Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. ультраформы и некультивируемые формы бактерий 8
1.1.1. Ультраформы бактерий 8
1.1.2. Некультивируемые формы бактерий 14
1.2. Систематика микоплазм 17
1.3. Биология микоплазм 22
1.3.1. Морфология и ультраструктура микоплазм 22
1.3.2. Физиологические особенности микоплазм 27
1.3.3. Распространение микоплазм в природе 3 О
1.4. Микоплазмы - патогены растений 34
1.4.1. Распространение микоплазмозов растений 34
1.4.2. Пути передачи инфекции и её сохранение 39
1.4.3. Микоплазмоподобные организмы (МПО) и связь их с фитоплазмами 44
1.5. Почва как среда обитания патогенных микроорганизмов 50
1.5.1. Почва - универсальная среда обитания микроорганизмов 50
1.5.2. Фитопатогеные бактерии в почве 56
1.5.3. Патогенные бактерии в почве 58
1.6. Методы идентификации микоплазм 61
1.6.1. Микробиологический метод 61
1.6.2. Серологические методы 61
1.6.3. Молекулярно-биологические методы 62
1.6.4. Методы микроскопирования 65
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 66
2.1. Объекты исследования 66
2.2. Методы исследования 61
2.3. Проведение лабораторных опытов 72
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 80
3.1. Методические приемы работы с микоплазмами. 80
3.1.1. Разработка эффективных селективных методов для выделения Acholeplasma laidlawii из почвы 80
3.1.2. Десорбция Acholeplasma laidlawii из почвы 91
3.1.3. Метод ПЦР для детекции Acholeplasma laidlawii в почве 96
3.2. Динамика численности и идентификация Acholeplasma laidlawii в почве 100
3.3. Влияние температуры и кислотности почвы на динамику численности Acholeplasma laidlawii 106
3.4. Влияние растений гороха посевного на длительность выживания Acholeplasma laidlawii в почве 108
3.5. Проникновение Acholeplasma laidlawii через корневую систему в растение гороха 110
3.6. Проникновение Acholeplasma laidlawii через корневую систему в растение томата 112
Выводы 117
Список литературных источников 119
- Некультивируемые формы бактерий
- Микоплазмоподобные организмы (МПО) и связь их с фитоплазмами
- Проведение лабораторных опытов
- Разработка эффективных селективных методов для выделения Acholeplasma laidlawii из почвы
Введение к работе
Микоплазмы - простейшие лишенные клеточной стенки прокариоты,
объединённые в класс Mollicutes. Малый размер генома и ограниченные
биосинтетические возможности обусловили их сосуществование с клетками
высших эукариот. Все известные микоплазмы, встречающиеся в природе
относят к симбионтам животных, насекомых и растений. Фитопатогенные
микоплазмы являются возбудителями более 600 заболеваний растений из 96
семейств (Борхсениус и др., 2002). Микоплазмозы растений широко
распространены в регионах интенсивного возделывания
сельскохозяйственных культур (Волгоградской, Саратовской, Астраханской областях, Краснодарском крае, на Северном Кавказе) и наносят огромный ущерб сельскому хозяйству России, снижая урожай пшеницы на 80-90%, картофеля - на 18-20%, томатов и других пасленовых на 25-38% (Власов и др., 1985, 2000; Скрипаль, 1988; Борхсениус и др., 1989; Самсонова, 2000).
Основную роль в распространении микоплазмозов растений отводят насекомым-переносчикам (Власов и др., 1985; Богоутдинов, 2001). Заболевание может передаваться также через паразитические растения, например, повилику (Яковлева, 1992). Накопителем и источником инфекции являются многолетние растения, поскольку в их корнях микоплазмы способны перезимовывать, а весной мигрировать в вегетативные органы. Фитоплазмы сохраняются зимой в многолетних сорняках, клубнях, корнеплодах, луковицах (Дементьева, 1987; Seemuller et al., 1998а; Приходько, 1999; Davies, 2000). В последние годы (Мидянник, 1995; Чернов и др., 1999) экспериментально в условиях in vitro подтверждена возможность проникновения микоплазмы Acholeplasma laidlawii через неповрежденную корневую систему люцерны и гороха в надземную часть растений. Этот факт позволяет предположить существование совершенно иного механизма передачи инфекции - через корневую систему непосредственно из почвы,
которая может играть роль естественного резервуара фитопатогенных микоплазм.
Проведение экологических исследований микоплазм, изучение возможности их обитания в почве и механизмов инфицирования растений своевременно, так как позволит разработать эффективные меры предотвращения заболеваний растений и решить проблемы управления микоплазменными инфекциями.
Цель работы - выяснить пригодность почвы как среды обитания фитопатогенных микоплазм, изучить динамику численности интродуцированнои популяции микоплазм в почве и возможность проникновения микоплазм из почвы в растение через корневую систему.
Задачи исследования:
Разработка эффективных селективных методов выявления и количественного учета микоплазм в почве.
Применение метода ПЦР для идентификации микоплазм в черноземной почве.
Определение динамики численности интродуцированнои популяции микоплазм в почве.
Изучение влияния абиотических и биотических факторов среды на численность интродуцированнои популяции Acholeplasma laidlawii в почве.
Изучение возможности проникновения микоплазм из почвы в растение через корневую систему.
Научная новизна. Разработаны и впервые применены селективные приемы выделения микоплазм из почвы, заключающиеся в механической предварительной обработке почвы, использовании селективной среды и
повышенной температуры инкубации посевов. Впервые экспериментально установлено, что почва может играть роль естественного резервуара и источника фитопатогенных микоплазм. Длительность выживания микоплазм в почве зависит от типа почвы. Показано, что Acholeplasma laidlawii способна проникать непосредственно из почвы в растения через корневую систему, мигрировать в надземные ткани растения и длительно персистировать в них, вызывая специфические морфологические изменения растений.
Практическая значимость. В результате проделанной работы разработаны методические подходы для выявления и количественного учета микоплазм в почве. Использованы метод посева на селективную питательную среду и ПЦР-анализ. Установлено, что для проведения ПЦР в черноземной почве целесообразно использовать непрямой способ выделения ДНК, так как при непосредственном экстрагировании ДНК из почвы происходит ингибирование полимеразной цепной реакции. Рекомендованные методы могут быть использованы в экологических исследованиях микоплазм в почве, что пополнит наши знания об этой малоизученной группе микроорганизмов, а также о биоразнообразии почв; в сельском хозяйстве для диагностики возбудителей болезней растений при разработке мер борьбы с микоплазмозами и предотвращения эпифитотий.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 11-м Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям между растениями и микроорганизмами (Санкт-Петербург, 2003); конференции молодых ученых и специалистов МСХА (Москва, 2003); научной конференции МСХА (Москва, 2004).
Публикации. Материалы диссертации изложены в 4 печатных работах.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы, включающий 213 наименования, в том числе 107 - зарубежных авторов. В работе представлено 4 таблицы, 30 рисунков.
Автор выражает искреннюю признательность и благодарность научному руководителю к.б.н. А.А. Ваньковой, д.б.н. Л.В. Васильевой (ИНМИ РАН), д.б.н. проф. Шильниковой В.К., к.б.н. П.И. Иванову, д.б.н. И.В. Раковской (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), д.б.н. В.М. Чернову, к.б.н. Ю.В. Гоголеву и н.с. Н.Е. Мухаметшиной (КИББ КНЦ РАН, лаборатория молекулярных основ патогенеза), к.б.н. Г.И. Карлову (лаборатория биотехнологии МСХА), а также аспирантам и сотрудникам кафедр биотехнологии и микробиологии за помощь и ценные консультации при выполнении работы.
Некультивируемые формы бактерий
Конец 19-го и первая половина 20-го столетия характеризовались бурным развитием почвенной микробиологии. В результате исследований С.Н. Виноградского, М. Бейеринка и других ученых, сложились, казалось бы, достаточно четкие и детальные представления о систематическом составе и функциональных особенностях почвенных бактериальных сообществ. Однако, появились данные, свидетельствующие о том, число почвенных бактерий, определяемых генетическими методами, в десятки и даже сотни раз выше числа коллекционных изолятов из тех же проб (Torsvik et al., 1996; 2002). Этот факт ученые объясняют "некультивируемостью" многих бактерий. Некультивируемость - это особое состояние бактериальных клеток, при котором они не способны расти на обычных питательных средах, что существенно осложняет изучение их экологии, особенно оценку динамики численности популяции, традиционными микробиологическими методами. Большинство почвенных микроорганизмов не растет на искусственных питательных средах. П.Г. Турова (1978) считает это следствием нарушения взаимосвязей между микроорганизмами при культивировании на искусственных средах. Часть микроорганизмов, обитающих в природе имеет настолько сложные потребности в питательных веществах, что они не удовлетворяются известными лабораторными средами, другая часть не высевается на среды по противоположной причине - они должны быть адаптированы к неблагоприятным природным условиям, соответствующим их жизнедеятельности, например как облигатные олиготрофы. Причем для высева этих клеток требуется определенная процедура "пробуждения" (Головлев, 1998).
Концепция некультивируемого состояния (НС) бактерий появилась в 1980-х гг. Широко используется термин "viable but non-culturable state". В наше время НС описано у бактерий кишечной группы и вибрионов, псевдомонад, легионелл, микрококков и молочнокислых бактерий. Эти формы обнаруживаются в пресных и морских водах, осадках, почве, в организме животных и растениях (Головлев, 1998). Применяя молекулярно-биологические методы в исследованиях степени разнообразия и широты распространения в окружающей среде микроорганизмов, нередко в загрязненной водопроводной системе обнаруживали только некультивируемые бактерии (Dojka et al., 2000). Для выявления некультивируемых форм бактерий (НФ) в объектах окружающей среды используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Емельяненко и др., 1994а; 19946; Аксенов и др., 1994а), который позволяет идентифицировать патоген без высева на питательные среды.
Известно, что патогенные бактерии способны существовать не только в организме хозяина, но и в объектах внешней среды, а именно в почве, воде, на растениях. Многие патогенные бактерии, имеющие в жизненном цикле длительную сапротрофную фазу существования, способны к переходу в некультивируемое состояние. Различные условия существования бактерий, особенно патогенных, требуют координированной экспрессии генов, обеспечивающих жизнеспособность клетки. У сальмонелл и кишечной палочки выявлены гены, участвующие в процессе перехода в НС (Романова и др., 1996). Экспрессия генов происходит в процессе перехода и длительного пребывания клеток в НС. Индуктором гена, необходимого для инициации образования некультивируемой формы (НФ) у сальмонелл является витамин К. Вещества такого типа имеются в клетках высших растений, водорослях и животных. В последнее время обнаружена способность многих патогенных бактерий существовать в сообществах с различными простейшими — обитателями водных экосистем. Зеленые водоросли (продукты их метаболизма) значительно ускоряют образование НФ иерсиний и листерий (Пушкарева и др., 1998; Гинсбург, 1999).
Псевдотуберкулезный микроб (иерсиния) в почвах может существовать не только в вегетативной форме, но и в некультивируемой (покоящейся) форме, в том числе сохраняющий патогенный потенциал в 40% проб. В бактериальных популяциях листерий и иерсиний через 1-2 месяца покоящиеся формы превышают 90% (Емельяненко, 1997). По-видимому, это обеспечивает им возможность переживать неблагоприятные условия внешней среды в межэпизоотические и межэпидемиологические периоды. НФ - это новая описанная форма адаптивной изменчивости микроорганизмов в стрессовых ситуациях.
Клетки микроорганизмов, находящихся в НС обычно имеют значительно меньший размер и кокковидную форму (Пушкарева и др., 1997; Головлев, 1998; Госманов, 2000). Переход бактерии в состояние покоя, сопровождается резким снижением метаболической активности, высокой плотностью цитоплазмы, сохранением числа рибосом, снижением количества РНК, увеличением плотности суперспирализации ДНК и временной потерей способности к размножению (Гинсбург и др., 1999; Госманов, 2000). Наблюдается индукция синтеза белков, в норме не синтезируемых (Литвин и др., 2000). Р.Г. Госманов (2000) предполагает, что у неспорообразующих бактерий в НС цитоплазматическая мембрана выполняет функцию дополнительных защитных оболочек, свойственных спорам.
Факторы среды, индуцирующие НС, сильно варьируют у бактерий разных видов. Так, например, инициацией перехода в НС являются: резкое понижение температуры окружающей среды, ограничение содержания питательных веществ (один из главных факторов перехода), аэрация, концентрация солей (80-90% клеток кишечной палочки теряют культивируемость при помещении их в раствор с высоким содержанием солей), в некоторых случаях свет отрицательно влияет на переход в НС (Головлев, 1998; Гинсбург и др., 1999; Литвин и др., 2000; Госманов, 2000). Переход в НС приводит к множественным морфологическим, физиологическим, биохимическим изменениям в клетках.
Обратный переход (реверсия) покоящихся форм патогенных бактерий — возврат способности к размножению и росту на обычных средах - могут вызвать: простейшие - массовые обитатели почв и водоемов, а также фитогормон ауксин, выделяемый корневыми волосками растений (Пушкарева и др., 1997; Сучков и др., 1997). Для "пробуждения" некоторых вибрионов достаточно постепенного повышения температуры до оптимальной (Whitesides et al.,1997). В пикомолярных концентрациях белок, секретируемый в основном грамположительными клетками бактерий с высоким содержанием Г+Ц, является индуктором "оживления" и роста клеток (Kaprelyants et al., 2000).
Микоплазмоподобные организмы (МПО) и связь их с фитоплазмами
Они обнаружены почти во всех тканях насекомых, а также в их яйцах. Слюнные железы насекомых вырабатывают секрет, который содержит растворимые белки, полисахариды, гликопротеиды и другие вещества и является вполне пригодной питательной средой для микоплазм (Борхсениус и др., 2002). Микоплазмозы также могут передаваться через паразитическое растение -повилику. Многолетние растения являются накопителями инфекции, поскольку, в их корнях микоплазмы могут перезимовывать. От растения к растению микоплазмы могут передаваться с помощью прививок, хотя этот способ обычно приводит к потере способности переноситься насекомыми и утрате патогенных свойств возбудителя. В последние годы экспериментально подтверждена возможность проникновения микоплазмы - Acholeplasma laidlawii через корневую систему люцерны и гороха в условиях in vitro (Мидянник, 1995; Чернов и др., 1999). Этот факт позволяет предположить, что микоплазмы могут проникать из почвы через корни растений и в полевых условиях.
На территории России наибольшее распространение получили столбур пасленовых, особенно томата и картофеля и микоплазмоз люцерны (Самсонова, 2000). Впервые столбур был обнаружен в нашей стране 1949 г. Переносчиками инфекции являются цикадки: Hyalesthes obsoletus Sing., H. mlokosiewiezi Sing., которые зимуют в фазе личинки в почве. В конце сезона лёта имаго откладывают яйца в почву у корневищ вьюнка полевого и других многолетних сорняков, таких как бодяк полевой, бузина травянистая, гибелия лисохвостная, паслен сладкогорький и другие, которые могут служить резерваторами инфекции. Считается, что столбур томата вызывается фитоплазмами двух родов Acholeplasma и Spiroplasma, которые аккумулируются во флоэме и иногда в соседних с флоэмой паренхимных тканях растения (Власов и др., 1985; Самсонова и др., 2001). Столбур пасленовых распространен в европейских странах, Австралии и США (Богоутдинов,2001). Симптомы столбура картофеля проявляются в виде фиолетового ободка на листьях, пожелтения и скручивания молодых листьев, а картофельные клубни усыхают, и их поверхность становится морщинистой.
Симптомы фитоплазмозов картофеля различны. Круглолистность (карликовость) картофеля распространена в Среднем Поволжье, на Северном Кавказе, Украине. Возбудитель передается клубнями, насекомые переносчики не установлены. В условиях эксперимента фитоплазма передается прививкой и растением-паразитом повиликой.
"Ведьмины метлы" картофеля (Potato witches broom (PWB)) проявляются в карликовости растения с многочисленными тонкими стеблями, на которых образуются мелкие пожелтевшие листья. Заболевание распространено в Среднем и Нижнем Поволжье, Воронежской, Московской, Самарской областях, Башкирии, Татарстане, на Северном Кавказе, в Северной и Южной Америке, Азии и некоторых странах Европы. Возбудитель передается клубнями. Переносчики в России не установлены, кроме Самарской области - цикадка Oliarus leporinus (Богоутдинов,2001). В Японии "ведьмины метлы" распространяются с помощью цикадки Ophiola flavopicta, в Европе - цикадкой Scleroracus dasidus, в Северной Америке -S.dasidus, S.balli (Богоутдинов, 2000; 2001; Самсонова и др., 2001). Еще одно фитоплазменное заболевание, распространенное в РФ, особенно в Ленинградской области, Приморском крае - пурпурное закручивание листьев картофеля (Purple top-roll of potato) проявляется в пурпурном окрашивании и гофрированности верхних листьев. Заболевание также распространено во Франции, Чехии, Словакии, Индии, Японии. Передается насекомыми-переносчиками и клубнями. Симптомы проявляются при умеренной температуре и маскируются при высокой (Богоутдинов,2001).
"Ведьмины метлы" люцерны распространены в Саратовской и Волгоградской областях, южных странах СНГ и охватывают всё новые территории. Насекомое-переносчик: псиллида (листоблошка) Cyamophila medicaginis Andr. Филлодия клевера, земляники, хризантемы, петунии, одуванчика, флокса проявляется в вырождении цветков, которые становятся похожи на листья. Распространено заболевание в Нечерноземной зоне, передается цикадками (Власов и др., 1985; Самсонова, 2000). Желтуха барвинка описана в естественных условиях, причем больные растения обнаруживались по соседству с очагами столбура на картофеле и баклажанах (Власов и др., 1985).
Круглолистность и "ведьмины метлы" картофеля, столбур пасленовых, желтуха барвинка, филлодия клевера, курчавая мелколистность шелковицы -болезни, вызываемые фитоплазмами сем. Acholeplasmataceae. Микоплазменная природа этих болезней доказана с использованием микробиологического, индикаторного, иммунологического методов и метода электронной микроскопии (Власов и др., 1985; Власов, 1994).
Распространение курчавой мелколистности шелковицы в Грузии происходит с помощью цикадки Hishimonus sellatus (Гиоргидзе, 2003). В Италии на косточковых (абрикос) в полевых условиях наблюдали хлоротичное скручивание листьев при фитоплазмозе (европейская желтуха косточковых) (Del Serone et al., 1998). С помощью флюоресцентного микроскопа, ПЦР и путем прививки растений-индикаторов доказали персистентность возбудителя европейской желтухи косточковых в корневой системе растений p. Prunus в течение периода покоя (Seemuller et al., 1998а). Карликовость малины и других видов p. Rubus (большинство видов и сортов ежевики) вызывает фитоплазма, которая сохраняется в период покоя - зимой в корнях растения и может распространяться при контакте или срастании корней больных и здоровых растений (Приходько, 1999). В Великобритании карликовость малины вызывают две фитоплазмы (Davies, 2000). Болезнь передается с помощью цикадок, которые откладывают на зиму яйца в неодревесневпгую кору формирующихся растений (Дементьева, 1987).
Проведение лабораторных опытов
Иммуноферментный анализ (ИФА). Анализ основан на связывании специфических иммуноглобулинов, выделенных из антимикоплазменной сыворотки кролика, с антигенами микоплазм. Затем наносят конъюгат (специфические иммуноглобулины), меченный пероксидазой хрена, который приводит к образованию "сэндвича" антитело-антиген-конъюгат. Результат проявляется в окрашивании и считывается на спектрофотометре (ридере). Достоинства метода: высокая чувствительность (0,001-0,0001 мкг/мл (по белку)), экспресс-метод. Недостатки — возможна неспецифичность результатов.
Реакции непрямой и прямой иммунофлюоресценции (ИФ). В этих реакциях используют специфическую иммунную сыворотку кролика. В качестве флюоресцентной метки используют ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат). Просматривают результаты под люминесцентным микроскопом в падающем свете с иммерсией. Положительная реакция проявляется в виде интенсивного изумрудно-зеленого свечения микоплазм. Данный метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет количественно оценить возбудителя, экспресс-метод (1,5-2 ч). Недостатком является некоторый субъективизм в оценке результатов.
Антитела к микоплазмам выявляют с помощью различных реакций: ингибиции роста, ингибиции метаболизма, микоплазмацидного теста, ИФА (ELISA - Enzime-linked immunosorbent assay) (Whitcomb et al., 1989; Раковская, 1999).
ДНК-ДНК гибридизационные методы. Методом ДНК-ДНК гибридизации с помощью ДНК-зондов диагностируются микоплазменные инфекции растений. Возбудитель определяется по гибридизуемости ДНК больных микоплазменных растений с меченой ДНК микоплазм или рекомбинантными плазмидами, содержащими ДНК микоплазм. Анализ проводят на нитроцеллюлозных фильтрах. Результат считывается с помощью рентгеновской пленки.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод широко используют в медицине для диагностики инфекционных заболеваний, патогенов в пище, а также для индикации микроорганизмов в образцах окружающей среды, в археологии для исследования фрагментов ДНК ископаемых животных и растений, а также в молекулярной биологии и генетике, например, при исследовании генома человека. Главные преимущества ПЦР: 1 высокая чувствительность (метод позволяет обнаружить единственную бактерию в пробе, точнее единственную копию ее ДНК), 2- специфичность и 3- быстрота получения результата. Недостатки метода: необходимость иметь специальное оборудование и контаминация проб ампликонами при несоблюдении правил проведения анализа.
Чувствительность метода ПЦР теоретически составляет 1-10 клеток в пробе при исследовании почек и головного мозга и 100-1000 клеток — печени (Самсонова и др., 19946); 10-30 геномов бактерий в 1 мл образца при обнаружении микоплазмозов человека и животных (Панин и др., 1999).
ПЦР-метод, основанный на синтезе специфического для данного микроорганизма фрагмента ДНК представлен на рис.5. Метод состоит из трех этапов: на первом этапе выделяется тотальная ДНК из биоматериала в раствор и очищается от ингибиторов реакции. На втором этапе с помощью праймеров, фермента Taq-полимеразы и dNTP амплифицируется специфический фрагмент ДНК в течение 30-40 циклов. Каждый цикл включает денатурацию ДНК, отжиг (присоединение) праймеров на специфический фрагмент ДНК и синтез ДНК-фрагмента. И последним этапом является регистрация и анализ результатов ПЦР, т. е. просмотр продукта амплификации после электрофореза в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Под УФ лучами ДНК светится. Наличие фрагмента ДНК с определенной длиной считывается как положительный результат.
Ампликон выявляют также путем гибридизации продукта амплификации с биотилированным или меченным радиоактивным изотопом олигонуклеотидом, комплементарным последовательности ДНК, расположенной внутри амплифицируемого фрагмента. Гибридизацию проводят на фильтрах или микропланшетах. Последнее дает возможность количественно оценить результаты ПЦР. Также в последнее время появилось оборудование, с помощью которого можно делать ПЦР, наблюдая за прохождением реакции в реальном времени, причем компьютерная программа выводит график увеличения количества ампликонов и это дает возможность оценивать количественно инфекционный фон в образце (Раковская,1999). Некультивируемые фитоплазмы диагностируют и классифицируют в филогенетические группы с помощью праймеров, последовательность которых подбирают из спейсерного региона между 16S-23S генами (Smart et al.,1996). 1.6.4. Методы микроскопирования
С помощью метода ультратонких срезов этиологию заболевания растения устанавливают на основании выявления полиморфных микоплазменных телец среди клеточных органелл.
Метод электронного микроскопирования трудоемок и состоит из нескольких этапов: фиксация ткани глутаральдегидом и четырехокисью осмия, обезвоживание спиртом и ацетоном, пропитывание и заливка в эпоксидные смолы. Исследуемую ткань, залитую в смолу, разрезают на ультрамикротоме, окрашивают и просматривают в электронный микроскоп (Уикли,1975).
Помимо электронной микроскопии для исследований микоплазм используют темнопольную и фазово-контрастную микроскопию. Гистохимический и иммунофлюоресцентный методы проводят с помощью флюоресцентного микроскопа, непосредственно просматривая ткани растений и насекомых. Морфологию чистой культуры микоплазм и их колонии можно изучать с помощью сканирующего микроскопа (Whitcomb et al., 1989).
Разработка эффективных селективных методов для выделения Acholeplasma laidlawii из почвы
Для изучения поведения интродуцированной в почву популяции микроорганизмов применяют два метода. Первый - предполагает использование генетически маркированной популяции, которую можно узнать среди многочисленных и разнообразных почвенных микроорганизмов. Наиболее распространено получение антибиотикоустойчивых штаммов. Второй метод — иммунофлюоресцентный - более сложен в исполнении и предполагает иммунизацию испытуемой культурой кроликов, получение иммунной сыворотки, которой обрабатывают почвенный мазок. По специфичному свечению среди множества почвенных микроорганизмов отличают клетки интродуцированного микроорганизма (Зенова и др., 2002). Для достижения поставленной цели - изучения поведения фитопатогенной микоплазмы в почве мы воспользовались первым методом. Необходимо было интродуцировать штамм A. laidlawii в почву, и выделять его обратно на питательную среду. Для получения антибиотикоустойчивых штаммов A. laidlawii использовали метод "приучения" исходной культуры к возрастающей концентрации антибиотиков путем постепенного отбора резистентных форм. Были получены антибиотикоустойчивые штаммы А. laidlawii к стрептомицину и рифампицину. Стрептомицин — антибиотик активный по отношению к большинству грамотрицательных и некоторым представителям грамположительных бактерий, биологическое действие его проявляется также в отношении кислотоустойчивых бактерий. Механизм действия стрептомицина заключается в ингибировании синтеза белка. К стрептомицину легко появляется устойчивость, возникают резистентные формы бактерий. Используемая в опытах доза антибиотика составляла 1,4 мг/мл (Звягинцев, 1987). Максимальную антимикробную активность стрептомицин проявляет при оптимальном значении рН 7,5-8,0. Рифампицин - антибиотик, который проявляет антибиотическую активность по отношению к грамположительным бактериям, приобретшим устойчивость к другим антибиотикам. Основа механизма биологического действия рифампицина - подавление бактериальной РЬЖ-полимеразы. Максимальная концентрация антибиотика в среде 0,5 мг/мл. Концентрацию рифампицина выбирали на основании данных Н.С. Егорова (1994). Максимальная антимикробная активность рифампицина проявляется при рН 5,5-8,0. В процессе культивирования антибиотикоустойчивых штаммов A. laidlawii на среде с антибиотиками мы отказались от рифампицина, так как он окрашивал среду в темно-бордовый цвет, что затрудняло просмотр колоний микоплазм. Стрептомицин не изменял цвета среды, поэтому для высева микоплазм из почвы мы использовали питательную среду с добавлением только стрептомицина. Идентичность полученного стрептомицинустойчивого штамма A. laidlawii исходному штамму подтверждена с помощью иммунофлюоресцентного (ИФ) и ПЦР анализов. Для изучения динамики численности интродуцированной популяции A. laidlawii в почве с помощью посева необходимо было подобрать питательную среду. Микоплазмы -труднокультивируемые микроорганизмы, требовательные к компонентам питательной среды (Раковская, 1999; Борхсениус и др., 2002). В значительной степени это связано с тем, что у микоплазм ограничены биосинтетические способности. В связи с этим для культивирования микоплазм используют среды весьма сложного состава. Большинство видов микоплазм нуждаются в фосфолипидах, гликолипидах и фосфогликолипидах, источником которых служит сыворотка крови животных. Для синтеза макромолекул в питательных средах должны содержаться их предшественники. Вытяжка из говяжьего сердца и мозга, пептон, дрожжевой экстракт могут обеспечивать их потребности в этом. Микоплазмы не способны синтезировать пурины и пиримидины и поэтому их получают в готовом виде из ДНК, НАД или ДПН (дифосфопиридиннуклеотид) с помощью ферментов (Раковская, 1999). Из всех микоплазм только ахолеплазмы способны синтезировать насыщенные жирные кислоты. Бессывороточные среды вполне определенного состава предложены пока только для двух микоплазм - Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma mycoides. Все остальные выращивают на средах, содержащих сыворотку крови (лошадей, КРС или кроликов). Среди универсальных сред наиболее эффективны и популярны среда Д. Эдварда и её модификации (Борхсениус и др., 2002) и модифицированная среда Хайфлика (Раковская, 1999). В качестве дополнительного источника энергии для ферментирующих микоплазм в среду добавляют 1% глюкозы. Виды, ферментирующие глюкозу, в том числе A. laidlawii, лучше растут при более высоких значениях рН 8,0-8,5. Период выживания A. laidlawii в среде с рН 7,5 составляет более 168 дней, однако в той же среде при рН 6,5 он сокращается до 98 дней (Nagatomo et al.,2001).
Для выращивания чистой культуры A. laidlawii первоначально использовали среду на основе гидролизата бычьего сердца (ГБС) рН 6,5 (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН), которая используется для культивирования патогенных видов микоплазм. Для стимуляции роста микоплазм рекомендуют добавлять в среду 5-10% лошадиной сыворотки. А. laidlawii культивировали на среде ГБС с добавлением сыворотки и без неё, так как ахолеплазмы хорошо размножаются и на бессывороточной среде (Борхсениус и др., 2002). Рост культуры в полужидкой среде с добавлением сыворотки заметно интенсивней, чем без этого компонента: характерное разрастание A. laidlawii в виде "облака" наблюдали на 5 сутки по всему столбику среды. В среде без сыворотки рост культуры более ограничен.
Для визуальной оценки роста A. laidlawii испытывали среду ГБС разной плотности - с содержанием 0,4; 0,6; 0,8 и 2% агара. В полужидких средах с разным содержанием агара наблюдали отличающиеся по плотности и величине колонии (0,5...1,5 мм). В среде с 0,4% агара на 3 сутки культивирования отмечали рыхлые полупрозрачные с не четко очерченным краем колонии.
