных ксилотрофов 43
1.4.1. Лектины базидиомицетов: общая характеристика 43
1.4.2. Лектины базидиомицетов-ксилотрофов 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 51
2.1. Культуры микроорганизмов, использованные в работе 51
2.2. Условия выращивания микроорганизмов 52
2.3. Основные реактивы, использованные в работе 52
2.4.Выделение лектина с поверхности дикариотического мицелия 52
2.5. Постановка реакции гемагглютинации и получение нативных эритроцитов кролика 54
2.6. Определение специфичности выделенного лектина 55
2.7. Гель - электрофорез в денатурирующих условиях 56
2.8. Изучение химического состава лектина 56
2.9. Исследование морфолого-культуральных характеристик колоний G. frondosa 0917 в совместных культурах с A. brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантами 56
2.10. Изучение влияния препарата мицелиального лектина G. frondosa 0917 на подвижность клеток азоспирилл 58
2.11. Получение поликлональных кроличьих антител к лектину
G. frondosa 0917 . 59
2.12. Мечение лектина и специфических антител коллоидным золотом 59
2.13. Иммунодот-анализ на нитроцеллюлозной мембране 59
2.14. Получение Fab- и Fc- фрагментов антител 60
2.15. ИФА взаимодействия лектина со специфическими и неспецифическими антителами 60
2.16. Определение локализации лектина G. frondosa 0917 61
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 62
3.1. Обнаружение, выделение, физико-химические свойства и локализация мицелиального лектина G. frondosa 0917 62
3.1.1. Обнаружение и динамика лектиновой активности экстрактов дикариотического мицелия G. frondosa 0917 62
3.1.2. Выделение лектина G. frondosa 0917 63
3.1.3. Определение молекулярной массы лектина 65
3.1.4. Определение гликановой составляющей в растворах лектина 66
3.1.5. Углеводная специфичность лектина 67
3.1.6. Анализ химического состава лектина 69
3.1.7. Влияние температуры на стабильность лектина 71
3.1.8. Локализация лектина на мицелиальных гифах 72
3.2. Иммунохимические свойства мицелиального лектина G. frondosa 0917 73
3.2.1. Выявление специфичности связывания лектина G. frondosa 0917 с гомологичными антителами 75
3.2.2. Изучение взаимодействия лектина G. frondosa 0917 с негомологичными антителами методом ИФА 78
3.2.3. Расчет параметров взаимодействия лектина G frondosa 0917 со специфическими и неспецифическимими антителами 87
3.3. Изучение роли лектин - углеводных взаимодействий в контакте G frondosa 0917 и ризобактерий A. brasilense 93
3.3.1. Исследование морфолого-культуральных характеристик колоний G. frondosa 0917 в совместных культурах с A. brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантами 95
3.3.2. Изучение влияния мицелиального лектина G. frondosa 0917 на подвижность клеток азоспирилл 99
Заключение 103
Выводы 106
Список литературы 108
Благодарности 131
- Расширенный центр связывания лектина с рецептором: конфигурационная и конформационная селективность связывающих сайтов
- Определение специфичности выделенного лектина
- Обнаружение и динамика лектиновой активности экстрактов дикариотического мицелия G. frondosa 0917
- Изучение роли лектин - углеводных взаимодействий в контакте G frondosa 0917 и ризобактерий A. brasilense
Введение к работе
Актуальность проблемы. Интерес к высшим съедобным базидиомицетам (Basidiomycetes) как источникам вкусной и полезной биомассы, содержащей различные биологически активные вещества, непрерывно возрастает. Научные изыскания, предваряющие и обосновывающие начало массового промышленного культивирования тех или иных грибов, как правило, лишь констатируют наличие каких-либо полезных свойств и активностей, характеризующих конкретный грибной объект с положительной стороны. В связи с этим изучение активных метаболитов базидиомицетов, определение их биологического действия в связи с аспектами их жизнедеятельности представляют важную задачу.
