Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
1.1. Стволовые клетки сперматогонии у млекопитающих 15
1.2. Пролиферация и дифференцировка сперматогоний типа А. 18
1.3. Факторы, стимулирующие пролиферацию и дифференцировку 21 сперматогоний
1.4. Сперматогенез у различных видов млекопитающих 23
1.5. Выделение стволовых клеток сперматогоний млекопитающих 28 и культивирование in vitro
1.6. Трансплантация СКС 32
1.7. Заключение 34
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36
2.1. Подготовка животных 36
2.2. Приборы и оборудование 36
2.3. Культуральные среды, растворы и реактивы 39
2.3.1. Ростовые среды 39
2.3.2. Специальные среды и растворы 39
2.4. Культуральная посуда 41
2.5. Приготовление фидерных слоев для культивирования СКС 42
2.5.1. Культивирование STO-фибробластов и перевиваемых 42 клеток Сертоли свиней
2.5.2. Получение первичных клеток Сертоли свиней и их 42 культивирование
2.5.3. Субкультивирование клеток 43
2.5.4. Подавление пролиферативной активности клеток 44 фидерных слоев
2.6. Выделение культур клеток из семенника самца свиньи 44
2.6.1. Механический метод выделения 44
2.6.2. Ферментативный метод выделения 44
2.6.3. Очистка стволовых клеток сперматогоний типа А от других клеточных типов семенника 45
2.7. Идентификация стволовых клеток сперматогоний типа А свиньи in vitro
2.7.1. Идентификация СКС в образцах фиксированных тканей 45
2.7.2. Идентификация СКС в культуре 46
2.8. Введение молекул экзогенной ДНК в клетки Сертоли свиньи, STO-фибробласты и культуры клеток, выделенные из семенников самца свиньи46
2.8.1. Происхождение рекомбинантной конструкции, используемой в экспериментах 46
2.8.2. Приготовление ДНК 47
2.8.3. Введение экзогенной ДНК электрическим пробоем 47
2.8.4. Выявление продукта экспрессии (бета-галактозидазы) в трансфецированных клетках47
2.9. Трансплантация стволовых клеток сперматогоний типа А свиней в семенники стерильных реципиентов 48
2.9.1. Формирование экспериментальных групп животных 48
2.9.2. Выключение сперматогенеза у животных-реципиентов 48
2.9.3. Получение культур клеток из семенников донора 49
2.9.4. Введение клеток донора в семенники животных- реципиентов 49
2.9.5. Анализ эффективности возобновления сперматогенеза у реципиентов клетками донора
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 51
3.1. Изучение динамики сперматогенеза и характеристика клеточных типов семенника свиньи в образцах фиксированных тканей .
3.2. Влияние возраста хрячков на получение обогащенной культуры СКС. 55
3.2.1. Определение оптимального возраста хрячков для 56
получения обогащенной культуры СКС на основе анализа образцов фиксированных тканей.
3.3. Выделение СКС из семенников самцов свиней 57
3.3.1. Сравнительный анализ эффективности механического и ферментативного способов выделения культур клеток из семенников свиней57
3.3.2. Очистка СКС от других клеточных типов семенника. 61
3.4. Характеристика клеточных типов семенника в культуре 62
3.5. Культивирование СКС 64
3.5.1. Влияние различных монослоев соматических клеток на поддержание СКС в культуре.
3.5.2. Влияние ростовых факторов на культивирование СКС свиньи 68
3.6. Сравнительный анализ компетентности различных типов клеток к поглощению рекомбинантной ДНК
3.7. Обработка животных-реципиентов бусульфаном с целью 72 выключения их собственного сперматогенеза 64
3.7.1. Влияние кратности обработок бусульфаном на дегенерацию стволовых клеток сперматогоний типа А 73
3.7.2. Влияние обработок бусульфаном на физическое состояние животных-реципиентов
3.8. Введение донорских СКС типа А свиньи в семенники животных-реципиентов
3.9. Анализ эффективности трансплантации донорских клеток 77
3.10. Исследование динамики экзогенного сперматогенеза у животных-реципиентов
4. ОБСУЖДЕНИЕ 83
5. ВЫВОДЫ 101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 103
- Стволовые клетки сперматогонии у млекопитающих
- Подготовка животных
- Изучение динамики сперматогенеза и характеристика клеточных типов семенника свиньи в образцах фиксированных тканей
Введение к работе
Благодаря активному развитию клеточной биологии и клеточной инженерии открыт перспективный путь к созданию животных со стабильной интеграцией и экспрессией рекомбинантной ДНК в геноме (трансгенные животные). Трансгенные животные могут использоваться как модели для изучения болезней человека и животных, в генной терапии, для улучшения физиологических свойств и продуктивности домашних животных (животные, обладающие общей генетической устойчивостью к различным заболеваниям и неблагоприятным факторам внешней среды, информационным иммунитетом к возбудителям основных эпизоотий, стресс-устойчивостью и т.д.), а также в качестве источников необходимых человеку фармакологических (эритропоэтин, интерферон, инсулин, альбумин, факторы свертывания крови и др.) и технических (химозин и др.) белков [1,2,6,29].
В настоящее время разработаны новые современные подходы получения трансгенных животных. Широко применяются такие методические приемы как: микроинъекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус, использование трансгенной спермы в качестве вектора, получение зародышевых химер с помощью эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), ретровирусная трансфекция эмбрионов [3,17,25,27,30,130]. Перенос генов в геном животных возможен на различных стадиях эмбрионального и постнатального развития организма [10,11].
Особенную актуальность в этом направлении приобретают методы клеточной инженерии, позволяющие получать культуры стволовых клеток. [147,155]. Стволовыми клетками принято считать клетки, способные самообновляться, т.е. неограниченно делиться на протяжении длительного времени, по крайней мере, в течение жизни организма. Из каждой стволовой клетки при делении образуются две дочерние, одна из которых способна самообновляться, а другая обладает определенной потенцией к дифференцировке. Стволовые клетки, дающие начало одному виду дифференцированных клеток называют унипотентными, двум - бипотентными, нескольким видам в пределах одного тканевого вида (например, клеткам крови) - полипотентными. Стволовые клетки, обладающие неограниченными потенциями к цитодифференцировке, способные реализовать генетическую информацию ядер клеток, обеспечивая их дифференцировку, а также развитие до целого организма называют тотипотентными [27].
Единственным источником потенциально тотипотентных диплоидных клеток во взрослом организме млекопитающих являются стволовые клетки сперматогонии (СКС). Уникальное свойство стволовых клеток сперматогоний многократно самообновляться открывает широкие возможности реализации потенциала этих клеток в создании новых видов животных с измененным геномом. У половозрелых самцов популяция диплоидных стволовых клеток сперматогоний постоянно обновляется и производит потомство клеток, которое инициирует комплексный процесс дифференцировки, приводящий к появлению высоко специализированных половых клеток - сперматозоидов. Теоретически одна сперматогониальная стволовая клетка способна сформировать 4096 сперматид [48]. После оплодотворения, дополненные женскими гомологами, сперматозоиды участвуют в эмбриогенезе, и в итоге, в дифференцировке каждой клетки организма. В этом случае стволовые клетки сперматогонии могут считаться тотипотентными. И хотя женские ооциты, имеющиеся у половозрелых особей, и принимают генетическое участие в создании потомства, они не являются самообновляющимися - при рождении их имеется конечное количество, которое постоянно уменьшается в течение жизни самки. Поэтому стволовые клетки сперматогонии, по существу, являются единственным самообновляющимся типом клеток у половозрелого животного, способным обеспечить генетический вклад в получение следующего поколения [47].
В настоящее время ряд ученых из ведущих научно-исследовательских институтов мира занимаются изучением различных аспектов, связанных с выделением, культивированием, генетической трансформацией, трансплантацией стволовых клеток сперматогоний млекопитающих, в том числе сельскохозяйственных животных и человека [48,50,64,133]. Актуальность этих исследований заключается в том, что наряду с теоретическими изысканиями поднимаются такие важные практические задачи, как лечение бесплодия (например, после курсов химио- и радиотерапии при лечении рака), регулирование рождаемости у людей, получение животных с улучшенными полезно-хозяйственными признаками и др. [133,21,22].
Пролиферация и дифференцировка сперматогоний являются комплексным процессом, который включает в себя многие регуляторные факторы и межклеточные взаимодействия, что создает большие трудности в изучении этих сложных процессов in vivo. В связи с этим выделение С КС из тестикул млекопитающих, манипуляции с ними in vitro и пересадка их в семенники реципиента открывают новые возможности в изучении сперматогенеза и проведении геномных манипуляций у млекопитающих, и представляют собой одно из перспективных направлений в клеточной биологии.
Ядра стволовых клеток являются ценным материалом для конструирования новых клеточных типов в процессе клонирования. Исследования по клонированию животных путем пересадки ядер развиваются очень интенсивно. Показана возможность клонирования крупного рогатого скота, овец и кроликов путем трансплантации ядер бластомеров в энуклеированные ооциты [14]. При этом исходным материалом служили 4-64-х клеточные эмбрионы. В настоящее время ведутся успешные попытки использования ППЗК в качестве доноров ядер. Так, в США в 1997 году впервые удалось получить клонированного теленка по кличке «Ген» [148]. Исходным материалом для клонирования послужили ядра ППЗК крупного рогатого скота, полученные из закладок гонад плода теленка в возрасте 30 суток.
Сперматогенные клетки - сперматогонии типа А вполне могут служить источником ядер для реконструирования зигот с целью получения животных с заведомо известными признаками. Первой попыткой использования сперматогоний в качестве источника ядер для трансплантации в энуклеированную клетку, с целью определения их потенций, являются исследования, проведенные на лягушках [39]. На человеческих яйцеклетках показано развитие до стадии морулы после 72 часов культивирования реконструированных клеток, полученных путем трансплантации сперматогоний в энуклеированные созревшие ооциты на стадии метафазы II [160]. Актуальность исследований в данном направлении очевидна, т.к. уникальное свойство СКС - потенциальная тотипотентность дает возможность клонирования самцов млекопитающих с помощью трансплантации ядер сперматогоний, полученных из тестикул [143,142].
Очень перспективный подход для получения трансгенных животных посредством использования мужских стволовых клеток был предложен Бринстером и Авербаком [48]. Они разработали технику, с помощью которой возможна трансплантация клеток, выделенных из семенника донора, в мышиные семенные канальцы стерильных самцов реципиентов. В результате проведенных этими авторами исследований, была показана способность трансплантантов возобновлять нормальный сперматогенез у мышей и крыс.
В данном направлении рядом ученых из разных лабораторий ведутся активные исследования. В основном при изучении СКС используются лабораторные животные - мыши и крысы [133,47,93], однако в последнее время появились публикации, в которых объектами изучения являются СКС сельскохозяйственных животных [90,85].
Стволовые зародышевые клетки млекопитающих могут использоваться в качестве вектора для переноса рекомбинантной ДНК в организм животных. Модификации стволовых клеток сперматогоний до пересадки должны повлиять на развитие яиц, оплодотворенных сперматозоидами, полученными из трансформированных стволовых клеток. Возможность введения в стволовые клетки экзогенной ДНК имеет значение для широкого ряда экспериментальных работ, например для развития генной терапии и трансгенезиса [27].
Таким образом, в контексте выше изложенного, и в связи с тем, что данных по изучению СКС крупных сельскохозяйственных животных, в том числе свиней, недостаточно, направление исследований по изучению СКС свиньи является перспективным и актуальным для развития сельскохозяйственной биотехнологии.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлось выделение, характеристика и трансплантация стволовых клеток сперматогоний типа А хряков. В связи с этим были поставлены следующие задачи: изучить динамику сперматогенеза у местных помесных хряков в образцах фиксированных тканей; оптимизировать существующие методические приемы, позволяющие изолировать СКС типа А из семенников хряка; подобрать оптимальные условия, влияющие на поддержание СКС в недифференцированной форме при краткосрочном культивировании и охарактеризовать СКС в культуре; оптимизировать схему трансплантации СКС свиней в семенники стерильных реципиентов; изучить возможность колонизации клетками донора семенных канальцев стерильного реципиента и возобновления в них сперматогенеза.
Научная новизна. Впервые изучена динамика сперматогенеза у местных помесных свиней и установлен возраст хрячков, при котором сбор СКС типа А является максимальным.
Разработан эффективный и недорогой метод выделения стволовых клеток сперматогоний из семенников местных помесных хряков и предпринята попытка создания оптимальных условий для их культивирования. Изучена роль и проведен сравнительный анализ использования различных монослоев и ростовых факторов для поддержания СКС в культуре в недифференцированном виде.
Впервые, с учетом морфо-физиологических характеристик свиней, модифицирована и оптимизирована схема трансплантации донорских клеток в семенники стерильных реципиентов, предложенная ранее для мышей, и разработан метод обработки животных бусульфаном с целью выключения эндогенного сперматогенеза.
Показано на свиньях, что СКС донора возобновляют в семенных канальцах реципиента полноценный сперматогенез с выработкой зрелых сперматозоидов.
Практическая ценность работы. Полученные экспериментальные данные по выделению очищенной популяции СКС типа А свиньи, проведении с ними манипуляций in vitro и пересадке их в семенники реципиента представляют практическую ценность в связи с эффективностью и низкой стоимостью разработанных методических приемов, что позволит в будущем использовать стволовые клетки сперматогонии типа А, обладающие уникальным свойством - самообновлением в течение всей жизни животного, в качестве вектора для переноса рекомбинантной ДНК в геном реципиентов с целью получения животных с заведомо известными признаками.
Основные положения, выносимые на защиту: -влияние возраста хряков на получение обогащенной культуры СКС типа А; -метод выделения и очистки стволовых клеток сперматогоний типа А свиньи; -характеристика стволовых клеток сперматогоний типа А свиньи; -влияние ростовых факторов и монослоев фидерных клеток на поддержание СКС свиньи в культуре; -схема обработки самцов свиней бусульфаном с целью подавления эндогенного сперматогенеза; -потенции СКС свиней возобновлять сперматогенез в семенных канальцах хряков, характеризующихся половой стерильностью, после трансплантации в них донорских клеток.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на 2-ой Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», ВНИИСХБ, г.Москва, октябрь 2000г; на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», ВНИИЖ, п.Дубровицы, ноябрь 2001 г; на научно-практической конференции, п.Быково, июль 2001; на 7-ом мировом конгрессе генетиков (7 th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production), Montpellier, France, 2002.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 научные работы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 119 стр., содержит 5 табл., 29 рис. (в т.ч. 23 фотографии, 2диаграммы), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 162 литературных источников, в т.ч. 129 на иностранном языке.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Стволовые клетки сперматогонии у млекопитающих.
Как всякая самообновляющаяся популяция, сперматогониальная популяция содержит стволовые клетки. Серией экспериментальных данных было достоверно установлено что стволовыми клетками сперматогенеза у непримитивных млекопитающих являются сперматогонии типа А [62,19,47,20,32,7]. В течение жизни организма эти клетки могут либо поддерживаться без дальнейшей дифференцировки, формируя новые дочерние клетки, либо пролифелировать с образованием ряда генераций. При этом каждая последующая генерация оказывается более дифференцированной, чем предыдущая.
Сперматогонии являются самыми молодыми мужскими половыми клетками. Известно, что в эмбрионах млекопитающих линия зародышевых клеток начинается с примордиальных половых клеток (гоноцитов). Считается, что развитие нормальных тестикул зависит от пролиферации примордиальных зародышевых клеток и их взаимосвязи с предшественниками клеток Сертоли [103]. Сперматогонии возникают у зародыша после соматической дифференцировки ткани семенника из недифференцированных половых клеток гоноцитов (протогоний).
Тщательный анализ гистологических препаратов, приготовленных из ткани тестикул, позволил исследователям заключить, что стволовые клетки сперматогонии (СКС) располагаются в пристеночном слое семенных канальцев и лежат изолированно [19,20,7]. Было обнаружено, что первые деления сперматогоний идут независимо от цикла сперматогенного эпителия, и лишь впоследствии деления становятся регулярными, строго упорядоченными в пространстве и времени [82]. Благодаря этой особенности протекания сперматогенеза стало возможным установить время и местонахождение СКС на разных стадиях сперматогенеза и идентифицировать их морфологически [58,87,84].
Анализ литературных данных показал, что у мышей, крыс, оленей такой клеткой является сперматогония типа А0 или некоторые авторы называют ее тип А-изолированная, у обезьян - сперматогония типа А-темная, у человека - сперматогония типа А-удлиненная [58,86,84].
СКС имеет круглое ядро с диффузным хроматином, равномерно распределенным по ядру, содержащему одно или два четко очерченных ядрышка. В цитоплазме СКС содержится небольшое количество органел и митохондрий с трубчатыми или поперечными кристами и много свободных рибосом и полисом. Комплекс Гольджи и эндоплазматический ретикулум развиты слабо [19]. Эта клетка характеризуется высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением - имеет крупное ядро и узкий ободок цитоплазмы.
Ряд исследователей считают, что стволовые клетки сперматогонии можно подразделить на две субпопуляции: долгоживущие стволовые сперматогонии типа А и быстрообновляющиеся стволовые сперматогонии типа А [69,70].
Долгоживущие стволовые сперматогонии типа А спорадически делятся, чтобы поддерживать пул стволовых клеток на постоянном уровне. Так, при сокращении числа стволовых клеток сперматогоний типа А (например после облучения) митотическая активность этих клеток резко возрастает. Однако механизм регуляции численности популяции стволовых клеток остается невыясненным. На срезах семенных канальцев число СКС типа А постоянно и не зависит от цикла сперматогенного эпителия. Строение и функции покоящихся клеток млекопитающих были подробно описаны О.И.Епифановой с соавт. [12].
Быстрообновляющиеся стволовые сперматогонии типа А в течение цикла сперматогенного эпителия делятся только один раз. Деление этих клеток приводит к появлению клеток, которые не могут завершить цитокинез и остаются соединенными цитоплазматическими мостиками. Эти, так называемые сперматогонии типа А-спаренные, являются первой ступенью на пути к дифференцировке стволовых сперматогоний в высоко дифференцированные сперматозоиды. [87,115,102,88].
Некоторые исследователи подразделяют сперматогонии на сперматогонии типа А-бледные и сперматогонии типа А-темные, которые, вероятно, выполняют разные функции в процессе сперматогенеза. Роль темных и светлых сперматогоний типа А остается невыясненной, однако ряд авторов [59,9] считают, что светлые клетки относятся к стволовым, а темные к «резервным», которые в обычных условиях остаются покоящимися.
Другие авторы [138] классифицируют сперматогонии на 3 первичных типа: стволовые клетки сперматогонии, пролиферативные сперматогонии и дифференцирующиеся сперматогонии. Первые две группы часто объединяют и распознают как недифференцирующиеся сперматогонии.
Некоторые эксперименты показывают, что клетки, классифицированные по морфологическим критериям как стволовые клетки сперматогонии и пролиферативные сперматогонии, способны самообновляться [138,74,58,87]. До полового созревания и в течение остального периода жизни организма стволовые клетки сперматогонии претерпевают постоянную репликацию, тем самым, сохраняя свое число в течение процесса, называемого обновлением состава стволовых клеток [58,87]. Кроме того, часть пролиферативных сперматогоний претерпевает сложную цепь цитодифференцировки, в результате которой образуются зрелые сперматозоиды.
В более редких случаях, классификация популяции стволовых клеток, вероятно, основана на их способности переживать вредные влияния со стороны окружающей среды [138,74]. Известно, что из всего ряда сперматогенных клеток именно стволовые клетки сперматогонии наиболее устойчивы к различным повреждающим факторам и часто только эти клетки выживают, в то время как остальные типы клеток сперматогенного ряда погибают [47,93,90].
1.2. Пролиферация и дифференцировка сперматогоний типа А.
В результате длинной серии цитологических преобразований, совершающихся в клетках сперматогенного эпителия, из относительно мало дифференцированной сперматогонии формируется высоко дифференцированная уникальная клетка - сперматозоид, способная к автономному существованию и оплодотворению яйцеклетки.
Эти преобразования (сперматогенез) условно подразделяют на несколько стадий [100,95,99,8,19,20,4]. На первой стадии - стадии размножения, или сперматоцитогенеза, происходит митотическое размножение сперматогоний, в результате чего каждая последующая генерация оказывается более дифференцированной, чем предыдущая. После стадии размножения следует стадия роста. Сперматогонии прекращают деления и начинают увеличиваться в объеме, происходит перекомбинация генетического материала и образуются тетрады. На эту стадию падает длинная профаза мейоза. Сперматогонии преобразуются в сперматоциты 1 порядка. Во время третьей стадии - созревания - происходит два деления созревания, или мейоз. На этой стадии число хромосом сокращается вдвое, и из сперматоцитов 1 порядка образуются сперматоциты 2 порядка, а затем сперматиды. После мейоза начинается последняя стадия - спермиогенез. Гаплоидные клетки - сперматиды не делятся, однако в результате сложных цитологических превращений претерпевают значительные изменения и трансформируются в зрелые сперматозоиды.
Пролиферация и дифференцировка сперматогоний является комплексным, упорядоченным процессом, в который вовлекаются различные регуляторные факторы и межклеточные взаимодействия. Многие молекулы участвуют в процессе дифференцировки, включая систему с-ки факторов стволовых клеток, РНК, связывающую белок, циклический Б2, ретиноевую кислоту и др. [64].
Соотношение между самообновлением и дифференцировкой стволовых клеток регулируется, как предполагается, при помощи линейных производных нейротропного фактора глиальных клеток, продуцируемого клетками Сертоли, тогда как рецепторы экспрессируются в стволовых клетках.
При изучении процесса сперматогенеза было обнаружено, что мужские половые клетки обычно не развиваются одиночно. При каких-то пока еще неизвестных условиях стволовые клетки переходят к клеточным делениям, которые не завершаются цитокинезом. В результате этого возникают синтициальные скопления - клоны, в которых потомки одной клетки остаются соединенными цитоплазматическими мостиками [75,134]. Неклональное развитие мужских половых клеток является исключением и встречается среди некоторых низших беспозвоночных: губок, кишечнополостных и плоских червей.
Значение синхронности развития синтициальных клонов до сих пор остается неясным, как и функциональное значение синтициального развития клонов мужских половых клеток.
Известно, что деление стволовых клеток сперматогоний типа А0 приводит либо к образованию двух дочерних стволовых клеток, либо к образованию сперматогоний, вставших на путь дифференцировки. В результате появляются сперматогонии типа А-спаренные, которые не могут завершить цитокинез и остаются соединенными цитоплазматическими мостиками. Расстояние между двумя клетками не превышает 25 мкм. Деление сперматогоний типа А-спаренных приводит к появлению цепочек клеток, соединенных цитоплазматическими мостиками - сперматогоний типа А-групповых, которые в свою очередь трансформируются в сперматогонии типа А]. Далее происходят последовательно сменяющие друг друга деления, при которых образуются сперматогонии А2, А3, А4, промежуточные сперматогонии и сперматогонии типа Б [7,19,20,32].
Клетки этих генераций сходны с клетками сперматогоний типа А0, но постепенно приобретают небольшие морфологические различия. Например, в ходе делений сперматогонии становятся меньше. Однако наиболее заметные изменения совершаются в ядрах сперматогоний - в процессе дифференцировки происходит постепенная конденсация хроматина. Так, в сперматогониях типа А2 хроматин в виде небольшого скопления обнаруживается в нуклеоплазме или у ядерной мембраны, а в сперматогониях типа А3 и А4 количество таких участков значительно увеличивается. Овальные ядра сперматогоний промежуточного типа содержат еще большее количество гранул компактного хроматина и в ядрах сперматогоний типа Б хроматиновые гранулы образуют как бы неровную корочку у ядерной мембраны.
В результате была предложена модель обновления сперматогоний, на основании которой сперматогониальная популяция подразделяется на три компартмента [116]: 1) компартмент обновляющихся клеток, содержащий сперматогонии типа А-стволовые; 2) компартмент недифференцированных клеток, включающий сперматогонии типа А- спаренные и типа А-групповые; 3) компартмент дифференцирующихся клеток, к которому относятся сперматогонии типа А[ - А4, сперматогонии промежуточного типа и сперматогонии типа Б. Сперматогонии типа Б являются последними клетками в ряду сперматогониальных митозов, в результате их деления образуется новый тип клеток сперматогенного эпителия - сперматоциты 1 порядка. Затем в результате двух делений созревания (мейоза) происходит преобразование сперматоцитов 1 порядка в сперматоциты 2 порядка и в гаплоидные клетки - сперматиды. В результате сложных цитологических преобразований, затрагивающих все органеллы клетки, без дальнейших делений, происходит образование сперматозоидов из сперматид.
1.3. Факторы, стимулирующие пролиферацию и дифференцировку сперматогоний.
Установлено, что существует тесная взаимосвязь между половыми клетками и их окружением. Большую роль в пролиферации и дифференцировке сперматогоний играют вещества, вырабатываемые в соматических клетках и внеклеточном матриксе (ВМ), тогда как рецепторы к ним вырабатываются в самих сперматогониях.
Например, определено, что большое количество ростовых факторов продуцируется клетками Сертоли [113,90]. К ним относят фактор стволовых клеток (8СБ), активин, инсулиноподобный фактор роста, трансформирующие факторы роста, фактор роста семенников, фактор роста, секретируемый клетками Сертоли. Кроме этих факторов, факторы роста, вырабатываемые миоидными клетками стенок семенных канальцев, клетками Лейдига и тестикулярными макрофагами могут также влиять на регуляцию сперматогониальной пролиферации и дифференцировки. Показано, что фактор, ингибирующий лейкемию (ЫБ) - цитокин, продуцируемый миоидными клетками тестикул крыс, повышает выживаемость пролиферирующих гоноцитов и стимулирует пролиферацию покоящихся гоноцитов при совместном культивировании с клетками Сертоли [68,80]. Фактор, стимулирующий рост гранулоцит- макрофаговых колоний (вМ-СБЕ) - гликопротеиновый гормон, продуцируемый тестикулярными макрофагами в очень высоких концентрациях, один или в сочетании с другими факторами играет роль в процессе самовозобновления или дифференцировки сперматогоний [113]. Макрофаги составляют до 25% интерстициальной клеточной популяции млекопитающих, включая свиней.
Особенное место среди механизмов, влияющих на пролиферацию и дифференцировку сперматогоний занимает система с-кН факторов.
В последние годы рядом авторов [53,79,112,152] показано, что процессы пролиферации и/или дифференцировки связаны с экспрессией с- ки протоонкогена в цитоплазме сперматогоний. Yoshinaga с колл. [159] сообщили, что выживаемость и пролиферация сперматогоний типа А]-А4 зависит от c-k.it протоонкогена, тогда как сперматогонии типа А0 являются c-kit независимыми. Основой для подобного заключения послужило выдвинутое ранее Clermont с колл. предположение о существовании двух популяций стволовых клеток сперматогоний: возобновляющихся или пролиферативных сперматогоний типа А1-А4 и резервных сперматогоний типа А0 [58,70].
Недавно продемонстрировано, что лигандом к c-kit рецептору является feY-лиганд (stem cell factor, stell factor), который является продуктом клеток Сертоли [150]. Kit-лигшд представляет из себя гликопротеин, который существует в двух формах: мембранно-связанной и растворимой. Показано, что растворимая форма c-kit лиганда стимулирует синтез ДНК в сперматогенных клетках [136]: c-kit лиганд связывается с с- kit рецептором сперматогоний, который представляет собой трансмембранный рецептор тирозин киназы [42,41,137,126,158], и посредством этого инициирует пролиферацию и дифференцировку сперматогоний. Dym с колл., путем гибридизации общей РНК со специфической с- ДНК, выявили у мышей синтез c-kit рецептора в сперматогониях [71]. При этом они наблюдали два транскрипта мРНК, колеблющихся в пределах 4,8 Кв и 12 Кв. Локализация с-kit рецепторов в изолированных клетках была обнаружена путем иммуноцитохимического анализа с использованием антител к c-kit белку. Специфическое окрашивание c-kit рецепторов наблюдалось в цитоплазме изолированных СКС типа А. Более того, с помощью Вестерн-блот анализа была подтверждена экспрессия c-kit рецепторов в сперматогониях крыс, при этом использовались те же антитела. [71]. Поликлональные антитела в большинстве клеток, прижизненно помеченных [S ] метионином, узнавали две формы c-kit рецептора - приблизительно в 160 KDa и 124 KDa, что давало возможность предположить, что они могут соответствовать различным белкам.
Вероятно, белок в 124 КЮа может быть незрелой формой, а белок в 160 1Ша совершенно зрелой гликолизной формой с-кії.
Трансмембранный рецептор тирозин-киназа кодируется с-кії протоонкогеном. Путем фосфориляции этот рецептор связывается с кії- лигандом и посредством этого инициирует пролиферацию и/или дифференцировку сперматогоний. Обычно считают, что связывание кії- лиганда с тирозин-киназными рецепторами является началом сигнального процесса для активации фактора роста при клеточной пролиферации или дифференцировке. Активированная киназа взаимодействует прямо или косвенно с комплексом клеточных протеинов, которые передают сигнал от плазмы мембраны к ядру.
Открытие нового ростового фактора (Ьї-лиганд - система с-кії рецепторов) в популяции стволовых клеток сперматогоний типа А является важным моментом при идентификации этих клеток (с-кії рецептор может быть использован в качестве маркера), а также при изучении факторов, контролирующих клеточный распад, возобновление или дифференцировку сперматогоний.
1.4. Сперматогенез у различных видов млекопитающих.
Процесс сперматогенеза у млекопитающих является общей суммой всех событий, протекающих в семенных канальцах тестикул, в результате которых вырабатываются уникальные клетки сперматозоиды, способные к автономному существованию и оплодотворению яйцеклетки. Это продолжительный, упорядоченный процесс, в ходе которого стволовые клетки сперматогонии делятся путем митоза, чтобы поддержать пул стволовых клеток или дают начало дифференцирующимся клеткам, из которых в результате сложных преобразований образуются зрелые сперматозоиды. По точности во времени, с которой совершаются сложные процессы дифференцировки в развивающихся половых клетках, сперматогенез сходен с эмбриональным развитием. Продолжительность сперматогенеза, как и продолжительность эмбрионального развития организма, является величиной, постоянной для данного вида животных, и не зависит от действия экзогенных и эндогенных факторов [61,55].
На эффективность сперматогенеза влияет число клеток Сертоли, количество клеток Лейдига, а также число погибших на разных стадиях генераций зародышевых клеток. Эффективность сперматогенеза зависит от начального количества зародышевых клеток, от половой зрелости, от времени года, процесса развития (старения) организма и др. За эффективность сперматогенеза принимается число сперматозоидов, которое образуется за 1 сут. в 1 г тестикулярной ткани (т. е. не зависит от размера тестикул у различных видов животных).
В процессе сперматоцитогенеза, мейоза и спермиогенеза при делении и/или дифференцировке сперматогоний, сперматоцитов и сперматид соответственно образуются три основных дивизиона сперматогенеза, т.е. условно сперматогенез можно разделить на три этапа, каждый из которых у разных видов животных длится определенное количество времени.
Один дивизион сменяет последующий с определенной частотой, которую называют циклом сперматогенного эпителия. За цикл сперматогенного эпителия принимают серию изменений в данном участке эпителия между двумя одинаковыми стадиями развития клеток [105]. Продолжительность цикла сперматогенного эпителия видоспецифична: у крыс она составляет 10,7 сут., у хомяков - 8,7 сут., у мышей - 8,9 сут., у обезьян - 9,5 сут., у быка 13,5 сут., у собак - 13,6 сут., у человека - 16,0 сут. [56,149,34,35]. Если спермиацию (высвобождение сперматозоидов из сперматогенного эпителия) использовать как точку отсчета, то сперматогенный цикл будет включать все процессы, происходящие между двумя последовательными спермиациями в данном участке канальца.
Продолжительность цикла и частота, с которой продуцируются сперматозоиды, определяются скоростью, с которой сперматогонии включаются в процесс сперматогенеза.
Цикл, в свою очередь, делится на стадии. Стадия представлена группой из 4-5 зародышевых клеток, каждая из которых находится на специфичной, упорядоченной ступени развития в процессе сперматогенеза. У быков цикл разделен на 8 стадий [36] или, по данным других исследователей, на 12 стадий [40], 14 стадий были описаны у крыс [55], 8 у лошадей [149] и только 6 стадий у человека [56]. На поперечных срезах семенных канальцев у большинства видов животных, в том числе у быка [36] и у лошади [149], можно увидеть клетки только одной стадии развития, тогда как у людей можно наблюдать клетки, находящиеся более чем на 2-х стадиях развития [56]. Следует отметить, что деление на стадии условно, в природе этот процесс происходит плавно.
61 DAYS ІЛ ш z
17 DAYS SM 49.5 Sb2 52.3 Sc 54,9 Sc 56.3 Sd1 57.5 Sd1 53 1 Sd2 59.0 Sa 45.5 Sd2 50.3 Sa 44 5
23 DAYS Sa 44.1 Sa 46,3 P 36.0 P 39.3 P 41.4 D.'SS 43,3 P 30.6 P 33.3 сл О ш 2 Z 25.8 Z 27.9 Z 29.i у) ш Z ш LU О. СЛ
21 DAYS A 9.0 A 12.3 A 14,4
In 16.3
In 17.1
In 17.6
В 18.5
8 19.i A 3.6 A 0.9 A 2.8 A 4.1 A S.O A 6.3
13.5 DAYS
Рис. 1. Схема сперматогенеза быка. [Johnson L., 2000].
На рис 1 схематично изображен процесс сперматогенеза, протекающий в семенных канальцах быка [99]. Считается, что по такой же схеме протекает сперматогенез у всех видов млекопитающих.
Общая продолжительность сперматогенеза быка составляет 61 день. Три основных этапа (дивизиона) - сперматоцитогенез, мейоз и спермиогенез длятся соответстветственно 21, 23 и 17 дней. Цикл сперматогенного эпителия составляет 13,5 дней, который подразделяется на 8 стадий.
Длительность сперматогенеза у разных видов млекопитающих различна. Так, у мышей и свиней она составляет 35 сут., у человека - 74 сут., у крысы - 48 сут., у обезьяны - 44 сут.
Используя количественные подходы для выявления ежедневной продукции спермы, подсчитывают количество сперматозоидов, вырабатываемых в день одной тестикулой [101,94,36]. Учитывая протяженность жизни и теоретический выход специфических зародышевых клеток, ежедневная продукция сперматозоидов может быть получена из числа зародышевых клеток этого вида в тестикулах на определенных этапах сперматогенеза [101,36]. За протяженность жизни зародышевой клетки принимают продолжительность всех стадий цикла, на которых этот тип клеток существует. Теоретический выход рассчитывается по формуле 2П, где п - число клеточных поколений между этим клеточным типом и сперматидой.
Путем подсчетов было обнаружено, что количество образующихся сперматоцитов на стадии прелептотены значительно меньше того числа, которое следовало бы ожидать на основании теоретического расчета. Это связано с тем, что многие сперматогенные клетки дегенерируют в процессе сперматогенеза.
Ежедневная спермиация в расчете на 1г тестикулярной ткани является мерой эффективности сперматогенеза [35,94]. На рис 2 схематично показана эффективность сперматогенеза у крыс, лошадей, свиней, быков и человека, основанная на потенциальной ежедневной спермопродукции (на грамм паренхимы) на разных этапах сперматогенеза. Ожидаемая спермопродукция рассчитывалась по количеству в семенных канальцах сперматогоний типа В, сперматоцитов на стадии пахитены, круглых сперматид и зрелых форм сперматид (удлиненных).
В SPERMATOGONIA ROUND SPERMATIDS HORSE HUMAN г— О Z> а О а: о_ сс ш 0_ BOAR SPECIES PACHYTENE PRIMARY SPERMATOCYTES
Рис. 2. Эффективность сперматогенеза у различных видов млекопитающих, основанная на потенциальной ежедневной спермопродукции (Johnson L., 1994).
Как видно из схемы у крыс не было замечено значительных потерь на различных стадиях сперматогенеза. У лошадей наблюдалась значительная потеря ранних зародышевых клеток, без существенных потерь в последующих генерациях. У мужчин и быков была выявлена наименьшая эффективность сперматогенеза по сравнению с другими видами. При этом у человека наибольшие потери клеток наблюдались во время второго деления созревания. У хряков и мужчин имелись значительные потери в конце мейоза, а быки и лошади на этом этапе сохраняли свой потенциал [96,98,97,100,94,121]. Сравнение потенциального ожидаемого выхода сперматозоидов с реальным количеством сперматозоидов, продуцируемых 1г ткани, помогло определить стадии гибели клеток у разных животных.
Считается, что дегенерация клеток в процессе сперматогенеза является одним из механизмов его регуляции. Равномерное распределение сперматогенных стволовых клеток в разных областях семенника достигается удалением избыточных клеток путем апоптоза (генетически запрограмированной гибелью клеток). Установлено, что дегенерация зародышевых клеток происходит, главным образом, в процессе сперматоцитогенеза и мейоза [94].
1.5. Выделение стволовых клеток сперматогоний млекопитающих и культивирование in vitro.
Выделение и культивирование in vitro стволовых клеток сперматогоний является важным моментом при получении культур СКС и дальнейших манипуляций с ними.
Анализ литературных данных выявил ряд проблем, связанных с выделением и культивированием СКС in vitro [139,90,85,32,38]. Изучение репродуктивной системы самца ведется с начала 20 столетия [129,44,81,122,13,31], но, начиная с 60-х годов, с развитием клеточной и молекулярной биологии, началось фундаментальное изучение сперматогенеза и основ его регуляции. Ранние работы проводились в основном в образцах фиксированных тканей.
Исследования по изучению СКС в культуре ведутся уже на протяжении ряда лет, однако до сих пор существует необходимость в разработке оптимальных культуральных систем для СКС. Подбор условий культивирования, тождественный условиям in vivo, является трудной задачей для исследователей. Следует отметить, что в экспериментах по выделению и культивированию СКС использовались в основном лабораторные животные. Однако в последнее время появились работы, в которых объектами исследований становятся сельскохозяйственные животные: бык [90,32], хряк [85,63].
Впервые наиболее удачную схему выделения культур клеток из тестикул мыши разработал в 1977 г. Ве11уе с колл [38]. Он предложил использование ферментов (коллагеназа, трипсин) для дезагрегации ткани семенника и высокоскоростное центрифугирование в градиенте плотности БСА для получения фракций, содержащих различные типы клеток. В дальнейшем эта схема использовалась исследователями в качестве основы с добавлением собственных модификаций.
Так, при дезагрегации ткани семенника используют ферменты гиалуронидазу, ДНК-азу [63]; при разделении различных клеточных типов семенника используются такие приемы, как фильтрация суспензии клеток через фильтры [90,123], центрифугирование в градиентах плотности хлористого цезия [131], перкола [90], а также разделение различных клеточных типов семенника на основе различных адгезивных способностей клеток [90,63]. Экспериментальным путем установлено, что СКС обладают наименьшей адгезивной способностью по сравнению с другими клеточными типами семенника. Основываясь на этом свойстве СКС, высев клеток, выделенных из ткани семенника и их дальнейшее краткосрочное культивирование, позволяет получать популяцию клеток на 70-85% представленную СКС. Для этого суспензию клеток культивируют в течение 2-4 часов при 37С в С02-икубаторе. За это время соматические клетки прикрепляются к субстрату, а СКС остаются в суспензии [123,32,141]. Иногда для получения чистых популяций СКС используются комбинации приемов, например: разделение на основе различных адгезивных способностей клеток с последующим центрифугированием в градиенте плотности перкола [38], фильтрация через нейлоновые фильтры с различным диаметром пор с последующим высевом и центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия [32].
Получение культур стволовых клеток сперматогоний является важной задачей клеточной биологии. Возможность проведения различных манипуляций с этими клетками открывает для исследователей широкие перспективы для решения ряда практических задач.
Несмотря на то, что попытки культивирования СКС предпринимаются уже на протяжении нескольких лет, в литературных источниках нет сообщений об их длительном культивировании.
Проведенной серией экспериментов было установлено, что СКС, культивируемые без фидерных слоев, быстро погибают (24-48 час.), тогда как продолжительность жизни клеток, культивируемых на питательных слоях, увеличивается [90,63]. Учитывая, что в условиях in vivo половые клетки находятся в тесной взаимосвязи с соматическими клетками и ВМ, которые участвуют в сложных процессах пролиферации и дифференцировки сперматогоний, можно предположить, что монослой питающих клеток на некоторое время обеспечивает СКС необходимыми метаболитами. При культивировании СКС в качестве фидерных слоев исследователями обычно используются клетки Сертоли и клетки STO. Известно, что именно клетки Сертоли являются питающими и поддерживающими для СКС в семеннике и продуцируют наибольшее количество ростовых факторов [113,32,19]. Считается, что перевиваемые эмбриональные фибробласты мыши линии STO синтезируют фибронектин и некоторые ростовые факторы (LIF), способствующие более длительному поддержанию клеток в условиях in vitro [18].
Изолированные от внутренней среды клетки сохраняют основные требования к создаваемой искусственной среде, поэтому разработка питательных сред, используемых для культивирования СКС, является одним из ключевых моментов.
Фундаментальными исследованиями по определению метаболических потребностей клеток в культуре было установлено, что для роста и развития клеток позвоночных вне организма необходим ряд веществ: неорганические соли, глюкоза, аминокислоты, гормоны, витамины, сывороточные и серозные компоненты [109,73].
Основываясь на этих данных экспериментально были подобраны основные ингредиенты среды для культивирования СКС. Как правило, исследователями используются среды Игла в модификациях с высоким содержанием глюкозы (до 4,5 г/л), дополненные сывороткой (от 4 до 15%), альфа-глутамином и антибиотиками. Добавление сыворотки в культуральную среду изменяет метаболизм клеток и функции клеточных культур. Сыворотка крови является источником белков, ростовых и адгезивных факторов. В качестве источника энергии чаще всего используют Д-глюкозу.
Ряд экспериментальных работ показал, что использование фидерных слоев и добавление к основным компонентам среды некоторых ростовых факторов увеличивает продолжительность культивирования СКС. Так, добавление в культуральную среду 8СБ и ОМ-С8Р увеличивает сроки культивирования СКС до 5-7 сут [63,32].
Было установлено, что добавление к основной среде фолликулярной жидкости, полученной из плодов свиньи (до 25%), содержащей, как считается, растворимый фактор роста с-к'и, и культивирование СКС в среде К80М (ростовая среда для культивирования предымплантационных эмбрионов) также приводит к увеличению срока жизни СКС в культуре [107,63].
Обобщая литературные данные следует отметить, что, несмотря на большое количество изученных факторов, способных влиять на поведение СКС в культуре, до сих пор нет сообщений об их длительном культивировании и получении колоний мужских стволовых клеток. Как правило, эти сроки ограничены 7-10 сут. Недавно появилось сообщение о поддержании в культуре в недифференцированном виде СКС быков в течение 14 суток [90]. Этого удалось достичь путем культивирования очищенной популяции СКС быка в среде MEM с добавлением 10% FCS, 4 тМ глутамина, заменимых аминокислот, 15 mM HEPES и антибиотиков.
Таким образом, можно констатировать, что на сегодняшний день еще существует ряд проблем при культивировании и получении колоний СКС. Поэтому исследования по дальнейшей разработке культуральных систем для СКС, максимально приближенных к условиям in vivo, по- прежнему остаются актуальными.
1.6. Трансплантация СКС.
К настоящему времени разработано большое количество методов введения рекомбинантной ДНК в геном животных. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки.
В 1994 году группой ученых был предложен принципиально новый, перспективный подход для получения трансгенных животных [47], который предполагает использование мужских стволовых клеток сперматогоний в качестве вектора для переноса рекомбинантных ДНК.
Схематично этот метод можно представить так: извлечение стволовых клеток из семенников донора - манипуляции с ними in vitro (культивирование, трансфекция) - пересадка в семенники стерильных реципиентов - получение трансгенной спермы - оплодотворение яиц сперматозоидами, полученными из трансформированных стволовых клеток - создание трансгенного потомства.
Бринстер с колл. [47] разработали на мышах обязательную первую ступень - пересадку клеток семенника от одного самца к другому. Они продемонстрировали, что свежевыделенные клетки донора способны колонизировать семенники стерильных реципиентов и возобновлять в них сперматогенез с нормальными морфофизиологическими характеристиками. Дальнейшие работы исследователей были направлены на совершенствование техники трансплантации.
На начальных этапах объектами исследований были лабораторные животные. Группа ученых [139] в своей работе показали, что донорские мышиные СКС, пересаженные в семенники стерильных по мутации мышей сохранялись там в течение года, при этом некоторые канальцы выглядели нормально как в количественном так и в качественном отношении, в других наблюдались нарушения. 0а\а с колл. установили, что донорские СКС крысы, пересаженные в семенники стерильного реципиента, возобновляют сперматогенез [120]. Сперматозоиды, продуцируемые в семенниках реципиента из донорских СКС, способны оплодотворять яйца и производить потомство, несущее генотип самца- донора. Более того, СКС крыс, приматов, кроликов, собак, хомяков могут возобновлять нормальный сперматогенез, будучи пересаженными в тестикулы мыши [117,60,111,66,119].
В последнее время появляются сообщения о выделении и трансплантации СКС сельскохозяйственных животных.[65,32,90]. Однако перенос СКС сельскохозяйственных животных (быков, жеребцов, хряков) производился в семенники лабораторных животных (мышей и крыс). Несмотря на филогенетическую дистанцию было показано, что свиные СКС формировали цепочки круглых клеток, соединенных цитоплазматическими мостиками, однако дальнейшей дифференцировки не наблюдалось. Пересаженные бычьи СКС первоначально вели себя аналогично свиным, но затем, как предполагают авторы, перерождались в соединительную ткань. Небольшое количество СКС жеребцов пролиферировали в тестикулах мыши без дальнейшей дифференцировки. Сравнительный анализ эффективности трансплантации при использовании свежевыделенных, замороженных или культивируемых в течение мес. СКС показал, что эффект имели только пересадки свежевыделенных и замороженных клеток [65]. Это объясняется, видимо, тем, что СКС не удается культивировать в течение длительного периода, и в результате выживают только соматические клетки.
Анализ литературных данных показал, что существует ряд проблем при использовании в качестве и доноров и реципиентов крупных сельскохозяйственных животных и, в частности, свиньи. Обусловлено это тем, что ценных в разведении животных необходимо подвергать вредным предварительным обработкам (стерилизации), а также сложностью проведения манипуляций с крупными животными. Только одно сообщение об использовании свиней в качестве реципиентов при пересадке свиных СКС появилось в конце 2001 г. [85].
1.7. Заключение.
Интерес исследователей к изучению сперматогенеза и половым клеткам, которые являются носителями наследственности, известен давно. Значительное количество зарубежных и отечественных работ посвящено изучению сперматогенеза и процессов пролиферации и дифференцировки сперматогоний [32,99,7,8].
Использование стволовых клеток сперматогоний в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК в геном реципиентов является принципиально новым подходом при получении трансгенных животных.
В связи с уникальными характеристиками этих клеток - способностью самообновляться и потенциальной тотипотентностью - они представляют большой интерес в прикладном аспекте при решении не только проблем сельскохозяйственной биологии, но и в других областях, например, медицине.
В связи с этим в последние годы ведутся активные разработки в данном направлении. Использование ядер мужских стволовых клеток для переноса в энуклеированные яйцеклетки возможно найдет применение при клонировании самцов. Очень перспективны работы по трансплантации СКС в семенники реципиентов. Генетические модификации этих клеток до пересадок открывают новый путь для получения трансгенных животных.
Однако следует отметить, что наряду с положительными моментами, имеется ряд трудностей при использовании этих клеток в биотехнологии сельскохозяйственных животных.
Так, на сегодняшний день все еще существует проблема выделения СКС из семенников и их очистка. Не получены стабильные линии СКС и до сих пор не подобраны оптимальные условия для поддержания СКС в культуре в недифференцированной форме. Поэтому разработка культуральных систем для СКС, максимально приближенная к условиям in vivo, по-прежнему является актуальной. Метод трансплантации СКС, хотя и является более экономным по сравнению с другими методами, также требует значительных модификаций и поиска наиболее эффективных способов стерилизации реципиентов. Необходим анализ компетентности СКС к поглощению экзогенной ДНК и совершенствование способов генетической трансформации этих клеток.
Также имеет место проблема адаптации разработанных методов к сельскохозяйственным животным и, в частности, свинье. Поэтому выбор свиных СКС в качестве объекта наших исследований не является случайным и возможно данная работа поможет в решении некоторых существующих проблем.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ (2.02.06. Исследование свойств СКС типа А свиней как вектора для переноса чужеродной информации) в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВНИИ животноводства На рисунке 3 представлена общая схема эксперимента.
2.1. Подготовка животных.
В экспериментах были использованы самцы местных помесных свиней, выращенные в ОПХ Кленово-Чегодаево.
Для изучения сперматогенеза и получения культур сперматогенных клеток использовали тестикулы от 51 хрячка, кастрированных с интервалом в одну неделю, начиная с 7 суток после рождения и до 119 суток включительно.
В эксперименте по трансплантации сперматогенных клеток использовали 80-суточных хрячков (22 животных).
При кастрации животных использовали местную анестезию путем введения 0,5% раствора новокаина в область мошонки и 2% раствора новокаина в каждый семенной канатик [15].
2.2. Приборы и оборудование.
Выделение культур клеток из семенников и манипуляции с клетками производили в ламинарном шкафу, обеспечивающем циркуляцию стерильного воздуха, производства фирмы «Flow Laboratories» (Великобритания).
Среды и растворы подогревали в термостате ТС-80М-2 (Россия).
Для центрифугирования клеточных суспензий использовали центрифугу «Janetzki» (ГДР).
Культивирование клеток проводили в инкубаторе, позволяющем обеспечивать необходимую температуру (37С), влажность воздуха и содержание С02 (5%) (Sanyo, Япония).
Рис. 3. Общая схема эксперимента.
В рефрижераторе «Ultra low» (Sanyo, Япония) и сосудах Дьюара с жидким азотом (Франция) осуществляли длительное хранение клеток. Для размораживания клеток использовали водяную баню производства Венгрии.
В автоклаве «Harvard/LTE» (Великобритания) стерилизовали пластиковые и резиновые крышки, наконечники, шприцы и некоторые растворы.
Высушивание и обеззараживание культуральной посуды проводили в сухожаровом шкафу КВС G-65/250 (Польша).
Микроскопическое исследование культур клеток осуществляли с помощью инвертированного микроскопа (Diaphot, Nikon, Япония и ICM, Opton, Германия). На инвертированном микроскопе фирмы «Nikon», оборудованном встроенной фотонасадкой с объективами 20х и 40х производили просмотр и микрофотографирование нативных и окрашенных препаратов. Для фотографирования использовали негативные пленки «Kodak Gold-200» (Великобритания), фотографии печатали на фотобумаге «Kodak».
Для получения дистиллированной воды использовали дистиллятор АСД-4. Для приготовления деионизированной воды применяли деионизатор воды Elgastat UHQ (Elga, Англия).
Растворы готовили с помощью магнитной мешалки Magnetik stirrer (Польша).
Взвешивание реактивов производили на электронных весах R 200D фирмы «Sartorius» (Германия).
Растворы стерилизовали, пропуская их с помощью перистальтического насоса Walson-Marlow (США) через фильтры GS Millipore (Sigma) с диаметром пор 0,22 мкм.
Электропорацию мужских половых клеток осуществляли с помощью прибора для электрослияния ЕС 100 (США).
2.3. Культуральные среды, растворы и реактивы.
2.3.1. Ростовые среды. STO клетки, перевиваемые клетки Сертоли свиней и первичные клетки Сертоли свиней выращивали в среде ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) (ПанЭко, Россия), дополненной 10% сыворотки плода крупного рогатого скота (FCS), 2тМ альфа-глутамином (Sigma, США) и гентамицином (конечная концентрация 50 мкг/мл) (ПанЭко).
Ростовой средой для культивирования СКС также служила среда DMEM с указанными выше добавками и содержанием 15% FCS, 0,1 тМ 2- меркаптоэтанола, ОДтМ заменимых аминокислот
В экспериментах использовали сыворотку плода крупного рогатого скота производства фирмы «Serva», протестированную на присутствие микоплазм и вирусов.
Фолликулярную жидкость получали из плодов свиньи на 28-30 сутки супоросности, фильтровали, аликвотили, хранили при - 20С. Перед культивированием размораживали и добавляли к ростовой среде (до 25%).
2.3.2. Специальные среды и растворы.
После кастрации животных тестикулы помещали в физиологический раствор, дополненный гентамицином (конечная концентрация 100 мкг/мл). Физиологический раствор готовили, растворяя 9г NaCl в 1 л деионизированной воды, стерилизовали автоклавированием.
Для нарушения межклеточных взаимодействий при получении культур клеток из семенника, а также при снятии клеток с субстрата использовали неполный фосфатно-солевой буфер Дюльбекко без ионов 2+
Са и Mg (ФСБ-2). Для этого последовательно растворяли в деионизированной воде Юг NaCl, 0,37 г КС1, 0,15 г Na2HP04, 0,24 г КН2РО4, доводили объем до 1 л (рН 7,2) и стерилизовали автоклавированием.
При дезагрегации ткани семенника с целью получения СКС использовали растворы коллагеназы и 0,25% трипсина. Коллагеназу (ПанЭко) растворяли в среде ДМЕМ (конечная концентрация 1 мг/мл). Готовили в 10-ти кратном разведении, аликвотили и замораживали при - 20С. Размораживали непосредственно перед применением. Для приготовления 0,25% трипсина последовательно растворяли в деионизированной воде 2,5 г трипсина, 0.4 г ЭДТА, 7,0 г NaCl, 0,3 г Na2HP04 12Н20, 0,24 г КН2Р04, 0,37 г КС1, 1,0 г Д-глюкозы, 3,0 г Tris, 1,0 мл фенолового красного, доводили объем до 1 л (рН 7,6), стерилизовали фильтрованием, аликвотили и замораживали при - 20С. Перед использованием подогревали до +37С. [2].
Снятие клеток с субстрата проводили с помощью 0,25% раствора трипсина.
Чашки Петри, которые использовали для культивирования STO- клеток, предварительно желатинизировали 0,1 % раствором желатина (свиная кожа, тип I, Sigma). Для этого на магнитной мешалке с подогревом растворяли 100 мг желатина в 100 мл деионизированной воды, после чего раствор стерилизовали автоклавированием.
Для приготовления фидерных слоев клетки обрабатывали ростовой средой, содержащей митомицин С (Sigma), с целью подавления митоза. Предварительно готовили матричный (100-кратный) раствор митомицина С. Для этого растворяли 2мг митомицина С в 1,9 мл ДМЕМ, добавляли 100 мкл DMSO, фильтровали, готовили аликвоты по 100 мкл и хранили при - 20С. После блокирования клетки отмывали фосфатно-солевым буфером с ионами Са2+ и Mg2+ (ФСБ-1).
Фосфатно-солевой буфер (ФСБ-1) готовили, последовательно растворяя в деионизированной воде 8,0 г NaCl, 0,20 г КС1, 1,15 г Na2HPOzb 0,20 г КН2Р04, 0,1 г СаС12, 0,1 г MgCl2 6Н20, доводили объем до 1 л (рН 7,2) и стерилизовали автоклавированием.
В качестве криопротектора при криоконсервировании клеток использовали диметилсульфоксид (ДМСО) (Serva). Криозащитная среда состояла из 10% криопротектора, 40% FCS и 50% среды ДМЕМ.
При получении гистологических препаратов из ткани семенников растворы Буэна для фиксации ткани [24] и галлоцианина для окрашивания срезов [23] готовили по стандартным методикам.
При окраске культур клеток из тканей семенника на щелочную фосфатазу предметные стекла предварительно покрывали поли-Д-лизином фирмы «Serva» (0,1%-ный раствор).
Для осуществления трансфекции ранних мужских половых клеток электропорацией готовили раствор рекомбинантной ДНК. Для этого ДНК рекомбинантной плазмиды, содержащей репортерный ген lacZ E.coli дважды переосаждали в 70% спирте и растворяли в ДНК-буфере. Буфер готовили, растворяя 0,1 шМ ЭДТА и ImM трис-HCl в деионизированной воде (pH 8,0)
Фисацию клеток проводили с помощью 0,5 % глутаральдегида в
Наличие в трансфецированных клетках бета-галактозидазы, продукта экспрессии гена lacZ E.coli, определяли путем окрашивания в специальном буфере. Буфер готовили, растворяя 5 mM K3[Fe(CN)6], 5тМ K4[Fe(CN)6]3H20, 2 mM MgCl2 в ФСБ. В качестве субстрата в буфер добавляли X-gal (Sigma, США) в концентрации 400 мкг/мл.
Для стерилизации животных использовали раствор бусульфана (Sigma, США) в ДМСО.
2.4. Культу рал ьная посуда.
Для выделения, очистки и культивирования СКС типа А свиней использовали одноразовые пластиковые чашки Петри диаметром 60 и 100 мм, изготовленные фирмой «Corning» (США).
Перевиваемую линию клеток эмбриональных мышиных фибробластов (STO), перевиваемые клетки Сертоли и первичные клетки
Сертоли свиней культивировали в пластиковых флаконах площадью 25 см" (Corning).
Криоконсервирование СКС свиньи, клеток STO, перевиваемых клеток Сертоли и первичных клеток Сертоли производили в пластиковых криопробирках фирмы «Nunk» (Дания).
Для приготовления аликвот митомицина С использовали пластиковые эппиндорфы фирмы «Corning».
Центрифугирование клеточных суспензий производили в стерильных центрифужных пробирках объемом 15 и 50 мл, изготовленных фирмой «Corning».
2.5. Приготовление фидерных слоев для культивирования
Стволовые клетки сперматогонии у млекопитающих
Как всякая самообновляющаяся популяция, сперматогониальная популяция содержит стволовые клетки. Серией экспериментальных данных было достоверно установлено что стволовыми клетками сперматогенеза у непримитивных млекопитающих являются сперматогонии типа А [62,19,47,20,32,7]. В течение жизни организма эти клетки могут либо поддерживаться без дальнейшей дифференцировки, формируя новые дочерние клетки, либо пролифелировать с образованием ряда генераций. При этом каждая последующая генерация оказывается более дифференцированной, чем предыдущая.
Сперматогонии являются самыми молодыми мужскими половыми клетками. Известно, что в эмбрионах млекопитающих линия зародышевых клеток начинается с примордиальных половых клеток (гоноцитов). Считается, что развитие нормальных тестикул зависит от пролиферации примордиальных зародышевых клеток и их взаимосвязи с предшественниками клеток Сертоли [103]. Сперматогонии возникают у зародыша после соматической дифференцировки ткани семенника из недифференцированных половых клеток гоноцитов (протогоний).
Тщательный анализ гистологических препаратов, приготовленных из ткани тестикул, позволил исследователям заключить, что стволовые клетки сперматогонии (СКС) располагаются в пристеночном слое семенных канальцев и лежат изолированно [19,20,7]. Было обнаружено, что первые деления сперматогоний идут независимо от цикла сперматогенного эпителия, и лишь впоследствии деления становятся регулярными, строго упорядоченными в пространстве и времени [82]. Благодаря этой особенности протекания сперматогенеза стало возможным установить время и местонахождение СКС на разных стадиях сперматогенеза и идентифицировать их морфологически [58,87,84].
Анализ литературных данных показал, что у мышей, крыс, оленей такой клеткой является сперматогония типа А0 или некоторые авторы называют ее тип А-изолированная, у обезьян - сперматогония типа А-темная, у человека - сперматогония типа А-удлиненная [58,86,84].
СКС имеет круглое ядро с диффузным хроматином, равномерно распределенным по ядру, содержащему одно или два четко очерченных ядрышка. В цитоплазме СКС содержится небольшое количество органел и митохондрий с трубчатыми или поперечными кристами и много свободных рибосом и полисом. Комплекс Гольджи и эндоплазматический ретикулум развиты слабо [19]. Эта клетка характеризуется высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением - имеет крупное ядро и узкий ободок цитоплазмы.
Ряд исследователей считают, что стволовые клетки сперматогонии можно подразделить на две субпопуляции: долгоживущие стволовые сперматогонии типа А и быстрообновляющиеся стволовые сперматогонии типа А [69,70].
Долгоживущие стволовые сперматогонии типа А спорадически делятся, чтобы поддерживать пул стволовых клеток на постоянном уровне. Так, при сокращении числа стволовых клеток сперматогоний типа А (например после облучения) митотическая активность этих клеток резко возрастает. Однако механизм регуляции численности популяции стволовых клеток остается невыясненным. На срезах семенных канальцев число СКС типа А постоянно и не зависит от цикла сперматогенного эпителия. Строение и функции покоящихся клеток млекопитающих были подробно описаны О.И.Епифановой с соавт. [12].
Быстрообновляющиеся стволовые сперматогонии типа А в течение цикла сперматогенного эпителия делятся только один раз. Деление этих клеток приводит к появлению клеток, которые не могут завершить цитокинез и остаются соединенными цитоплазматическими мостиками. Эти, так называемые сперматогонии типа А-спаренные, являются первой ступенью на пути к дифференцировке стволовых сперматогоний в высоко дифференцированные сперматозоиды. [87,115,102,88].
Подготовка животных
В экспериментах были использованы самцы местных помесных свиней, выращенные в ОПХ Кленово-Чегодаево.
Для изучения сперматогенеза и получения культур сперматогенных клеток использовали тестикулы от 51 хрячка, кастрированных с интервалом в одну неделю, начиная с 7 суток после рождения и до 119 суток включительно.
В эксперименте по трансплантации сперматогенных клеток использовали 80-суточных хрячков (22 животных).
При кастрации животных использовали местную анестезию путем введения 0,5% раствора новокаина в область мошонки и 2% раствора новокаина в каждый семенной канатик [15].
. Приборы и оборудование.
Выделение культур клеток из семенников и манипуляции с клетками производили в ламинарном шкафу, обеспечивающем циркуляцию стерильного воздуха, производства фирмы «Flow Laboratories» (Великобритания).
Среды и растворы подогревали в термостате ТС-80М-2 (Россия).
Для центрифугирования клеточных суспензий использовали центрифугу «Janetzki» (ГДР).
В рефрижераторе «Ultra low» (Sanyo, Япония) и сосудах Дьюара с жидким азотом (Франция) осуществляли длительное хранение клеток. Для размораживания клеток использовали водяную баню производства Венгрии.
В автоклаве «Harvard/LTE» (Великобритания) стерилизовали пластиковые и резиновые крышки, наконечники, шприцы и некоторые растворы.
Высушивание и обеззараживание культуральной посуды проводили в сухожаровом шкафу КВС G-65/250 (Польша).
Микроскопическое исследование культур клеток осуществляли с помощью инвертированного микроскопа (Diaphot, Nikon, Япония и ICM, Opton, Германия). На инвертированном микроскопе фирмы «Nikon», оборудованном встроенной фотонасадкой с объективами 20х и 40х производили просмотр и микрофотографирование нативных и окрашенных препаратов. Для фотографирования использовали негативные пленки «Kodak Gold-200» (Великобритания), фотографии печатали на фотобумаге «Kodak».
Для получения дистиллированной воды использовали дистиллятор АСД-4. Для приготовления деионизированной воды применяли деионизатор воды Elgastat UHQ (Elga, Англия).
Растворы готовили с помощью магнитной мешалки Magnetik stirrer (Польша).
Взвешивание реактивов производили на электронных весах R 200D фирмы «Sartorius» (Германия).
Растворы стерилизовали, пропуская их с помощью перистальтического насоса Walson-Marlow (США) через фильтры GS Millipore (Sigma) с диаметром пор 0,22 мкм.
Электропорацию мужских половых клеток осуществляли с помощью прибора для электрослияния ЕС 100 (США).
STO клетки, перевиваемые клетки Сертоли свиней и первичные клетки Сертоли свиней выращивали в среде ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) (ПанЭко, Россия), дополненной 10% сыворотки плода крупного рогатого скота (FCS), 2тМ альфа-глутамином (Sigma, США) и гентамицином (конечная концентрация 50 мкг/мл) (ПанЭко).
Ростовой средой для культивирования СКС также служила среда DMEM с указанными выше добавками и содержанием 15% FCS, 0,1 тМ 2- меркаптоэтанола, ОДтМ заменимых аминокислот
В экспериментах использовали сыворотку плода крупного рогатого скота производства фирмы «Serva», протестированную на присутствие микоплазм и вирусов.
Фолликулярную жидкость получали из плодов свиньи на 28-30 сутки супоросности, фильтровали, аликвотили, хранили при - 20С. Перед культивированием размораживали и добавляли к ростовой среде (до 25%).
Специальные среды и растворы.
После кастрации животных тестикулы помещали в физиологический раствор, дополненный гентамицином (конечная концентрация 100 мкг/мл). Физиологический раствор готовили, растворяя 9г NaCl в 1 л деионизированной воды, стерилизовали автоклавированием.
Для нарушения межклеточных взаимодействий при получении
культур клеток из семенника, а также при снятии клеток с субстрата
использовали неполный фосфатно-солевой буфер Дюльбекко без ионов 2+
Са и Mg (ФСБ-2). Для этого последовательно растворяли в деионизированной воде Юг NaCl, 0,37 г КС1, 0,15 г Na2HP04, 0,24 г КН2РО4, доводили объем до 1 л (рН 7,2) и стерилизовали автоклавированием.
При дезагрегации ткани семенника с целью получения СКС использовали растворы коллагеназы и 0,25% трипсина. Коллагеназу (ПанЭко) растворяли в среде ДМЕМ (конечная концентрация 1 мг/мл). Готовили в 10-ти кратном разведении, аликвотили и замораживали при - 20С. Размораживали непосредственно перед применением. Для приготовления 0,25% трипсина последовательно растворяли в деионизированной воде 2,5 г трипсина, 0.4 г ЭДТА, 7,0 г NaCl, 0,3 г Na2HP04 12Н20, 0,24 г КН2Р04, 0,37 г КС1, 1,0 г Д-глюкозы, 3,0 г Tris, 1,0 мл фенолового красного, доводили объем до 1 л (рН 7,6), стерилизовали фильтрованием, аликвотили и замораживали при - 20С. Перед использованием подогревали до +37С. [2].
Снятие клеток с субстрата проводили с помощью 0,25% раствора трипсина.
Чашки Петри, которые использовали для культивирования STO- клеток, предварительно желатинизировали 0,1 % раствором желатина (свиная кожа, тип I, Sigma). Для этого на магнитной мешалке с подогревом растворяли 100 мг желатина в 100 мл деионизированной воды, после чего раствор стерилизовали автоклавированием.
Для приготовления фидерных слоев клетки обрабатывали ростовой средой, содержащей митомицин С (Sigma), с целью подавления митоза. Предварительно готовили матричный (100-кратный) раствор митомицина С. Для этого растворяли 2мг митомицина С в 1,9 мл ДМЕМ, добавляли 100 мкл DMSO, фильтровали, готовили аликвоты по 100 мкл и хранили при - 20С. После блокирования клетки отмывали фосфатно-солевым буфером с ионами Са2+ и Mg2+ (ФСБ-1).
Фосфатно-солевой буфер (ФСБ-1) готовили, последовательно растворяя в деионизированной воде 8,0 г NaCl, 0,20 г КС1, 1,15 г Na2HPOzb 0,20 г КН2Р04, 0,1 г СаС12, 0,1 г MgCl2 6Н20, доводили объем до 1 л (рН 7,2) и стерилизовали автоклавированием.
В качестве криопротектора при криоконсервировании клеток использовали диметилсульфоксид (ДМСО) (Serva). Криозащитная среда состояла из 10% криопротектора, 40% FCS и 50% среды ДМЕМ.
При получении гистологических препаратов из ткани семенников растворы Буэна для фиксации ткани [24] и галлоцианина для окрашивания срезов [23] готовили по стандартным методикам.
При окраске культур клеток из тканей семенника на щелочную фосфатазу предметные стекла предварительно покрывали поли-Д-лизином фирмы «Serva» (0,1%-ный раствор).
Изучение динамики сперматогенеза и характеристика клеточных типов семенника свиньи в образцах фиксированных тканей
В результате микроскопических исследований гистологических препаратов было определено, что, начиная с новорожденного возраста, в семенных канальцах хрячков обнаруживаются только клетки Сертоли и, как мы полагаем, 2 вида сперматогоний типа А (Рис. 4). Первый тип клеток характеризовался темным крупным ядром и небольшим ободком цитоплазмы. Второй тип имел светлое крупное ядро и более тонкий ободок цитоплазмы. Размер обоих типов клеток находился в пределах от 25 до 30 мкм. Сперматогонии типа А располагались либо на клетках Сертоли, либо непосредственно на базальной мембране семенного канальца.
Рис. 4. Поперечный срез семенных канальцев 7-сут. хрячка. Стрелками указаны два типа сперматогоний: с темным крупным ядром и тонким ободком цитоплазмы и светлым ядром и более узким ободком цитоплазмы. Ув. 400.
Опорные клетки Сертоли располагались плотным слоем на базальной мембране семенных канальцев и имели вытянутую форму с широким основанием и узкой апикальной частью, направленной внутрь канальца. Эти клетки имели крупное, неправильной формы ядро с одним или несколькими ядрышками и небольшим количеством нуклеолярного хроматина, окруженное ободком цитоплазмы. С увеличением возраста хрячков число и размеры этих клеток существенно не изменялись, и только к 119-сут. возрасту их количество становилось трудно определимым, так как смешивалось с общей массой сперматогенных клеток начавшегося сперматогенеза.
В срезах от 25-32 сут. хрячков (Рис. 5) отмечалось увеличение числа делящихся клеток в просвете канальцев. С увеличением возраста животных на срезах семенников состав клеток не изменялся, однако количество сперматогоний типа А постепенно увеличивалось и к 60-ти сут. возрасту достигало максимального количества, насчитываемого в препаратах разного возраста (30% от общего количества клеток, видимых на поперечных срезах семенника). Такое соотношение клеток в семенных канальцах наблюдалось до 80-сут. возраста (Рис. 6). Затем соотношение сперматогенных клеток в тестикуле менялось. Так, у 98-сут. хрячков отмечалось появление в просвете семенных канальцев промежуточных сперматогоний, сперматогоний типа В и ранних сперматоцитов. К 119 сут. возрасту (Рис. 7) в семенных канальцах появлялась люмина, в которую высвобождались единичные сформированные сперматозоиды, а к 126-ти сут. возрасту у животных наблюдался полноценный сперматогенез.
При изучении динамики развития семенников (таблица 1) было обнаружено, что размеры этих органов увеличивались за счет удлинения семенных канальцев. Это подтверждалось тем, что с возрастом размеры канальцев практически не изменялись, тогда, как к 104-х сут. возрасту их количество на поле зрения увеличивалось примерно вдвое. Однако к 119- ти сут. возрасту, когда в канальцах устанавливался полноценный сперматогенез, они за короткий промежуток времени увеличивались и в диаметре, практически полностью вытесняя интерстециальную ткань. Размеры интерстециальных клеток к 104-х сут. возрасту уменьшались, а их количество возрастало (примерно в 1,5 раза).
Похожие диссертации на Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка
