Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Строение и функции глутаматергического синапса .12
1.2 Структурно-молекулярная организация рецепторов глутамата 14
1.2.1 АМПА/KA–ионотропные рецепторы глутамата 17
1.2.2 NMDA-чувствительные ионотропные рецепторы глутамата 20
1.2.3 Метаботропные рецепторы глутамата .25
1.3 Нейротоксическое действие глутамата 28
1.4 Глутамат-индуцированная дисрегуляция кальциевого баланса клетки 30
1.5 Рецепторы глутамата в периферической нервной системе 34
1.6 Гомоцистеин, как эндогенный агонист рецепторов глутамата 36
Глава 2. Объект и методики .39
2.1. Приготовление первичных культур нейронов 39
2.1.1. Первичная культура нейронов коры головного мозга крыс 40
2.1.2. Первичная культура нейронов тригеминального ганглия крыс 42
2.2. Идентификация нейронов и глиальных клеток в культурах 43
2.2.1. Идентификация клеток в первичной культуре коры головного мозга крыс .43
2.2.2. Идентификация клеток в первичной культуре тригеминального ганглия крыс 45
2.3. Флуориметрическая регистрация внутриклеточного Ca2+ 46
2.4. Флуориметрическое определение митохондриального мембранного потенциала .48
2.5. Регистрация токов нейронов методом локальной фиксации потенциала ...49
2.6. Определение апоптотических и некротических клеток путем последовательного окрашивания акридиновым оранжевым и бромистым этидием 50
2.7. Порядок проведения экспериментов 51
2.8. Обработка данных .53
Глава 3. Результаты 55
3.1. Исследование состава рецепторов глутамата, обеспечивающих вход Са2+ при действии агонистов рецепторов глутамата в нейронах первичной культуры коры мозга крыс 55
3.1.1 Внутриклеточные Са2+ ответы и токи в нейронах при действии
агонистов рецепторов глутамата NMDA и АМПА/KA типа 55
3.1.2. Зависимость внутриклеточных Са2+ ответов нейронов от Са2+ внеклеточного раствора 57
3.1.3. Вклад NMDA рецепторов различного субъединичного состава в генерацию внутриклеточного Са2+ сигнала 58
3.1.4. Вклад АМПА рецепторов различного субъединичного состава в генерацию внутриклеточного Са2+ сигнала и интегральных токов... 60
3.2. Исследование нейротоксического эффекта гомоцистеина на нейроны первичной культуры коры мозга крыс 63
3.2.1. Нейротоксический эффект долговременного действия гомоцистеина 63
3.2.2. Внутрикелеточные Са2+ ответы при кратковременном и долговременном действии гомоцистеина 65
3.2.3. Интегральные токи, вызванные гомоцистеином 67
3.3. Исследование нейротоксического эффекта гомоцистеина на нейроны первичной культуры тригеминального ганглия крыс 69
3.3.1. Внутриклеточные Са2+ ответы при действии гомоцистеина 69
3.3.2. Интегральные токи, вызванные гомоцистеином .72
3.3.3. Нейротоксический эффект долговременного действия гомоцистеина 73
3.4. Сравнительная характеристика ответов нейронов коры и тригеминального ганглия крыс на гомоцистеин, NMDA и глутамат 75
3.4.1. Внутриклеточные Са2+ ответы .75
3.4.2. Митохондриальный мембранный потенциал 78
Глава 4. Обсуждение 83
Выводы 93
Список литературы 95
- NMDA-чувствительные ионотропные рецепторы глутамата
- Регистрация токов нейронов методом локальной фиксации потенциала
- Исследование нейротоксического эффекта гомоцистеина на нейроны первичной культуры коры мозга крыс
- Митохондриальный мембранный потенциал
Введение к работе
Актуальность проблемы. L-глутамат (Глу) является основным
возбуждающим медиатором центральной нервной системы (ЦНС)
млекопитающих (Curtis et al., 1959), который обеспечивает проведение
возбуждения от нейрона к нейрону в глутаматергических синапсах. Благодаря
участию постсинаптических рецепторов Глу в синаптической пластичности,
сам Глу вовлечен в такие когнитивные функции, как обучение и память.
Однако в условиях гиперактивации различных типов рецепторов Глу в
нейронах могут развиваться нейродегенеративные процессы, связанные с
нарушением Са2+ регуляции, которые запускают внутриклеточные
сигнальные каскады, приводящие к гибели нейронов (Khodorov, 2004). Известно, что нейротоксичность Глу участвует в патогенезе таких социально значимых неврологических заболеваний как эпилепсия, ишемический инсульт, мигрень, боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона. В связи с этим, изучение механизмов нейротоксического действия Глу и агонистов его рецепторов является одним из наиболее актуальных направлений в современной нейробиологии.
Известно, что в первую очередь, нейротоксическое действие Глу
реализуется в глутамат-чувствительных нейронах ЦНС. Однако часть
нейродегенеративных заболеваний, сопряженных с гиперактивацией
рецепторов Глу, развивается на периферии, в нейронах неглутаматергической природы. Тем не менее, вопрос экспрессии рецепторов Глу и механизмов нейротоксического действия Глу в тканях периферической нервной системы (ПНС) остается мало изученным.
Исследование механизмов развития патологических процессов на
целом мозге и ПНС, затруднено из–за их сложной структурной организации и
ограничений в применимости современных методов исследований. Большой
прогресс в изучении многих аспектов нейродегенерации был достигнут в
экспериментах на первичных культурах ткани различных отделов мозга
(Bading et al., 1995; Kim, Pae, 1996; Kim et al., 1999), так как данный
экспериментальный подход позволяет контролировать внеклеточную среду и
рост клеток, дает возможность для исследования внутриклеточных
механизмов и межнейронных взаимодействий в нейронной сети. Тем не
менее, остается открытым вопрос о сохранности структурно-функциональной
специализации нейронов, выделенных из эмбриональной ткани и
подверженных культивированию в течение нескольких дней. Являются ли нейроны, выращенные в искусственных условиях гомогенными по своим
функциональным свойствам? Исследование данного вопроса представляется весьма актуальным для правильной интерпретации результатов, полученных на первичной культуре нейронов, и их сопоставления с процессами, происходящими в нейронах мозга взрослых животных.
На сегодняшний день известно, что патогенез многих
нейродегенеративных заболеваний сопряжен с увеличением концентрации
гомоцистеина (ГЦ) в кровотоке и цереброспинальной жидкости (Kruman et al.,
2002; Sachdev, 2005). Данная аминокислота может накапливаться в результате
нарушения синтеза метионина и цистеина, вызванного недостатком фолиевой
кислоты и витаминов группы В, или вследствие, генетически обусловленного
полиморфизма – точечной мутации, заключающейся в замене с цитозина (С)
на тимин (Т) в нуклеотиде (C677T) гена 5’-10’-метилентетрагидрофолат
редуктазы (Rozen 1997; Sachdev, 2005; Isobe, Terayama, 2010). Исследования
последних лет показали, что ГЦ может взаимодействовать с сайтом
связывания Глу или глицина NMDA рецептора (Poddar, Paul, 2013), а значит
может быть рассмотрен как новый эндогенный активатор рецепторов Глу
(Lipton et al., 1997). Известно, что чрезмерная активация NMDA рецепторов
вызывает сильный окислительный стресс, и как следствие, сильную
деполяризацию митохондрий (Reyes et al., 2012). Наряду с этим было
показано, что в одних экспериментальных моделях, например в
эпителиальных клетках, ГЦ вызывал окислительный эффект (Outinen et al., 1998), а в других, таких как нейроны и астроциты, оказывал восстанавливающий эффект (Loureiro et al., 2010). В связи с этим, вопрос вовлеченности ГЦ в индукцию окислительного стресса пока остается открытым.
Несмотря на то, что из-за актуальности для практической медицины изучение цитотоксического действия ГЦ является активно развивающимся направлением нейробиологии, нейротоксическое действие ГЦ, его вовлеченность в окислительный стресс и роль ГЦ в Са2+ сигнализации в центральных и периферических нейронах остаются мало изученными.
Цель исследования. В центральных и периферических нейронах крыс
исследовать рецепторные механизмы нейротоксического действия агонистов
рецепторов глутамата, вызывающие накопление Са2+ и изменение
митохондриального мембранного потенциала.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие
конкретные задачи исследования.
-
Изучить динамику увеличения концентрации кальция, вызванного активацией NMDA и АМПА рецепторов в нейронах коры мозга крыс in vitro.
-
C использованием избирательных блокаторов, изучить субъединичный состав NMDA и АМПА рецепторов, вовлеченных в генерацию кальциевых ответов в нейронах коры мозга крыс in vitro.
-
В нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре ткани исследовать нейротоксический эффект долговременного действия гомоцистеина.
-
В нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре сопоставить амплитудно-временные характеристики внутриклеточных кальциевых ответов на гомоцистеин, NMDA и глутамат.
-
Изучить изменения митохондриального мембранного потенциала (mit), вызванные кратковременным действием гомоцистеина, NMDA и глутамата в нейронах первичной культуры коры мозга и тригеминального ганглия крыс.
Научная новизна. Исследованы Са2+ ответы нейронов коры мозга крыс на каинат, который является сильным нейротоксическим агентом и избирательным агонистом рецепторов АМПА типа (Abushik et al., 2013). Впервые обнаружено, что Са2+ ответы при действии каината развивались гораздо медленнее, чем при активации NMDA рецепторов в нейронах коры мозга. Это обусловлено наличием АМПА рецепторов, которые обладают различной проводимостью для Са2+ в зависимости от экспрессии GluA2 субъединицы, что отражает функциональные характеристики нейрона. Таким образом, было впервые показано, что нейроны в первичной культуре являются гетерогенными и обладают морфофунциональной специализацией, характерной для нейронов коры мозга крыс.
Впервые показано, что нейротоксический эффект ГЦ определяется синергизмом активации NMDA рецепторов и метаботропных рецепторов глутамата, так как избирательные антагонисты каждого из этих рецепторов предотвращали гибель глутамат-чувствительных центральных нейронов, а также пуринергических и пептидергических периферических нейронов. Были впервые зарегистрированы интегральные трансмембранные токи, вызванные ГЦ в нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс, и продемонстрировано, что они генерируются в результате активации NMDA рецепторов. Впервые было показано, что в отличие от Глу и NMDA, ГЦ индуцирует кратковременные быстрые кальциевые ответы осцилляторного
типа. Также в отличие от NMDA и Глу, ГЦ не вызывает деполяризацию мембраны митохондрий на начальных этапах нейротоксического действия в нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре ткани.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Нейроны коры мозга крыс в первичной культуре ткани, по экспрессии Са2+-проницаемых и Са2+-непроницаемых АМПА рецепторов различного субъединичного состава, являются гетерогенными и обладают морфофункциональной специализацией, характерной для нейронов коры мозга крыс.
-
Несмотря на различную медиаторную природу синаптических сигналов нейронов коры мозга и тригеминального ганглия крыс, нейротоксический эффект гомоцистеина в обоих типах нейронов развивается через активацию ионотропных NMDA рецепторов и метаботропных рецепторов глутамата 5 типа.
-
Гомоцистеин, в отличие от NMDA и глутамата, вызывает кратковременные быстрые кальциевые ответы осцилляторного типа и не вызывает падения митохондриального мембранного потенциала в нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре, а следовательно, не вызывает окислительный стресс на начальных этапах нейротоксического действия.
Теоретическая и практическая значимость. Работа имеет
фундаментальное значение для науки в области исследования
нейродегенеративных процессов, участвующих в патогенезе таких социально
значимых заболеваний, как инсульт, болезнь Альцгеймера, болезнь
Паркинсона и мигрень с аурой. Теоретическое значение работы состоит в
расширении представлений о механизмах нейродегенерации, вызванной
чрезмерной активацией рецепторов Глу. Результаты исследования могут быть
полезны для понимания механизмов возникновения и развития
нейродегенеративных состояний, неврологических расстройств в ЦНС и ПНС, а также для выявления возможных механизмов защиты нейронов от гибели.
Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, 4 из которых статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для
размещения материалов кандидатских диссертаций (в том числе 3 статьи в международных журналах), 10 тезисов докладов.
Апробация работы. Результаты исследования представлены на XXI и
XII съезде физиологического общества им. И.М. Павлова (Калуга, 2010;
Волгоград, 2013), на XVIII международной конференции студентов,
аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), на
четырнадцатом международном совещание и седьмой школе по
эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011) на III Съезде Физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Украина, Ялта, 2011), на восьмом форуме европейской федерации нейробиологов 8th FENS Forum of Neuroscience 2012 (Испания, Барселона, 2012), на седьмом и восьмом ежегодном симпозиуме Университета восточной Финляндии The Annual PostGraduate Symposium of the Doctoral Program in Molecular Medicine: Winter School (Финляндия, Нильсия, 2013, 2014) и на ежегодной встрече общества нейробиологов Neuroscience 2013 (США, Сан-Диего, 2013).
Структура и объм диссертации. Диссертация изложена на 113
страницах машинописного текста и состоит из общей характеристики работы,
обзора литературы по исследуемой проблеме – глава 1, описания методики
экспериментов – глава 2, результатов исследования – глава 3, обсуждения
результатов экспериментов – глава 4, выводов и списка литературы,
включающего 184 источника (из них 164 иностранных). Работа
иллюстрирована 26 рисунками и 1 таблицей.
NMDA-чувствительные ионотропные рецепторы глутамата
NMDA рецептор включает в свой состав: сайт специфического связывания медиатора (Глу) в лиганд-связывающем домене, сайт связывания коагониста (Гли) и аллостерические модуляторные сайты, расположенные во внеклеточной области рецептора и в ионном канале (сайты связывания двухвалентных катионов и потенциалзависимый Mg2+-связывающий участок). Показано, что NMDA рецептор является гетеромерной структурой, состоящий из субъединиц трех типов: GluN1, GluN2A – GluN2D, GluN3A – 3B. Один рецептор всегда состоит из четырех субъединиц, при этом GluN1 субъединица является необходимой для формирования рецептора, так как при ее отсутствии рецептор не способен активироваться (Pachernegg et al., 2012). Структурные различия GluN2 субъединиц определяют функциональную гетерогенность NMDA рецепторов в различных нейрональных клетках (Pachernegg et al., 2012). Более того, соотношение субъединиц, входящих в состав рецепторного комплекса, может изменяется с возрастом и в зависимости от степени активности синапсов. Все субъединицы NMDA рецепотра расположены в мембране одинаково. Каждая субъединица имеет три трансмембранных домена (М1, М3 и М4), и один внутримембранный домен М2, N-терминальный домен, расположенный внеклеточно, и внутриклеточный С-терминальный домен. В образовании канала рецептора участвуют М2 домены четырх субъединиц (рис. 1.3). Сайт связывания Глу находится на двух доменах, расположенных на N-терминальном домене перед М1 доменом и на М3–М4 петле, соответственно, причем эти домены принадлежат GluN2 субъединицам. Те же самые места на субъединицах GluN1 и GluN3 типа служат местом связывания (Гли) (Pachernegg et al., 2012). В зависимости от субъединичного состава NMDA рецепторы могут приобретать различные свойства. Например, NMDA рецепторы с GluN2A cубъединицей, десенситизируются быстрее, чем рецепторы, содержащие GluN2D субъединицу. Основным молекулярным механизмом, который ограничивает длительность постсинаптического сигнала, является десенситизация рецепторов Глу. Более того, все ионотропные рецепторы Глу различаются по кинетическим параметрам десенситизации. Известно, что NMDA рецепторы переходят медленно в десенситизированное состояние, при этом описано множествомеханизмов их десенситизации. В отличие от NMDA рецепторов, АМПА/KA рецепторы переходят в десенситизированное состояние быстро, при этом их десенситизации больше (Dingledine et al., 1999). Известно, что в зависимости от скоростей открытия и закрытия каналов рецепторов Глу, десенситизация может увеличивать или уменьшать длительность синаптических токов (Jones, Westbrook, 1996; Johnson, Ascher, 1987).
Большую роль в функциионировании ионотропных рецепторов Глу играют пост-трансляционные модификации, наиболее важной из которых является фосфорилирование рецепторных субъединиц. Известно, что в мозге млекопитающих 10 – 70 % GluN1 и GluN2 субъединиц NMDA рецепторов фосфорилированы по нескольким сайтам. В основном именно изменение соотношения фосфорилированых и нефосфорилированых субъединиц определяет возможности регуляции глутаматергической синаптической передачи (Dingledine et al., 1999). Рисунок 1.3. Структура NMDA рецептора. Соединения, способные избирательно взаимодействовать с Глу связывающим сайтом NMDA рецептора, называют агонистами и конкурентными антагонистами NMDA рецептора. А соединения, блокирующие канал NMDA рецептора назвают неконкурентными антагонистами. Агонистами Глу связывающего сайта NMDA рецептора кроме Глу являются сам NMDA, иботеновая кислота, аспартат и другие. Антагонистам конкурентного типа действия являются D,L-AP5 (D,L-APV), D,L-AP7, CPP и другие. Они взаимодействуют с местами связывания Глу, предотвращая активацию рецептора (Калинина и др., 1989).
NMDA рецептор, помимо сайта связывания для Глу, имеет специфический сайт связывания для коагониста Гли, который взаимодействует с рецептором при низких концентрациях - ЕС50 составляет 10 – 30 мкМ (Jоhnsоn, Ascher, 1987; Sinоr et al., 2000). Известно, что связывание Гли с GluN1 субъединицей увеличивает вероятность активации NMDA рецептора, при этом уменьшеется скорость десенситизации. Более того, в малых концентрациях (1 – 10 мкМ) Гли увеличивает амплитуду токов, вызванных активацией NMDA рецепторов. В отсутствие Гли рецепторы NMDA типа активируются слабо или не активируется Глу вовсе. Известно, что агонистом сайта связывания Гли на NMDA рецепторе является эндогенный D-серин. Одним из эндогенных антагонистов, для сайта связывания Гли является кинуриновая кислота, которая синтезируется в глиальных клетках. Эффект блокады кинуриновой кислотой NMDA-вызванных токов может быть снят за счет добавления Гли или D-серина.
Важно, что в отличие от других ионотропных рецепторов Глу, каналы NMDA рецепторов являются потенциалозависимыми. Так при обычном потенциале покоя (от -70 мВ до -80 мВ) NMDA практически не вызывает входящие токи. При увеличении потенциала покоя токи значительно возрастают и достигают максимума при мембранном потенциале от -30 до -20 мВ. Прежде всего, это связано с тем, что при потенциале покоя -70 мВ, канал NMDA рецептора, независимо от открытия канала, блокирован ионами Mg2+(Mayer et al., 1984; Nоwak et al., 1984; Antоnоv, Jоhnsоn, 1999). При деполяризации мембраны сродство Mg2+ к каналу NMDA рецептора снижается и канал в отсутствии Mg2+ обретает способность проводить ионы Na+ и Ca2+ в нейрон (Mayer et al., 1984; Nоwak et al., 1984). Механизм блокирующего действия Mg2+ заключается в том, что Mg2+ взаимодействует с специальным сайтом связывания, препятствуя прохождению других ионов через канал. Обычно, в дальнейшем Mg2+ диссоциирует обратно во внеклеточный раствор. Место связывания наружного Mg2+ расположено достаточно глубоко в области трансмембранной поры рецептора, на которой происходит полное падение мембранного потенциала. В результате сродство наружного Mg2+ к его месту связывания в канале зависит от мембранного потенциала: чем отрицателее мембранный потенциал, тем выше сродство Mg2+ и эффективность его блока канала. Таким образом, можно сказать, что Mg2+ является одним из важнейших эндогенных модуляторов. Известно, что наружный Mg2+ способен потенцировать активность NMDA рецептора, как повышая сродство Гли к рецептору (Antоnоv, Jоhnsоn, 1999; Wang, MacDоnald, 1995), так и посредством Гли–независимого механизма (Paоletti et al., 1995). В определенных условиях Mg2+ также проникает через каналы NMDA рецептора (Antоnоv, Jоhnsоn, 1999; Mayer, Westbrооk, 1987). Поскольку в условиях патологии происходит существенное изменение нормальных ионных градиентов, регуляция эффективности блока наружным Mg2+ может иметь существенное значения для функционирования нейронов и нейрональных сетей.
Часто, активация NMDA рецепторов приводит к деполяризации нейронов, так как открытые каналы рецепторов способные проводить ионы Na+. Более того, каналы NMDA рецепторов обладают проницаемостью для ионов Са2+, которые по электрохимическому градиентувходят в нейрон при активации NMDAрецепторов, что является весьма существенным для функционирования ЦНС в целом (Burnashev et al., 1992). Известно, что канал NMDA рецептора имеет несколько последовательных сайтов связывания для ионов Mg2+, Са2+ и Zn2+, которые являются наиболее значимыми эндогенными регуляторами рецепторов Глу (Antоnоv et al., 1998).
Регистрация токов нейронов методом локальной фиксации потенциала
Патч-кламп регистрацию токов проводили в конфигурации «целая клетка» (Hamill et al., 1981) на нейронах с 10 по 16 день культивирования (10-16 days in vitro, DIV). В опытах использовали внеклеточный перфузионный раствор следующего состава (концентрации указаны в мМ): NaCl, 140; KCl, 2.8; CaCl2, 2.0; MgCl2, 1.0; HEPES 10, при pH 7.2–7.4. Во всех экспериментах для измерения токов из раствора был исключен Mg2+. Кроме того, в безмагниевом растворе выполнены все эксперименты с использованием блокаторов NMDA рецепторов. Внутриклеточный раствор для заполнения микроэлектрода имел следующий состав (мМ): 9 NaCl, 17.5 KCl, 121.5 K-глюконат, 1 MgСl2, 10 HEPES, 0.2 EGTA, 2 MgATP, 0.5 NaGTP (Han, Stevens, 2009). Патч-пипетки для регистрации были вытянуты из боросиликатного стекла с внешним диаметром 1,5 мм и внутренним филаментом (Sutter Instrument #BF150-86-10, Sutter Instruments Company, США). Для регистрации токов применяли усилитель MultiClamp 700B c системой сбора данных Digidata 1440A и программное обеспечение pClamp v10.2 (Molecular Devices, США). Частота дискретизации составляла 20000 изм/с с предварительной аналоговой фильтрацией (эквивалент фильтра Бесселя 8 порядка) с частотой среза 1.4 кГц для удаления высокочастотных шумов. Позиционирование кончика микроэлектрода выполняли микроманипулятором MP-85 (Sutter Instruments Company, США) под визуальным контролем на инвертированном микроскопе Nikon Diaphot TMD (Nikon, Япония). Для аппликации тестовых веществ использовали систему быстрой смены растворов на базе BPS-4 (Ala Scientific Instruments, США).
Регистрацию токов, вызванных агонистами, а также анализ их частоты выполняли в программе Clampfit 10.2, входящей в пакет pClamp. 2.6. Определение апоптотических и некротических клеток путем последовательного окрашивания акрединовым оранжевым и бромистым этидием
Для определения погибших нейронов методом конфокальной микроскопии использовались флуорохромы акридиновый оранжевый (АО) (0,001%) и бромистый этидий (БЭ) (0,001%). Поскольку апоптоз может запускаться при нормальном развитии нейронов в культуре, необходимо было учитывать его вклад в сравнении с экспериментально вызванным апоптозом. Полученные статистические данные показали, что процент апоптотических клеток в интактной культуре был незначителен и соответствовал нормальным физиологическим условиям (Simonetti et al., 2006; Mironova et al., 2007), поэтому в дальнейшем его вклад не учитывался.
Для определения соотношения живых, апоптотических и некротических клеток покровные стекла с культурой клеток обрабатывали АО в течение 20 с, после чего АО отмывали физиологическим раствором. После отмывки АО культуру обрабатывали БЭ в течение того же периода времени. Непосредственно перед регистрацией флуоресценции методом конфокальной микроскопии производилась тщательная отмывка препарата физиологическим раствором для предотвращения фоновой флуоресценции за счет остаточной концентрации флуорохромов в растворе.
Для проведения измерения флуоресценции АО и БЭ окрашенные покровные стекла с клетками переносили в регистрационную/перфузионную камеру, которая помещалась на подвижный предметный столик инвертированного конфокального микроскопа Leica TCS SP5 MP. Возбуждение флуорохрома проводили аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Эмиссию АО регистрировали в зеленой области спектра (максимум излучения приходится на 530 нм), а БЭ в красной области (максимум излучения приходится на 620 нм).
Регистрация изображения осуществлялась двумя независимыми каналами конфокального микроскопа. Результирующее изображение получали путем наложения двух изображений, зарегистрированных в разных (зеленой и красной) областях спектра с помощью программного обеспечения Leica LAS AF. Ядра нейронов, у которых имеется деструкция плазматической мембраны, окрашивались БЭ и излучали красный свет. Ядра живых нейронов окрашивались АО и светились зеленым цветом, а ядра апоптотических нейронов светились желто-оранжевым цветом, вследствие закисления внутриклеточной среды и изменения спектра эмиссии АО (Zelenin 1996). Подсчет соотношения количества живых апоптотических и некротических клеток проводили с помощью плагина http://sibarov.ru/index.php?slab (Sibarov et al., 2012) для ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/), который проводит подсчет количества пикселей зеленого, желтого и красного цвета с каждого изображения.
Исследование нейротоксического эффекта гомоцистеина на нейроны первичной культуры коры мозга крыс
Ранее в лаборатории ИЭФБ РАН было показано, что Глу в концентрации свыше 300 мкМ, селективные агонисты NMDA и АМПА/KA рецептров глутамата – NMDA (30 мкМ, совместно с ко-агонистом NMDA рецепторов 30 мкМ глицина) и КА, соответственно после 240 минут действия вызывают гибель более 60 % нейронов по механизму апоптоза и некроза в первичной культуре клеток коры мозга крыс (Mironova et al., 2007; Sibarov et al., 2012). В связи с этим, было интересно исследовать долговременное действие ГЦ, как возможного эндогенного агониста рецепторов Глу, в патологических концентрациях 100 и 500 мкМ на клетки первичной культуры коры мозга крыс.
В результате определения количества погибших нейронов методом конфокальной микроскопии с использованием АО и БЭ (Mironova et al., 2007) было выявлено, что 100 мкМ ГЦ после 24 часов действия в ростовой среде первичной культуры клеток коры мозга крыс оказывает нейротоксическое действие (рис. 3.5.а). Так было показано, что процент живых нейронов после действия 100 мкМ ГЦ составил 50 ± 3 % (рис. 3.5), а 500 мкМ ГЦ снижало процент живых нейронов до 26 ± 3 % (рис.3.5.б ).
Рисунок 3.5. Нейротоксическое действие гомоцистеина (ГЦ) на нейроны первичной культуры коры мозга крыс. (а) Флуоресцентное изображение нейронов в первичной культуре к коры мозга крыс после 24 часов в контрольных условиях («контроль») и после действия 100 мкМ ГЦ, полученное с помощью окрашивания АО и БЭ. Масштабная линейка 100 мкм. (б) Гистограмма процента живых клеток после 24 ч действия в контроле, после действия только 100 мкМ или 500 мкМ ГЦ, или 100 мкМ ГЦ совместно с 50 мкМ AP-5 или 10 мкМ MTEP. Представлены данные со стандартной ошибкой ( - p 0.05 , - p 0.01) по 3-5 экспериментам.
Интересно, что аппликация 100 мкМ ГЦ совместно с избирательным антагонистом NMDA рецепторов – AP-5 (50 мкМ) не вызывала гибели нейронов, а процент живых клеток составил 63 ± 2 % и достоверно не отличался от значений, полученных в контроле (p 0,05, количество опытов – 5) (рис.3.5.б). Более того, MTEP – избирательный блокатор мГлуР5, так же предотвращал гибель нейронов. Процент живых клеток составил 62 ± 2 % и также достоверно не отличался от значений, полученных в контроле (p 0,05, количество опытов – 5) рис.3.5.б). Таким образом, нами впервые было выявлено, что нейротоксичность ГЦ в нейронах первичной культуры коры мозга крыс реализуется через ионотропный рецептор глутамата NMDA и мГлуР5 типа.
Поскольку было обнаружено, что ГЦ после 24 часов действия в концентрации 100 мкМ и выше оказывает нейротоксический эффект на нейроны коры мозга крыс, было интересно исследовать внутриклеточные Са2+ответы, вызванные кратковременной (2 мин) аппликацией 100 мкМ ГЦ.
Полученные результаты представлены на рис. 3.6. В качестве маркера нейрона после аппликации ГЦ на клетку подавали 50 мкМ KCl, вызывающего открытие Са2+ каналов через деполяризацию, которая характерна для возбудимых тканей, к которым относятся нейроны (Simonetti et al., 2006). Кратковременная аппликация 100 мкМ ГЦ вызывала Са2+ ответы осцилляторного типа (рис. 3.6.а), отличного от ответов, вызванных NMDA или КА, в 80 % нейронов (рис. 3.6.б). Интересно, что сочетанная аппликация 100 мкМ ГЦ совместно с 50 мкМ AP-5 или 10 мкМ MTEP снижала количество клеток, дающих Са2+ ответ с 80 ± 3 % до 39 ± 5 % в случае AP-5 и до 39 ± 6 % в случаем MTEP.
Долговременное действие (60 мин) 100 мкМ ГЦ вызывало Ca2+ответы (рис. 3.6.в), сходные по динамике с ответами на NMDA и KA при их долговременном действии. Интересно, что аппликация ГЦ совместно с AP-5 или MTEP не полностью снижала количество нейронов, дающих Ca2+ ответ. Только сочетанная аппликация ГЦ совместно с 50 мкм AP-5 и 10 мкМ MTEP полностью предотвращала увеличение [Са2+]i.
Внутриклеточные Са2+ ответы, вызванные кратковременным и долговременным действием 100 мкМ гомоистеина (ГЦ) на нейроны коры мозга крыс. (а) Са2+ ответ одиночного нейрона, вызванный аппликацией 100 мкМ ГЦ на 2 мин. 50 мкМ KCl использованы в качестве маркера нейрона. Ось ординат – относительная интенсивность свечения Fluo-3 (за 1 принято свечение в контроле). Момент аппликации и длительность действия ГЦ и KCl показаны жирной линией над графиком. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 4. (б) Процентное соотношение нейронов, дающих Са2+ ответ на кратковременную аппликацию (2 мин) 100 мкМ ГЦ одного, или в комбинации с 50 мкМ AP-5 или 10 мкМ MTEP. Представлены данные со стандартной ошибкой ( - p 0.05 , - p 0.01) по 3-5 экспериментам. (в) Са2+ ответы нейронов, вызванные долговременной (50 мин) аппликацией 100 мкМ ГЦ. Ось ординат – относительная интенсивность свечения Fluo-3 (за 1 принято свечение в контроле). Момент аппликации и длительность действия ГЦ показаны линией над графиком. Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са2+ ответ одного нейрона. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 3.
Полученные данные на культуре нейронов коры мозга крыс показали, что ГЦ в высоких концентрациях может оказывать нейротоксический эффект, который предотвращается избирательными антагонистами рецепторов NMDA-типа и мГлуР5 типа – AP-5 и MTEP, соответственно. Важно, что аналогично действию Глу, нейротоксическое действие ГЦ запускается чрезмерным входом Са2+ через ионотропные рецепторы глутамата NMDA типа и выход Са2+ из внутриклеточных депо, активируемых метаботропным рецептором глутамата мГлуР5 типа (Nanou et al., 2009).
Митохондриальный мембранный потенциал
Известно, что долговременная Са2+ дисрегуляция приводит к дисфункции митохондрий, нарушению функционирования дыхательной цепи, запуску окислительного фосфорилирования, и является ключевым моментом инициации гибели нейронов.
В связи с тем, что ГЦ, NMDA и Глу могут оказывать нейротоксический эффект на нейроны ЦНС и ПНС, было интересно исследовать влияние данных агонистов рецепторов Глу на Aqw, как маркер состояния митохондрий.
Флуорофор Rho123 позволяет детектировать падение Aqw В качестве контроля для определения максимального Aqw на 2 мин после действия агонистов апплицировали протонофор FCCP в концентрации 4 мкМ, который приводит к полному разобщению дыхательной цепи, вызывая тем самым максимум эмиссии Rho123.
На рис. 3.12.1 представлены Acpmit , вызванные 100 мкМ ГЦ, 30 мкМ NMDA или 300 мкМ Глу в нейронах тригеминального ганглия крыс (рис.3.12.1.а-в) и нейронах коры мозга (рис.3.12.1.г-е). 100 мкМ ГЦ после 6 минут действия в нейронах тригеминального ганглия не вызывал сильного падения Acpmit по сравнению с FCCP (рис. 3.12.1.а). В нейронах тригеминального ганглия крыс после 6 минут действия 30 мкМ NMDA, наоборот, вызывало падение Acpmit, сопоставимое с падением потенциала от действия FCCP (рис.3.12.1.б). 300 мкМ Глу в нейронах тригеминального ганглия крыс вызывало падение Aqw меньшее, чем от действия NMDA, но большее чем от действия ГЦ.
В нейронах коры мозга крыс наблюдалась тенденция, сходная с изменением A(pmit в нейронах тригеминального ганглия крыс: 100 мкМ ГЦ после 6 минут действия не вызывало сильно падения Aqw по сравнению с падением A(pmit, вызванным FCCP (рис. 3.12.1.г); 30 мкМ NMDA после 6 минут действия вызывало падение Acpmit, сопоставимое с Acpmit от FCCP; 300 мкМ Глу вызывало падение Aqw большее, чем от действия ГЦ, но меньшее чем при действии NMDA.
Для более точного сопоставления падения Acpmit, вызванного действием агонистов рецепторов Глу на нейроны триеминального ганглия и нейроны коры мозга крыс, было расчитано отношение: Афті1агонист/Афті1РССР (Лср для каждого из агонистов - 100 мкМ ГЦ, 30 мкМ NMDA или 300 мкМ Глу относительно Aqw, вызванного действием FCCP). На рис. 3.12.2 представлены гистограммы отношения Лфпагонист/Лфп/0015. Для нейронов тригеминального ганглия (рис. 3.12.2.а) ЛфпГЦ/Лфп/0015 составило 0,13 ± 0,01 отн.ед., Лфт11Глу/Лф„/сср составило 0,29 ± 0,04 отн.ед. и достоверно отличалось от значений, полученных при действии 100 мкМ ГЦ (р 0,05, количество опытов - 3, 38 нейронов), а
ЛфтйКМВА/Д-фтйРССР составило 0,42 ± 0,08 отн.ед. и достоверно отличалось от W значений, полученных при действии 100 мкМ ГЦ (р 0,01, количество опытов - 3, нейронов). Для нейронов коры мозга крыс (рис. 3.12.2.б) А ГЦ/Ац) составило 0,13 ± 0,02 отн.ед., Афті1Глу/Афті1рсср составило 0,22 ± 0,05 отн.ед., а
ЛфтйКМВА/ЛфтйРССР составило 0,41 ± 0,05 отн.ед. и достоверно отличались от значений, полученных при действии 100 мкМ ГЦ (р 0,01, количество опытов - 3, 31 нейрон) и при действии 300 мкМ Глу (р 0,05, количество опытов - 3, 21 нейрон).
Различия в значении Афпйагонис7Афп/ССР связано с силой действия самих агонистов. NMDA являеся агонистом с высоким Kd связывания к NMDA рецептору и не имеющим естественных систем утилизации и проявляет более сильный нейротоксический эффект, чем ГЦ или Глу. ГЦ является более слабым эндогенным агонистом рецепторов Глу, чем Глу и NMDA (Shi et al, 2003). Существуют работы, говорящие о возможной утилизации нейронами и глиальными клетками не только Глу, но и ГЦ (Lu et al., 2009), за счет синтеза глутатиона из ГЦ. Таким образом, нарушение в метаболизме ГЦ может усиливать токсическое действие Глу не только в ЦНС, но и за ее пределами.
Полученые результаты демонстрируют, что механизм развития нейротоксического эффекта агонистов рецепторов Глу существенно не отличается в нейронах ЦНС и ПНС, и включает в себя помимо кальциевой дисрегуляции, дисфункцию митохондрий, приводящую к разобщению митохондриальной дыхательной цепи, запуску окислительного фосфорилирования, которое впоследствии может приводить к инициации гибели нейронов по механизму апоптоза.