Нельзя назвать случайным установленный факт, что практически все биологически активные вещества, продуцируемые базидиальными грибами, являются либо гликанами, либо гликоконъюгатами (Ikekawa, 2001; Wasser, 2002). В научном сообществе уже сложилось представление об особом значении гликозилирования белков как неотъемлемой части углеводного обмена различных организмов. Это представление базируется на современных позициях гликобиологии, доказывающих, что важнейшая функция углеводов в метаболизме любых организмов связана не только с энергетическим, но и биоинформационным потенциалом таковых, поэтому большое количество белков в организмах гликозилированы (Dwek, 1996; Drickamer, 1998; Reuter and Gabius, 1999). Функционирование некоторых метаболических систем, большей частью тех, что имеют экстраклеточную направленность, с использованием углеводного биоинформационного потенциала возможно благодаря осуществлению биоспецифического углевод-белкового взаимодействия. Подобное взаимодействие реализуется, в основном, с помощью лектинов, способных распознавать определенные углеводные детерминанты в клеточных структурах (как, например, в метаболической схеме процессов адгезии ризобиальных клеток к тканям корней бобовых и инициации симбиоза, в
реализации которых критическая роль отведена лектинам бобовых растений-макросимбионтов (Баймиев и др., 2005). То есть, если некоторые гликозидные структуры в живой клетке представляют собой определенный информационный потенциал (Laine, 1997; Solis et ai, 2001), то его реализация требует участия лектиновых субстанций (Lis and Sharon, 1998).
Активные многосторонние исследования лектинов растений, животных и бактерий ярче подчёркивают существенный пробел в научных работах по изучению лектинов базидиомицетов. Это представляется особенно важным в отношении экогруппы базидиальных ксилотрофов, являющихся продуцентами важных иммуномодулирующих и противоопухолевых гликанов и гликопротеинов. Анализ литературных данных показал, что исследования лектинов базидиомицетов немногочисленны и связаны, в основном, с выделением лектинов из плодовых тел, которые являются лишь кратковременными формированиями со строго определенной функцией. Крайне мало работ по изучению лектинов базидиомицетов на стадии дикариотического мицелия, основной и более значимой стадии роста грибного организма как биологического индивида. При этом подавляющее большинство исследований в этом направлении касаются представителей порядка Агариковых (Agaricales), вероятно, в силу наибольшего практического интереса к ним. Отмечалось, что у представителей другого порядка - Афиллофоровых (Aphyllophorales) или трутовиков - лектиновая активность обнаруживается редко (Konska, 2006). Несомненно, изучение лектинов как биоспецифических агентов в метаболизме базидиального ксилотрофа расширит спектр фундаментальных знаний о существовании и, возможно, реализации углеводного биоинформационного потенциала у этих организмов. Кроме того, подобные исследования имеют важное прикладное значение: лектины различного происхождения, в том числе выделенные из некоторых высших грибов (Debray et al., 1991; Guillot et al., 1990), выпускаемые как фармакологические препараты, широко применяются в
медико-биологических исследованиях (Mody et ah, 1995; Gabius, 1998; Gabius et al., 1998; Rudiger et al, 2000).
Трутовик Grifola frondosa, в силу исключительных свойств биомассы (к настоящему времени из плодовых тел и мицелия выделено около 30 биологически активных веществ, большей частью, полисахаридов) является объектом пристального изучения. Однако научный поиск имеет ярко выраженный прикладной характер: основной целью исследований является обнаружение и описание биологически активных гликанов и гликоконъюгатов, обладающих медицинским/фармакологическим эффектом. При этом материалом для работы являются, как правило, плодовые тела. Фундаментальный аспект изучения продукции и функционирования этих метаболитов в процессе развития самого базидиомицета, практически отсутствует. В доступной литературе обнаружена всего 1 работа по выделению лектина из плодовых тел этого гриба (Kawagishi et al, 1990b). На основании вышеизложенного, нами было предпринято исследование его лектиновой активности на стадии дикариотического мицелия.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось обнаружение, выделение и характеристика лектина с поверхности дикариотического мицелия базидиального ксилотрофа G. frondosa штамм 0917.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
Исследовать экстракты дикариотического мицелия G. frondosa 0917, полученного разными способами культивирования, и установить наличие у них лектиновой (гемагглютинирующей) активности.
Выделить гомогенный препарат лектина с поверхности дикариотического мицелия G. frondosa 0917, определить углеводную его специфичность и локализацию.
Изучить некоторые физико-химические, а также иммунохимические свойства выделенного лектина.
Исследовать возможную роль лектин-углеводного распознавания как биоспецифического взаимодействия при совместном культивировании G. frondosa 0917 с Azospirillum brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантов.
Оценить влияние изучаемого лектина на подвижность бактерий указанных штаммов в жидкой среде.
Научная новизна. Впервые с поверхности дикариотического мицелия выделен и очищен лектин с молекулярной массой 68±1 кДа, установлена его углеводная специфичность, состав; описаны некоторые физико-химические свойства.
Дана характеристика полученного лектина как антигена, включающая не только качественные, но также и количественные параметры его взаимодействия с антителами. Было установлено, что лектин G. frondosa 0917 способен к связыванию, как со специфическими, так и с неспецифическими поликлональными антителами кролика; последнее обусловлено взаимодействием лектина с олигосахаридами антител.
