Введение к работе
Актуальность темы. Интенсивное развитие биологии и сельскохозяйственной биотехнологии за последние годы явилось результатом разработки новых подходов получения животных со стабильной интеграцией и экспрессией рскомбинантной ДНК в геноме [Brem G. ct al., 1995; Эрнст Л.К., 1998]. Перенос генов в геном животных возможен на различных стадиях эмбрионального и постнаталыюго роста организма. В связи с этим особую актуальность для создания трансгенных животных в мировой практике приобрели методы клеточной инженерии, позволяющие получать культуры стволовых клеток, которые обладают уникальной характеристикой, — тотипотеїтюстью. Такие клетки имеют неограниченные потенции к дифференцировкс и способны реализовать генетическую информацию ядер вплоть до развития целого организма. Данное свойство характерно для примордиальных или первичных половых клеток зародышей млекопитающих (ППЗК), которые являются предшественниками высоко дифференцированных половых клеток (гамет),
В настоящее время во многих ведущих научно-исследовательских институтах различных стран мира (Великобритания, Германия, Италия, Канада, США, Южная Корея, Япония) изучается множество аспектов проблемы, связанной с исследованием ППЗК млекопитающих in vitro и in vivo [De Felici M. et al., 1995; Holtz W., 1999; Kato Y., 1999 и др.]. Выделение ППЗК из зачатков гонад зародышей с целью получения из них культур стволовых зародышевых клеток представляет собой одно из перспективных направлений клеточной биологии, поскольку позволяет создать удобные экспериментальные модели для изучения механизмов гаметогенеза и цитодифференцировки в развитии млекопитающих [McLaren А., 1994; WakaharaM., 1996; Buehr М„ 1997, Савчен-кова И.П., 1999]. Достижения клеточной инженерии показали, что особую ценность приобретает использование ППЗК в качестве неиссякаемого источника тотнпотентпых ядер при создании новых клеточных типов в процессе клонирования [Shim Н. ct al., 1997; Strekhcnko N.S., 1997; Shamblott M. J. et al., 1998].
Стволовые зародышевые клетки млекопитающих также могут использоваться как вектор для переноса рекомбикантных ДНК в организм животных. Генетически трансформированные в культуре эти клетки остаются способными передавать свои изменения, будучи введенными в гонады химерных плодов, и поэтому являются удобным материалом для проведения геномных манипуляций у млекопитающих [Piedrahita J.-A. et al., 19981. Преимущество ППЗК перед клетками, выделенными из эмбриобласта зародышей (ЭСК - эмбриональные стволовые клетки), состоит в том, что они представляют собой единственные клетки, у которых стерты родительские отпечатки (геномный импринтинг) [Савченкова И.П.', 1999].
Таким образом, изучение ППЗК млекопитающих на сегодняшний день является важным и многообещающим направлением биотехнологии, так как позволяет использовать их в качестве альтернативного инструмента для решения научных и практических зааа*клетсдно.игенетаческой инженерии, на которых базируется биотехнология,^ текже: биология развития животных. f l-U./-H;-y '', ='тг- L:."v!Oi:ir"A і
Кроме того, необходимо подчеркнуть, что редкость проведения экспериментов по исследованию ПЩК млекопитающих (мышь, крыса, человек) в нашей стране (Семенова-Тянь-Шанская А.Г., 1969-1978; Дыбан АЛ., 198S; Пння-ев В.И., 1989) определяет несомненную актуальность настоящей работы.
Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в выделении ППЗК из зародышей свиньи к их характеристике. Для реализации указанной цели необходимым условием явилось решение следующих задач:
разработать на лабораторных животных (мышь) методические приемы, позволяющие изолировать ППЗК из зачатков гонад зародышей свиньи;
выделить ППЗК свиньи;
изучить факторы, влияющие на выделение ППЗК свиньи;
подобрать оптимальные условия, влияющие на получение культуры ППЗК;
охарактеризовать ППЗК свиньи в культуре.
Научная новизна. Впервые разработан простой, недорогой и эффективный метод выделения ППЗК из дорсального мезентерия и зачатков гонад плодов мыши и свиньи и их очистки от других клеточных типов, основанной на разных адгезивных способностях клеток. Обнаружено, что первичные половые клетки млекопитающих (мышь и свинья) характеризуются низкой адгезивной способ-костью.
Предпринята попытка подобрать оптимальные условия для культивирования ППЗК свиньи. Получены колонии стволовых зародышевых клеток из ППЗК. Охарактеризованы морфологические, биохимические и ростовые особенности данных клеток in vitro.
Впервые показано влияние пола и возраста плода на выделение ГГПЗК свиньи и получение из них колоний стволовых зародышевых клеток с фенотипом ЭСК.
Изучена роль и проведен сравнительный анализ использования различных монослоев соматических клеток для культивирования ППЗК свиньи и получения колоний стволовых зародышевых клеток с морфологией, подобной ЭСК.
Практическая ценность работы. Экспериментальиые данные по получению чистой популяции ППЗК свиньи могут представлять интерес для решения практических задач клеточной инженерии в современных условиях, что обусловлено низкой стоимостью разработанного методического подхода в сочетании с высокой эффективностью.
Показано, что использование, в качестве подложки, монослоев соматических клеток способствует увеличению продолжительности жизни ППЗК свиньи in vitro.
Полученные данные о влиянии таких факторов, как возраст и пол плода, на выделение ППЗК свиньи и получение колоний стволовых зародышевых клеток, позволяют более эффективно использовать данные клетки в прикладном аспекте, в качестве доноров при трансплантации ядер и получении животных с выдающимися хозяйственно-полезными признаками.
Основные положения, выносимые на защиту:
- метод выделения и очистки примордналышх половых клеток мыши и свиньи;
влияние возраста и пола плодов свиньи на выделение ППЗК н получение колоний стволовых половых клеток;
влияние монослоев фидерных клеток на поддержание ППЗК свиньи в культуре и получение колоний стволовых половых клеток;
- характеристика ППЗК свиньи и колоний стволовых зародышевых клеток.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на
научно-практической конференции по проблеме «Повышение конкурептоспо-собностн животноводства и задачи кадрового обеспечения», РАМЖ, п.Быково, июнь 2000г.; на 49-ой научно-методической конференции «Достижения молодых ученых в области животноводства», В1ШИЖ, пДубровицы, июль 2000г.; на научной конференции, посвященной 60-летию ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных, «Селекционно-генетические методы повышения продуктивкости сельскохозяйственных животных», ВНИИРГЖ, г.Санкт-Петербург, октябрь 2000г.; на П-ой Международной научной конференции «Бнотехпологая в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», ВНИ-ИСХБ, г.Москва, октябрь 2000г; на VH-ом Международном конгрессе андроло-гов «Лпдрология в ХХ1-ом веке», г.Монреаль, Канада, июнь 2001г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура н объем работы. Диссертация изложена на 110 стр., содержит 12 табл., 24 рис. (в т.ч. 14 фотографий, 3 диаграммы), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 155 библиографических источников, в т.ч. 83 на иностранном языке.