Впервые показано, что, несмотря на качественно различную аффинность лектина при взаимодействии с молекулами гомологичных и негомологичных антител, количественно эти взаимодействия обусловлены образованием примерно одинакового количества связей, о чем свидетельствуют близкие по значению величины изменения стандартной свободной энергии этих систем.
Установлено, что лектин-углеводные взаимодействия имеют место в процессах взаимораспознавания при спровоцированном контакте G. frondosa 0917 и бактерий A. brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантов, дефектных по ЛПС. При этом мутантные штаммы - КМ018 и КМ139, в клеточной стенке которых экспонирован ЛПСІ с гаптенным лектину мицелия ОПС1 распознаются грибом с наименьшим проявлением антагонизма, чем в случае штаммов КМ252 и КМ348, в состав клеточной стенки которых входит ЛПСП.
Выявлено, что мицелиальный лектин уменьшает подвижность бактерий A. brasilense Sp245 и КМ139 в жидкой среде.
Научно-практическая значимость. Получен гомогенный препарат
мицелиального лектина G. frondosa 0917 с необычной углеводной
специфичностью, который может применяться в исследованиях полимеров
клеточной стенки грамотрицательньгх бактерий, а также для
иммунохимических исследований, касающихся строения и
функционирования антител. Комплекс данных, полученных в настоящей работе, может послужить основой дальнейших фундаментальных исследований механизма функционирования лектин-рецепторной системы у базидиомицетов.
Работа выполнена в лаборатории микробиологии и микологии (ЛММ) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках бюджетных тем: "Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия" (направление 5.10), научный руководитель темы д.б.н., зав. ЛММ Никитина В.Е., № гос. регистрации 01970008158; «Роль углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов» (направление 5.10), ''' научный руководитель темы д.б.н., зав. ЛММ Никитина В.Е., № гос. регистрации 01200606184. Работа выполнялась также при поддержке гранта РФФИ 04-48129_а «Лектины ксилотрофных базидиомицетов разных систематических групп». Материалы диссертации использованы при выполнении дипломной работы кафедры микробиологии и физиологии растений биологического факультета СГУ им. Н.Г. Чернышевского.
Положения, выносимые на защиту
1. Проявление лектиновой активности, обнаруженной у экстрактов дикариотического мицелия G. frondosa 0917 в процессе культивирования на некоторых жидких и твердых средах, является наибольшим для легких смывов с поверхности 10-18-суточного мицелия при твердофазном культивировании при использовании нативных эритроцитов кролика.
Лектин, выделенный с поверхности дикариотического мицелия базидиального ксилотрофа G. frondosa 0917, имеет молекулярную массу 67±1кДа и состоит из двух субъединиц по 33-34 кДа.
Полученный лектин представляет собой гидрофильный термостабильный гликопротеин с соотношением частей протеин: гликан как 3:1; проявляет высокую специфичность к линейному D-рамнану — ОПС1, выделенному из ЛПСІ грамотрицательных диазотрофных ризобактерий A. brasilense Sp245.
Лектин G. frondosa 0917 взаимодействует как со специфическими (к лектину), так и с неспецифическими (к О-антигенам бактерий Sp245, SI 7) поликлональными кроличьими антителами, а также с у-глобулином человека. Связывание лектина с гомологичными антителами происходит с участием антигенсвязывающего центра (.Рдб-фрагментов). Взаимодействие лектина с негомологичными антителами обусловлено его связыванием с углеводной частью молекул антител.
Равновесные системы взаимодействия лектина G. frondosa 0917 с гомологичными и негомологичными поликлональными антителами характеризуются различной степенью аффинности. Однако различие в величинах изменений стандартной свободной энергии AG" обеих систем несущественно, что говорит о примерно одинаковом количестве связей, участвующих в контакте молекул лектина и антител обоих типов.
При совместном культивировании базидиомицета G. frondosa 0917 и ризобактерий A. brasilense штамма Sp245 и его Омегон-Km мутантов, дефектных по ЛПС, установлены биоспецифические лектин-углеводные взаимодействия, отражающиеся на морфологических характеристиках грибного мицелия. При этом с наименьшим антагонизмом распознаются штаммы A. brasilense, в клеточной стенке которых экспонирован ЛПСІ с гаптенным ОПС1.
Лектин G. frondosa 0917 в диапазоне концентраций 0.1-10 мкг/мл уменьшает подвижность азоспирилл штаммов Sp245 и КМ139 (с ЛПСІ);
подобного влияния на клетки штаммов КМ252 и КМ348 (с ЛПСП) не происходит.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 8 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века» (Пущино, Россия, 2004), на 3-ей Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2006), на 23-м Международном симпозиуме по углеводам (Уистлер, Канада, 2006), на 5-м Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, Россия, 2007), на 15-м Международном конгрессе европейских микологов (Санкт-Петербург, Россия, 2007), на Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, Россия, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2007» (Саратов, Россия, 2007).
Диссертационная работа обсуждена на расширенном заседании лаборатории микробиологии и микологии 28 ноября 2007 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 статьи в отечественных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 1 статья в зарубежном рецензируемом издании.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, изложения и обсуждения результатов работы, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 227 источников. Объем диссертации составляет 131 машинописных страниц. Работа содержит 19 рисунков и 5 таблиц.
Расширенный центр связывания лектина с рецептором: конфигурационная и конформационная селективность связывающих сайтов
Теоретически, если имеем п пар лектин-рецептор, то, в результате связывания лектина со своим рецептором, появляется возможность для дискретного генерирования п клеточных ответов. В действительности, как уже неоднократно отмечалось, количество ответов может быть значительно больше, поскольку для многих лектинов характерно наличие расширенного центра связывания, способного взаимодействовать не с одним, а с несколькими углеводными остатками.
Некоторыми исследователями было отмечено, что некоторые лектины распознают строго определенные аномеры сахаридов (Murphy and Goldstein, 1977; Ueda et al, 2002). Понятно, что аномерная специфичность для лектина с одним связывающим центром дает возможность для дискриминации двух гликоконъюгатных рецепторов, различающихся по конфигурации углеводных остатков в детерминанте. В случае же расширенного центра связывания у лектина можно ожидать гомо - и гетероаномерную специфичность для входящих в состав субцентров, что, понятно, существенно расширяет спектр селективного взаимодействия лектинов с рецепторами.
В настоящее время с использованием методов ЯМР-спектрометрии, рентген-кристаллографии высокого разрешения в сочетании с техникой компьютерного моделирования установлены основные принципы связывания лектина с углеводными детерминантами рецепторов (Тоопе, 1994), которые объясняют возможность взаимодействия его углеводсвязывающего сайта с несколькими углеводами. Согласно работе (Quiocho et al., 1991), основной вклад в свободную энергию Гиббса при образовании связи «лектин-углеводный, рецептор» осуществляется за счет образования водородных связей, в которых как донорами, так и акцепторами электронов являются гидроксильные группы углеводсвязывающего кармана (pocket) молекулы лектина и гаптенного сахарида, а также за счет сил Ван-дер-Ваальса (Bernardi et al., 2004) и гидрофобного эффекта.
На рисунке 2 показано, что образующиеся водородные связи могут быть трех типов: а) кооперативные; в) бидентатные, двуразветвленные («bidentate» -дословно «двузубый»); с) сетеобразные.
Факторами, обеспечивающими сродство лектина как лиганда, являются пространственная топология («геометрия») и конформационная динамика как углевода-рецептора, так и самого лиганда (von der Leith et al., 1998; Gabius et al., 2002). Важную роль в обеспечении аффинности играют также полярные молекулы растворителя - воды (Weis et al, 1992), а в некоторых случаях способность иногда присутствующих в растворе металлов к образованию координационных связей (там же) (рис. 3).
Было установлено, что движущей силой образования комплекса «лиганд (лектин)-углеводный рецептор» является линейная зависимость параметров энтальпии и энтропии, в соответствии с уравнением:
Параметры энтальпии были, в частности, определены калориметрическими методами при связывании некоторых моно- и дисахаридов с лектином мислетоэ (Franz et al., 1981) и лектином куриной печени, специфичных к D-галактозе, и равны -16,45 кДж/моль (в случае растительного лектина) и -23,12 кДж/моль (в случае лектина куриной печени) (Bharadwaj et al., 1999). Полученные значения отражают фундаментальные знания, показывающие взаимодействие между факторами энтальпии и энтропии и относящиеся к участию слабых межмолекулярных сил. Увеличение энтальпии для связывания лигандов, по сути, уравновешивается энтропийным фактором (penalty) (либо наоборот), что является примером энтальпийно-энтропийной компенсации (Dunitz, 1995). Как уже упоминалось, из-за наличия большого количества гидроксильных групп, ориентированных определенным способом (аксиально либо экваториально) в пространстве при углеродных атомах, логичным является предположение о преобладании водородных связей при образовании комплекса углевода-рецептора с лигандом (лектином). Когда пространственная топология двух ОН-групп или аксиальной ОН-группы и кислородного атома пиранозного кольца обнаруживает комплементарность боковой цепи определенной аминокислоты (амид или карбоксилат), то два соседних сайта связывающего кармана лиганда могут образовывать двойные водородные связи с каждой из перечисленных групп углевода (рис. 2В). Необходимость топологической комплементарности для образования сложной сети связей (рис. 2С) обуславливает не только энтальпию, но также и селективность в отношении аномеров (например, к а- или 0- D-галактозе) и эпимеров (к D-Gal или D-Man/D-Glc). Очевидно, аксиальная 4- ОН-позиция в D-галактозе и экваториальные 3-, 4- ОН-позиции в D-маннозе и D-глюкозе играют решающую роль в распознавании этих углеводов (Rini, 1995; Rini and Lobsanov, 1999). Вышеприведенные рисунки дают наглядное представление о потенциале образования водородных связей D-глюкозы.
Определение специфичности выделенного лектина
Специфичность лектина определяли методом ингибирования реакции гемагглютинации (там же) различными углеводами (Merck, Германия). В качестве ингибиторов были протестированы следующие углеводы и гликопроизводные: D-галактоза, D-глюкоза, D-манноза, D-фруктоза, L-рамноза, L-фукоза, L-арабиноза, D-ликсоза, D-ксилоза, L-талоза, D-лактоза, D-мальтоза, D-целлобиоза, D-меллибиоза, ТЯ-ацетил-Б-галактозамин, ІМ-ацетил-О-глюкозамин, Ы-ацетил-О-маннозамин, N,N-диацетил-хитобиоза, D-галактуроновая к-та, 2-дезокси-Г галактоза, D-галактозамин, D-глюкозамин, фенил-Р-Б-галактопиранозид, фенил-P-D-глюкопиранозид. Также были использованы ранее полученные препараты углеводных полимеров - О-специфических полисахаридов мембранных липополисахаридов грамотрицательных диазотрофных бактерий Azospirillum brasilense Sp 245, A. irakense KBCl, A. lipoferum Sp59b. Ранее была исследована структура повторяющихся углеводных звеньев (моноуглеводный состав, характер гликозидных связей, абсолютная конфигурация) в составе этих полисахаридов (Fedonenko et al, 2002; Fedonenko et al, 2004; Fedonenko et al, 2005), что делает обоснованным выбор таковых в качестве тест-ингибиторов. Препараты любезно предоставлены сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН.
Гель - электрофорез проводили в вертикальной камере (Helicon, Россия), используя 15% полиакриламидный гель с 0.1% додецилсульфата натрия. Окраску гелей осуществляли азотнокислым серебром. Реактивы для электрофореза, включая белки-маркеры, произведены фирмой Amresco, США.
Аминокислотный анализ осуществляли на анализаторе AAA 339 (ЧССР). Гидролиз образца проводили 6 н НС1 при 105С в течение 24 ч.
Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976).
Количество углеводов в растворах лектина определяли с помощью фенол-сернокислотной реакции (Dubois et al., 1956). После гидролиза образцов 4 н трифторуксусной кислотой в течение 4 ч, качественный состав выявляли методом ТСХ в системе: пиридин : этилацетат : вода : уксусная кислота в соотношении 5:5:3:1.
Суспензии бактериальных культур (1 мл), выращенных как описано в разделе 2.2., несколько раз отмытых стерильным 0.15 М ФСБ (см. раздел 2.3.) и доведенных до оптической плотности 0.5 (при А=590 нм), добавляли к 3-5-суточной культуре гриба на чашке Петри, равномерно распределяя суспензию шпателем по незанятой мицелием поверхности агаризованного сусла. С целью блокирования углеводсвязывающей области лектина, присутствующего на поверхности мицелия, растущие гифы до внесения бактериальных культур подвергали предобработке (30 мин при комнатной t) раствором очищенного препарата ОПС1 в концентрации 10 мкг/мл. Для этого навеску лиофильно высушенного препарата ОПС1 разводили до нужной концентрации стерильным 0.15 М ФСБ и обрабатывали кончики гиф мицелия (1 мл раствора), радиально растущего на чашке Петри с агаризованной средой.
Совместные культуры выращивали в термостате при- 26С. Исследования в рамках каждого из 2-х экспериментов проводили в 3 опытах по 3 повторности в каждом. Замер и описание совместных колоний осуществляли на 10 сут. Согласно (Методы экспериментальной микологии..., 1982), можно представить количественную характеристику роста мицелиальных культур, в качестве которой предложен ростовой коэффициент (РК), вычисляемый по формуле:
РК = dhg/t,
где d - диаметр колонии, мм; h - высота колонии, мм; g - плотность колонии, балл; t - возраст колонии, сут. Величина g оценивается по трехбалльной шкале (1 - редкая, 2 - средняя, 3 - плотная) (Бухало, 1988). В силу объективных причин, возникших в ходе экспериментов, в формулу ростового коэффициента нами введен еще один параметр - j (балл; четырехбалльная шкала), характеризующий морфологию колоний гриба по степени однородности поверхностного мицелия (1 - крайне неоднородная, с островками как плотного (прижатого), так и воздушного мицелия; 2 -неоднородная, морфологически отличный мицелий только в определенной зоне; 3- присутствие отличающегося по морфологии мицелия незначительно; 4 - однородная). Вычисление РК проводили по окончательной формуле:
PKj = dhgj/t, где t всегда равно 10 (сут). 2.10. Изучение влияния препарата мицелиального лектина G. frondosa 0917 на подвижность клеток азоспирилл
При исследовании влияния мицелиального лектина на подвижность азоспирилл, к 50 мкл бактериальных суспензий штаммов Sp245, КМ139, КМ252 и КМ348, дважды отмытых стерильным буфером (0.15 М ФСБ) от среды роста и доведенных до оптической плотности 0.5 (при А = 590 нм), добавляли по 50 мкл раствора лектина G. frondosa 0917 в диапазоне концентраций 0.1-1000 мкг/мл. Клетки штамма КМ018 в результате мутации утратили способность к движению, поэтому не были взяты в эксперимент. Среднюю скорость движения 50-100 бактериальных клеток определяли с использованием специально разработанной программы компьютерного анализа видеоизображения, полученного при просмотре препаратов "висячая капля" в фазово-контрастный микроскоп Jenaval, соединенный с цифровой видеокамерой Sony DCRRV900E. Скорость записи составляла 25 кадров/с. Видеофайлы в формате .avi сохраняли на компьютере и обрабатывали следующим образом: указанием стрелкой мыши компьютера выбирали клетку, начальное положение которой фиксировалось нажатием на правую клавишу мыши. При этом происходила смена кадра. Далее в покадровом режиме отмечалось положение клетки в декартовых координатах. При каждой смене кадра прорисовывалась траектория движения, подсчитывались пройденное расстояние и средняя скорость. Траектория движения записывалась в виде точечного графического файла, а пройденное расстояние и средняя скорость - в виде текстового файла. Количество подвижных клеток определяли, оценивая подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа при анализе видеофайлов длительностью 1 с (Schelud ko efor/.,2007).
Фотографии выполнены с помощью цифрового фотоаппарата Nikon. Статистическую обработку вели по -критерию Стьюдента. 2.11. Получение специфических поликлональных кроличьих антител к лектину G. frondosa 0917
Поликлональные кроличьи антитела к лектину G. frondosa 0917 получали троекратным введением (с интервалом в 2 недели) кроликам в подколенные лимфатические злы 0.5, 1.0 и 1.5 мг лектина, который смешивали в соотношении 1:1 при первой иммунизации с полным адъювантом Фрейнда, а при последующих - с неполным адъювантом. Кровь (50-70 мл) из краевой ушной вены кролика отбирали через неделю после последней иммунизации. Фракции IgG получали из антисывороток осаждением сульфатом аммония (Кэбот, Мейер, 1968). Концентрацию IgG в растворах определяли спектроскопически при длине волны А.=280 нм, принимая оптическую плотность раствора IgG в кювете /=1 см при концентрации белка 1 мг/мл равной 1.4 (Kabat, 1980). Методика ориентирована на преимущественное выделение иммуноглобулина G (IgG).
Обнаружение и динамика лектиновой активности экстрактов дикариотического мицелия G. frondosa 0917
Знание особенностей метаболизма базидиомицетов-ксилотрофов, позволяющего этим грибам занимать лидирующие позиции в ценозах и подавлять рост конкурентов, говорит о том, что система биораспознавания, функционирующая, несомненно, не без участия углевод-белковых взаимодействий с помощью лектинов, очень активна. Для получения сведений о наличии лектиновой активности у G. frondosa 0917, экстракты, полученные легким смывом с поверхности грибной биомассы, были протестированы с помощью реакции гемагглютинации. При этом биомасса представляла собой дикариотический мицелий разновозрастных культур (1-24 сут), который отбирали для анализа в процессе твердо- либо жидкофазного культивирования. В ходе исследований было установлено, что гемагглютинирующая активность обнаруживается во всех мицелиальных экстрактах. Различия в динамике ее проявления обуславливались в большей степени способом культивирования, а также природой эритроцитов, используемых в постановке реакции гемагглютинации. Так, экстракты не агглютинировали эритроциты кролика и человека, предобработанные трипсином. Напротив, нативные эритроциты кролика и человека 0 группы крови активно агглютинировались; величины титра гемагглютинации при этом разнились в зависимости от типа и состава среды культивирования. Наибольший стабильный титр гемагглютинирующей активности базидиомицета G. frondosa 0917 определен в отношении нативных эритроцитов кролика (рис. 5) и характерен для смывов с поверхности дикариотического мицелия 9—21-суточных культур в процессе роста на агаризованном пивном сусле.
В связи с этим было принято решение о выделении искомой субстанции из смыва с биомассы 18-суточного мицелия гриба. Такой возраст культуры представляет собой оптимальное соотношение количества биомассы и ее гемагглютинирующей активности, ідт
При попытке выделения гемагглютинирующей субстанции с поверхности мицелия столкнулись с определенными трудностями. Применение аффинной хроматографии, наиболее часто используемой для получения и очистки лектинов, было невозможным, так как специфический углевод-мишень для данного агглютинина не был установлен к тому моменту.
Ставшая традиционной методика выделения водорастворимых белков из экстрактов путем предварительного осаждения неорганическими (сульфат аммония) и органическими (этиловый спирт, ацетон) осадителями, с целью дальнейшего фракционирования осадка хроматографическими методами, оказалась несостоятельной: даже при 80% насыщении (NH SC количество осадка и, соответственно, последующий выход разделенных белков с хроматографической колонки, были крайне малыми. В методической литературе возможной причиной этого указываются небольшие молекулярные массы белков водорастворимой фракции (Остерман, 1985). Поэтому было принято решение фракционировать нативные экстракты без предварительного осаждения, полученные смывом 0.15 М ,; ФСБ с поверхности мицелиальных тканей. Для первичного разделения экстрактивной смеси по молекулярным массам белков предпринято фракционирование методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-75. При элюировании с колоночного геля детектор определял 7 белковых пиков, но качество их разделения не было удовлетворительным. Методы оптимизации процесса путем подбора оптимального соотношения высоты/диаметра столбца сефадекса и скорости элюции, а также варьирование элюентов не давали эффекта, заметно улучшающего разделение. Вероятно, основная масса гидрофильных белков на поверхности мицелия имела близкие по значениям молекулярные массы.
По многочисленным экспериментальным данным эффективным методом разделения является хроматография на ионообменных носителях. Поэтому было принято решение грубо разделенные на сефадексе гемагглютинирующие фракции, после концентрирования и диализа, переносить на колонку с ионообменником. С учетом рекомендаций (Остерман, 1985) выбор остановлен на слабом анионообменнике DEAEoyopearl 650М. Путем варьирования рН и концентрации ионов NaCl рабочего буфера, а также подбора способа элюции, удалось определить комплекс условий разделения смеси, причем так, чтобы интересующее вещество адсорбировалось на колонке, но не сильно связывалось с ней. Принятая схема выделения лектина описана выше в разделе 2.4. На рисунке 6 показано последовательное элюирование разделенных веществ, представленных в агглютинирующих фракциях, с колонки с DEAEoyopearl 650М, выполненное с помощью ступенчатого солевого градиента. Как видно, после выхода неадсорбированной фракции с рабочим буфером, гемагглютинин элюировали 0,25 М раствором NaCl.
Изучение роли лектин - углеводных взаимодействий в контакте G frondosa 0917 и ризобактерий A. brasilense
Установленная специфичность лектина G. frondosa 0917 к нетипичному углеводному полимеру D-рамнану - ОПС1 ЛПС A. brasilense Sp245 -является необычной. Как неоднократно отмечалось, лектин-углеводные взаимодействия, лежащие в основе процессов распознавания при становлении различного рода взаимоотношений между организмами, несут информационную нагрузку, влекущую, как правило, определенные изменения в жизнедеятельности организмов. Однако в доступной литературе мало работ, посвященных исследованию роли лектин-углеводных взаимодействий в жизнедеятельности грибов-базидиомицетов.
Азоспириллы - грамотрицательные диазотрофы, относящиеся к альфа субклассу протеобактерий. Особое внимание исследователей азоспириллы привлекают благодаря тому, что входят в группу ризобактерий, стимулирующих рост растений (Plant Growth-Promoting Bacteria: PGPR). Помимо способности фиксировать атмосферный азот, они оказывают положительное воздействие на рост и развитие растений, благодаря выделению в ризосферу фитогормонов, витаминов и других биологически активных веществ (Woo et al., 2002). У азоспирилл нет строгой приуроченности к конкретным видам растений, они широко распространены в почвах и вступают в ассоциативные взаимоотношения с корнями кормовых трав, злаков и других небобовых растений. То есть, в природе азоспириллы. и ксилотрофные базидиомицеты занимают разные экологические ниши» и практически не встречаются между собой. Учитывая изложенное, представляется логичным задать вопрос, будет ли лектин-углеводное распознавание существенным при искусственном контакте этих организмов и каким, положительным или отрицательным, будет характер этого взаимодействия?
ЛПС, представляющие собой уникальные биополимеры, являются конструктивными элементами клеточной оболочки грамотрицательных бактерий. Ранее было показано, что ЛПСІ, экспонированный в качестве наружной мембраны клеточных оболочек мутантных штаммов A.brasilense КМ018 и КМ139, имеет в своем составе ОПС1, в отличие от ЛПСП мутантных штаммов A. brasilense КМ252 и КМ348 с присутствующим в нем ОПС2. В состав наружных мембран клеток дикого штамма A.brasilense Sp245 входят ЛПС, имеющие оба ОПС. Как описано выше, оба ОПС идентичны по структуре повторяющегося звена (линейный D-рамнан), но, очевидно, имеют несколько отличную конформацию, возможно, из-за присутствия фосфатов в качестве минорных заместителей , что делает ОПС1 углеводным гаптеном для лектина G. frondosa 0917 при полном отсутствии сродства к лектину у ОПС2. Таким образом, обнаружение у лектина G. frondosa 0917 специфичности к ОПС1 A. brasilense Sp245 предоставило уникальную возможность изучения биоспецифичных взаимодействий при контакте этих чужеродных как в таксономическом, так и в экологическом плане, микроорганизмов. В связи с этим нами предпринята попытка изучения роли лектин—углеводного распознавания как биоспецифического взаимодействия при совместном культивировании G. frondosa 0917 с A. brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантов, дефектных по структуре ЛПС.
Для реализации поставленной задачи необходимо было подобрать условия эксперимента, при которых малейшие изменения в совместном развитии микроорганизмов немедленно отражались на морфолого-культуральных признаках и были явными. Поскольку контакт целостных организмов реализуется посредством множественных биохимических схем с участием различных сигнальных механизмов (которые у базидиомицетов практически не изучались), возникал определенный риск неверной трактовки полученных результатов. Условия проведения эксперимента, изложенные в разделе 2.9., удовлетворяли требованиям поставленной цели: на агаризованной среде заметны малейшие изменения морфологии мицелия в процессе роста, отмечался хороший рост биомассы одновременно как грибной, так и бактериальных культур; именно на агаризованной среде на основе пивного сусла, как упоминалось выше., отмечена наибольшая лектиновая активность мицелия G. frondosa 0917. Во избежание некорректных объяснений исследуемых явлений при контакте микроорганизмов, параллельно в качестве «ключевого» проводили эксперимент, условия которого отличались лишь кратковременной обработкой кончиков растущих мицелиальных гиф ОПС1, гаптенным лектину мицелия G. frondosa 0917. Результаты, полученные в. ходе исследования морфолого-культуральных характеристик колоний G. frondosa 0917 в совместных культурах с азоспириллами, приведены в таблице 5 и на рисунке 17. PKj для чистой (контрольной) культуры гриба определен как 131.48 ± 3.85. Данные таблицы показывают, что в сравнении с PKj чистой культуры, кокультуры с бактериями штаммов A.brasilense Sp245, КМ018 и КМ139 характеризуются большими, значениями PKj. Наименьшие значения PKj отмечены для смешанных культур с бактериями штаммов КМ252 и КМ348. PKj . в.; экспериментах с предобработкой мицелиальных гиф раствором ОИСГ отличаются, в целом, меньшими значениями, чем в экспериментах по совмещению чистых культур, но; в данном случае, значения PKj в культурах с КМ252 и КМ348 существенно ниже значений для совместных культур с. КМ018 и КМ139. Такие значения получены из-за коэффициента однородности, который для указанных кокультур является самым низким І (морфология мицелия крайне неоднородна).
Похожие диссертации на Выделение и характеристика мицелиального лектина базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray
