Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Роль метициллинрезистентных/ оксациллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) в
инфекционной патологии человека 18
Глава 1. Микробиологическая характеристика 17
Таксономическое положение и биологические особенности 17
Факторы патогенности 20
Структурная организация генома 24
Хромосомное « ядро» и мобильный генетический пул микробной клетки 24
Феномен «гетерорезистентности» стафилококковой популяции по устойчивости к метициллину и его генетический контроль 36
1.4. Лабораторные методы идентификации и типирования 39
Детекция MRSA 39
Внутривидовая дифференциация S. aureus 40
Глава 2. Классификация и номенклатура стафилококковых
заболеваний человека 46
Глава 3. Особенности эпидемиологии заболеваний, вызванных
MRSA 52
Общая характеристика эпидемического процесса стафилококковой инфекции 52
Распространенность и клинико-эпидемиологические особенности госпитальных инфекций, вызванных MRSA 59
Клональность госпитальных MRSA 64
Внегоспитальная заболеваемость, вызванная MRSA 68
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 74
Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 74
Бактериальные штаммы 74
Среды, антибиотики, реактивы 76
Методы изучения фенотипических свойств клинических изолятовМБ^А 77
Анализ экспрессии белков 77
Определение чувствительности к антибиотикам 78
Определение чувствительности к бактериофагам 79
Разработка методологии анализа генома MRSA и выбор молекулярных маркеров 80
Методы работы с нуклеиновыми кислотами 87
Разработка методики выделения ДНК из стафилококка, предназначенной для постановки ПЦР 87
Амплификация геномной ДНК 88
Электрофорез и визуализация продуктов амплификации и рестрикции 89
4.6. Оптимизация условий и программ ПЦР для исследования
генов и генных комплексов S.aureus 89
4.6.1. Амплификация гена, кодирующего синтез
коагулазы 90
4.6.2. Амплификация генов и генных комплексов, входящих в
состав стафилококковых хромосомных кассет тес 91
4.6.3. Разработка мультиплексной ПЦР для детекции генов,
детерминирующих синтез энтеротоксинов А, В и С, и детекция
гена, детерминирующего синтез токсина синдрома токсического
шока 93
4.7. Разработка условий рестрикции гена, детерминирующего
синтез коагулазы 95
Определение нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав хромосомного «ядра» 95
Эпидемиологический метод 97
Статистические методы 97
Глава 5. ЗНАЧЕНИЕ MRSA КАК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В
СТАЦИОНАРАХ РФ 98
Идентификация изолятов S. aureus, устойчивых к оксациллину 98
Фенотипические свойства клинических изолятов MRSA 102
Роль MRSA в возникновении различных форм внутрибольничной инфекции 110
Глава 6. ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ КЛИНИЧЕСКИХ
ИЗОЛЯТОВ MRSA 114
Детекция гена тесА 114
Структурный полиморфизм генов, входящих в состав хромосомного «ядра» 115
Вариабельность гена, кодирующего синтез коагулазы 115
Вариабельность гена, кодирующего синтез протеина А 127
6.3 Идентификация генов и генных комплексов в составе
мобильного генетического пула микробной клетки 132
6.3.1. Структурный полиморфизм тес ДНК - генетической
области, детерминирующей устойчивость к оксациллину 132
6.3.2. Детекция генов, кодирующих синтез пирогенных
токсинов суперантигенов 139
Глава 7. КЛОНАЛЬНОСТЬ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ
MRSA, ВЫЯВЛЕННАЯ МЕТОДАМИ
МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ 148
Идентификация и характеристика эпидемических штаммов, выявленных среди клинических изолятов, выделенных в 1998-2002 г. г 148
Анализ клинических изолятов, выделенных в
1986-1990 г. г 153
ГЛАВА 8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗРАБОТАННОГО
МУЛЬТИЛОКУСНОГО АНАЛИЗА ГЕНОМА MRSA
В СИСТЕМЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО
НАДЗОРА 154
Молекулярно-генетическая модель формирования идентифицированных эпидемических штаммов MRSA и гипотеза их появления в стационарах РФ 154
Молекулярно-генетический мониторинг MRSA 161
8.2.1. Ретроспективный анализ вспышек внутрибольничной
инфекции, вызванной MRSA, в стационарах различного
профиля 164
8.2.2. Идентификация госпитального эпидемического штамма
MRSA у больных при поступлении в стационар 174
ГЛАВА 9. ОБСУЖДЕНИЕ 177
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 195
ВЫВОДЫ 199
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 201
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВБИ внутрибольничные инфекции
НИ нозокомиальные инфекции
МГЭ мобильные (мигрирующие) генетические элемент(ы)
ПЦР полимеразная цепная реакция
BIS Международная коллекция бактериофагов для типирования
S. aureus
СС клональный комплекс
соа ген, кодирующий синтез коагулазы
ссг ген, кодирующий синтез рекомбиназы, относящейся к семейству
инвертаз-резолваз, обеспечивающей мобильность SCCmec
EMRSA эпидемический метициллинрезистентный штамм S. aureus
тесА ген, кодирующий синтез пенициллин-связывающего протеина
РВР-2',детерминирующего устойчивость к Р-лактамным
антибиотикам
тес ДНК сегмент ДНК, несущий ген тесА
MLEE мультилокусный энзим-электрофорез
MLST мультилокусное секвенирование
MSSA метициллинчувствительный S. aureus
MRSA метициллинрезистентный S. aureus
PFGE электрофорез в пульсирующем поле
PMN сегментоядерный нейтрофил(ы)
PTSAgs пирогенные токсины суперантигены
PS штамм для размножения бактериофага из коллекции
Международного набора
SEA стафилококковый энтеротоксин типа А
SEB стафилококковый энтеротоксин типа В
SEC стафилококковый энтеротоксин типа С
sea ген, кодирующий синтез энтеротоксина А
seb ген, кодирующий синтез энтеротоксина В
sec ген, кодирующий синтез энтеротоксина С
spa ген, кодирующий синтез протеина А
SCCmec стафилококковая хромосомная кассета тес — мобильный
генетический элемент, несущий ген тесА
SSR короткий нуклеотидный повтор
ST сиквенс-тип
TNF-a фактор некроза опухолей a
TSST-1 токсин синдрома токсического шока
tst ген, кодирующий синтез токсина синдрома токсического шока
VNTRs вариабельное число тандемных повторов
Введение к работе
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в конце 20-го века в борьбе с инфекционными заболеваниями человека, внутрибольничные инфекции (ВБИ) остаются одной из острейших проблем современной медицины, которая приобретает все большую экономическую и социальную значимость. Рост заболеваемости ВБИ связан со значительным ростом числа госпитальных штаммов микроорганизмов, обладающих устойчивостью к широкому кругу антимикробных препаратов, увеличением частоты инвазивных лечебных процедур и методов диагностики, качественными изменениями структуры популяции пациентов. В развитых странах ВБИ развиваются у 5-10% пациентов, находящихся в стационаре. В Российской Федерации регистрируется около 30.000 тыс. случаев внутрибольничной инфекции, при этом минимальный экономический ущерб составляет более 5 млрд рублей ежегодно в ценах 1998 г., однако по расчетным данным эти цифры во много раз выше [Венцел В.Л., 1990; Прозоровский СВ., Генчиков Л.А., 1994; Покровский В.И. и др. 2000; Козлов Р.С. 2000; Онищенко Г.Г., 2004]. Согласно результатам выборочных исследований ВБИ переносят 10-15% новорожденных, 16% (5%-27,8%) оперированных пациентов [Прозоровский СВ., Генчиков Л.А., 1994; М.Г. Аверьянов, В.Т. Соколовский, 1999; Е.В. Борисова и др., 1999; Семина Н.А., Ковалева Е.П., Акимкин В.Г., Сидоренко СВ., 2006].
Среди возбудителей ВБИ инфекций одно из ведущих мест во многих странах мира принадлежит микроорганизмам рода Staphylococcus, наиболее патогенным представителем которого является S. aureus. Эпидемиологическая обстановка осложняется в связи с широким распространением в стационарах, а также появлением и во внебольничной среде, клинических изолятов S.aureits, устойчивых к оксациллину (ORSA или MRSA), обладающих наряду с устойчивостью ко всем р-лактамным антибиотикам резистентностью ко многим другим классам антимикробных препаратов [Ayliffe G.A. 1997; Воусе J.M.,1997; Lowy F.D., 2003]. По данным зарубежных исследований MRSA вызывают
9 разнообразные формы внутрибольничной инфекции, включая, наиболее тяжелые, такие как: бактериемия, пневмония, синдром токсического шока, септический артрит, остеомиелит, которые требуют длительного и дорогостоящего лечения [Edmond М.В. et al., 1999; Dinges М.М., Orwin P.M. and Schlievert P.M., 2000; Engelmann J J. et al., 2003].
В результате изучения фенотипических свойств клинических изолятов MRSA, выделенных в разных стационарах в 80-х годах прошлого века, сформировалось представление о способности некоторых госпитальных штаммов MRSA к эпидемическому распространению [Marples R.R., and Е.М. Cooke, 1985; Kerr S., Kerr G.E., Makintosh C.A, and Marples R.R., 1990]. Внедрение на рубеже веков молекулярных методов типирования в эпидемиологические исследования явилось мощным инструментом идентификации, изучения механизмов формирования и эволюции эпидемически значимых штаммов микроорганизмов. На стыке микробиологии, молекулярной биологии и эпидемиологии возникло новое направление исследований - молекулярная эпидемиология инфекционных заболеваний, основными задачами которого являются изучение географического распространения различных генотипов патогенных микроорганизмов, их роли в формировании особенностей клинических форм заболеваний, т.е. углубленного изучения закономерностей возникновения, развития и угасания эпидемического процесса инфекционных болезней [Черкасский Б.Л., 2001].
Использование молекулярных методов типирования позволило нескольким группам зарубежных исследователей выявить циркуляцию MRSA, сходных по ряду молекулярно-генетических характеристик, не только в стационарах различных городов, но даже стран, расположенных на разных континентах. Такие MRSA в работах английских исследователей получили название эпидемических штаммов [Hookey J.V., Richardson J. F. and Cookson B. D., 1998]. В отличие от идентифицированных в Великобритании, схожие изоляты MRSA, выделенные в стационарах некоторых стран Латинской
10 Америки и на европейском континенте, в США и Японии, охарактеризованные американскими исследователями с использованием других молекулярных методов типирования, были названы эпидемическими клонами. Было показано, что рост частоты ВБИ, наблюдаемый в стационарах, в значительной степени обусловлен распространением эпидемических штаммов или клонов MRSA [Ayliffe, G.A., 1997; OliveiraD. et. al., 1998].
В последние два десятилетия достигнут существенный прогресс в
изучении молекулярных механизмов резистентности S. aureus к
антимикробным препаратам и структурной организации его генома.
Проведенные исследования позволили выявить у MRSA наличие
дополнительного белка (РВР-2'), относящегося к группе транспептидаз и
участвующего в формировании клеточной стенки. В отличие от других
подобных белков, обнаруженных у метициллинчувствительных штаммов
S.aureus (MSSA), РВР-2' продолжает функционировать в присутствии бета-
лактамных антибиотиков и сохраняет микробной клетке жизнеспособность
[HartmanB.L, Tomasz А. 1984; BeckW.D., Berger-Bachi В. and
KayserF.H., 1986]. Синтез этого белка кодируется геном тесА, расположенном на мигрирующем генетическом элементе, получившем название стафилококковая хромосомная кассета (SCCmec), который отсутствует у чувствительных микроорганизмов [Berger-Bachi В., Strassle A., Gustsfson J.E. and Kayser F.H., 1992; Katayama Y., Ito Т., and Hiramatsu K., 2000].
Расшифровка полных нуклеотидных последовательностей геномов нескольких метициллинрезистентных и метициллинчувствительных штаммов S. aureus выявила, что этот микроорганизм принадлежит к гетерогенным и полиморфным видам, у которого не только гены антибиотикорезистентности, но и многие гены патогенности присутствуют в хромосоме в составе геномных островов различных типов: островов «патогенности», стафилококковых хромосомных кассет (SCC), профагов. Было обнаружено, что в разных штаммах эти генетические элементы существуют в виде аллельных форм и
характеризуются различной степенью мобильности. Генетическое разнообразие внутри вида является следствием горизонтального переноса генов, расположенных на мобильных генетических элементах (МГЭ) [KurodaM. et al., 2001; BabaT. et al., 2002]. Стало очевидным, что многие из широко используемых методов молекулярно-генетического типирования не способны выявить наличие МГЭ в хромосоме MRSA, и лишь косвенно отражают различия в геноме тестируемых клинических изолятов.
С конца 90-х годов в Российской Федерации отмечался рост числа
публикаций, посвященных выделению MRSA в стационарах. В представленных
сообщениях информация ограничивалась только частотой выделения, и
отсутствовали какие-либо данные о свойствах идентифицированных как MRSA
клинических изолятов [Габбасова Л.А., Бурмистрова А.Л.,
Шафикова Н.Э., 2002; ДехничА.В. и др., 2002; Евстропов А.Д. и др., 2002]. Известно, что высокая частота MRSA среди клинических изолятов S.aureus делает неэффективным использование многих антимикробных препаратов и существенно ухудшает качество медицинской помощи, оказываемой населению. В этих условиях назрела неотложная необходимость совершенствования методов микробиологического мониторинга S.aureus, проводимого в отечественных стационарах.
Однако на момент начала нашей работы не существовало общепризнанных методов и схем молекулярно-генетического типирования MRSA, были не известны какие-либо генетические характеристики штаммов S.aureus, циркулирующих в стационарах РФ, отсутствовали представления о наличии возможных генетических связей между эпидемическими штаммами и клонами MRSA, выделенными в стационарах других стран мира и охарактеризованными с помощью разных молекулярных методов. Все это и определило направление исследований, представленных в данной работе, посвященной значимости проблемы метициллинрезистентного золотистого стафилококка (MRSA) для отечественного здравоохранения, исследованию
12 геномного полиморфизма клинических изолятов MRSA, идентификации и расшифровке механизмов появления в стационарах эпидемических штаммов. Основой для проведения этого исследования явилась схема молекулярно-генетического типирования MRSA, разработанная с учетом новых представлений о структурной организации генома золотистого стафилококка.
Цель и задачи исследования
Целью работы являлось исследование геномного полиморфизма как основы молекулярно-генетического мониторинга метициллинрезистентных Staphylococcus aureus в системе эпидемиологического надзора за возбудителями внутрибольничных инфекций.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
Создание коллекции клинических изолятов Staphylococcus aureus, выделенных в многопрофильных и специализированных стационарах нескольких регионов Российской Федерации от пациентов и медицинского персонала, а также из объектов окружающей среды, для анализа частоты распространения и определения значения метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) как возбудителей внутрибольничной инфекции.
Выявление детерминант антибиотикорезистентности и фагочувствительности и определение возможности их использования в качестве маркеров в эпидемиологических исследованиях для дифференциации MRSA.
Изучение структурного полиморфизма генов хромосомного «ядра» и набора генов, входящих в состав мобильного генетического пула микробной клетки, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность. Определение критериев дифференциации эпидемически значимых штаммов MRSA.
Разработка схемы молекулярно-генетического типирования, учитывающей особенности структурной организации генома метициллинрезистентных
13 S.aureus, и исследование генетических связей между клиническими изолятами MRSA, выделенными в разных стационарах. Идентификация эпидемически значимых штаммов, выявление их клональности.
Определение наличия (отсутствия) генетической общности между циркулирующими в стационарах России и эпидемическими метициллинрезистентными штаммами S.aureus, циркулирующими в других странах мира. Выявление возможных механизмов появления и генетической изменчивости эпидемических штаммов MRSA.
Определение возможности применения разработанной схемы молекулярно-генетического типирования MRSA при проведении локальных эпидемиологических расследований.
Научная новизна Разработана схема молекулярно-генетического типирования возбудителей инфекционных заболеваний - метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, основанная на изучение молекулярных маркеров двух типов: генов, входящих в состав хромосомного «ядра», и генов, являющихся структурными компонентами геномных островов различных типов. Разработанная схема позволяет:
дифференцировать эпидемические штаммы;
выявлять случаи заноса в стационары РФ эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих в других странах мира;
обнаруживать появление новых эпидемических штаммов, изучать механизмы их формирования;
прослеживать генетические связи между штаммами.
Впервые исследован полиморфизм генов, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность, входящих как в состав хромосомного «ядра», так и являющихся структурными компонентами мигрирующих генетических элементов нескольких классов, у
14 метициллинрезистентных изолятов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах нескольких регионов Российской Федерации.
Впервые показано, что в стационарах РФ циркулируют эпидемические значимые штаммы MRSA, способные вызывать разнообразные, в том числе и генерализованные, формы внутрибольничной гнойно-септической инфекции; получены приоритетные данные о структурных особенностях их геномов.
Выявлено генетическое родство идентифицированных эпидемических штаммов с международными эпидемическими штаммами и клонами MRSA, указывающее на то, что появление MRSA в России является результатом заноса из европейских стран. Получены приоритетные данные о распространении эпидемических штаммов MRSA в стационарах нескольких регионов РФ. Расширены представления об эпидемическом распространении MRSA на Евразийском континенте.
Установлено, что в процессе распространения международных эпидемических штаммов MRSA на отдельных территориях может происходить дальнейшая дивергенция эпидемических штаммов за счет изменения набора генов в составе мобильного генетического пула микробной клетки.
Идентифицированы новые представители геномных островов золотистого стафилококка семейства стафилококковых хромосомных кассет (SCC). Показано, что формирование новых кассет происходит в результате делеций и рекомбинаций, затрагивающих как отдельные фрагменты, так и целые генетические элементы SCC.
Идентифицирован новый эпидемический штамм MRSA, содержащий композитный генетический элемент SCCmec.
Установлено наличие связи между определенным генетическим «бэкграундом» и присутствием в бактериальной клетке генов патогенности, расположенных на мобильных генетических элементах.
15 Практическая значимость и внедрение
Разработана молекулярно-генетическая основа для создания национальной базы данных эпидемических метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus — возбудителей ВБИ.
Усовершенствована система эпидемиологического надзора (ЭН) за внутрибольничной инфекцией, вызванной множественно-устойчивыми к антибиотикам патогенами: научно обоснованы схема и необходимость проведения молекулярно-генетического мониторинга MRSA в стационарах РФ. Разработаны и внедрены в практику работы территориальных управлений Роспотребназора и региональных центров гигиены и эпидемиологии методические рекомендации «Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus - возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование», утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Л.П. Гульченко 23 июля 2006 г.
Предложена новая экономичная методика выделения ДНК из S.aureus, с использованием в качестве лизирующего агента гуанидина тиоционата вместо лизостафина, которая гарантирует стабильность полученной ДНК в течение нескольких лет и расширяет возможности для проведения генетических исследований S.aureus.
Создан музей клинических метициллинрезистентных и
метициллинчувствительных изолятов S. aureus, выделенных при различных формах ВБИ, а также банк ДНК эпидемических штаммов MRSA в лаборатории стафилококковых инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Полученные в проведенном исследовании результаты могут быть использованы в работе клинических микробиологических лабораторий лечебно-профилактических учреждений хирургического, акушерско-гинекологического, травматологического профиля, ожоговыми центрами, а
также специалистами, осуществляющими эпидемиологический надзор за внутрибольничными инфекциями.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на: VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2002 г.); V Международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 2002 г.); 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004 г.); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004 г.); VII Международной конференции MAKMAX/ESMID (Москва, 2005 г.); 16-Европейском конгрессе «Клиническая микробиология и инфекционные болезни» (Ницца, 2006 г.); VIII Международном конгрессе MAKMAX/ASM по антимикробной терапии (Москва, 2006 г.); VIII Российской конференции «Современные проблемы антимикробной терапии» (Москва, 2006 г.); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.).
Апробация диссертации состоялась на конференции отдела бактериальных инфекций совместно с отделами генетики и молекулярной биологии бактерий и эпидемиологии в ГУ НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи РАМН 14 мая 2007 г.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 227 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 232 источника (57 отечественных и 175 зарубежных). Работа иллюстрирована 30 рисунками и содержит 24 таблицы.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Роль метициллинрезистентных/оксациллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) в инфекционной патологии
человека Глава 1. Микробиологическая характеристика MRSA 1.1. Таксономическое положение и биологические особенности Стафилококки — грамположительные микроорганизмы сферической формы, диаметром 0,5-3,5 мкм, которые делятся в нескольких плоскостях, что приводит к формированию правильных или неправильных пакетов, напоминающих по форме виноградные грозди ("staphyle" - гроздь). Как пиогенные кокки, вызвавшие развитие гнойного абцесса у человека и формирующие неправильные кластеры, впервые описаны в 1880 г. шотландским хирургом Ogston А. и практически одновременно Луи Пастером [цит. по Baird-Parker А.С., 1972]. Несколько позднее, Rosenbach F.J. (1884) выделил стафилококки в чистой культуре. Он использовал предложенный Ogston А. термин в таксономическом смысле, описав род Staphylococcus [цит. по Дерябин Д.Г., 2000]. Однако таксономическое положение рода в течение длительного времени оставалось не определенным и многократно пересматривалось [для справки см. Акатов А.К., Зуева B.C., 1983; Дерябин Д.Г., 2000]. Согласно 9 изданию «Определителя бактерий Берджи» (1997) стафилококки были отнесены к группе грамположительных факультативно анаэробных кокков вместе с родами Aerococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc, Melissococcus, Pediococcus, Saccharococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus и Vagococcus. От других представителей этой группы стафилококков отличает совокупность свойств, включающая характерное взаиморасположение микробных клеток в культуре, способность к росту в температурном интервале от 6,5С до 45С, при рН среды в пределах 4,2-9,3, в присутствии повышенных концентраций NaCl (до 15%) и
18 40% желчи. Однако содержание гуанидина + цитозина в структуре ДНК Staphylococcus на уровне 30-39%, а также ряд других таксономических критериев, в том числе и параметры ДНК - ДНК-гибридизации и 16S рРНК сиквенса, свидетельствовали о филогенетической близости данного рода к родам Enterococcus, Bacillus, Listeria и Planococcus. Это привело к тому, что в последние годы таксономическое положение рода было вновь пересмотрено. Согласно современной классификации, основанной преимущественно на данных геносистематики, род Staphylococcus вместе с другими, менее известными, родами: Gamella, Macrococcus, Jeotgalicoccus и Salinococcus, образует семейство Staphylococcaceae, которое относят к порядку Bacillales, классу Bacilli, группе бактерий с плотной клеточной стенкой. Филогенетически наиболее близкими ему являются представители рода Bacillus из семейства Bacillaceae, а также представители семейства Listeriaceae, которые также отнесены к порядку Bacillales [Bergey's Manul, 2001; Todar's Online Textbook of Bacteriology, 2005].
Основной экологической нишей для стафилококков считаются кожные покровы и слизистые оболочки теплокровных животных и человека, однако они могут быть изолированы из пищевых продуктов и воздуха, значительно реже из пыли и воды. Стафилококки - неподвижные и не образующие спор бактерии. По типу питания они хемоорганотрофы, по типу дыхания -факультативные анаэробы. Выраженная метаболическая активность стафилококков позволяет им колонизовать, а в последующем и активно вегетировать в различных органах и тканях макроорганизма-хозяина. Некоторые виды могут формировать капсулу и биопленки, которые повышают устойчивость микроорганизмов к действию неблагоприятных факторов внешней среды, антибиотиков и дезинфектантов, а также механизмов иммунной защиты хозяина, обеспечивают им возможность колонизовать поверхность синтетических полимеров медицинского назначения, способствуют длительной персистенции микробов в условиях макроорганизма.
19 Клеточная стенка содержит два главных компонента: пептидогликан и связанные с ним тейхоевые кислоты. В отличие от других грамположительных факультативно анаэробных кокков стафилококки чувствительны к действию лизостафина - эндопептидазы, гидролизующей глицил-глициновые связи в межпептидных мостиках пептидогликана, но устойчивы к действию лизоцима [Baird-Parker А.С., 1974]. Устойчивость к лизоциму обусловлена О-ацетилированием iV-ацетилмурамовой кислоты в молекуле пептидогликана [BeraA. etal., 2005].
Род Staphylococcus насчитывает около 50 видов и подвидов [Bacterial Nomenclature Up-to-date, - 2006], большинство из которых являются комменсалами с различной хозяйской специфичностью. Наиболее патогенным среди них как для человека, так и для многих млекопитающих, является вид Staphylococcus aureus. Это объясняется способностью представителей данного вида экспрессировать большое количество потенциальных факторов патогенности, участвующих в колонизации и развитии инфекционного процесса [Kuroda М. et al., 2001]. Наиболее известной таксономически значимой характеристикой S.aureus является способность коагулировать плазму крови, которая обусловлена продукцией внеклеточно секретируемого протеина с молекулярной массой около 44 kDa. Взаимодействуя с протромбином, плазмокоагулаза активирует процесс превращения фибриногена в фибрин. Образовавшийся сгусток защищает микробные клетки от действия бактерицидных факторов макроорганизма и обеспечивает благоприятную среду для их размножения [Wilcox М.Н., Walker С, Winstanley N.G., Limb D.I., 1996].
Одной из важнейших биологических особенностей стафилококков является способность приобретать устойчивость к антимикробным препаратам [для обзора см. Lyon and Skurray, 1987; Lowy F.D., 2003]. Уже через несколько лет после начала широкого использования пенициллина в 40-х годах прошлого века появились сообщения о выделении пенициллинрезистентных изолятов S. aureus. Последующее введение в лечебную практику стрептомицина,
20 эритромицина, тетрациклина привело к появлению штаммов, устойчивых и к этим антибиотикам, и формированию к началу 60-х годов изолятов, резистентных одновременно к нескольким антимикробным препаратам. Устойчивый к действию стафилококковой Р-лактамазы, первый полусинтетический пенициллин - метициллин предназначался для лечения инфекций, вызванных пенициллинрезистентными штаммами. Однако менее чем через два года после его введения в лечебную практику появились первые сообщения о выделении метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка, сокращенно называемых MRSA от английского обозначения methicillin-resistant Staphylococcus aureus [Jevons M.P.,1961]. Их появление превратилось в серьезную проблему для специалистов к середине 70-х - началу 80-х годов прошлого века, когда стало очевидным, что, обладая всеми характерными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами, характерными для золотистого стафилококка, MRSA имеют свои особенности. Несмотря на то, что впоследствии метициллин был заменен менее токсичными антибиотиками этой группы, такими как оксациллин и диклоксациллин, термин MRSA прочно закрепился в научной литературе.
1.2. Факторы патогенности
S. aureus экспрессирует множество потенциальных факторов патогенности, большинство из которых являются видоспецифичными и участвуют в процессах адгезии, инвазии, защите от действия бактерицидных факторов макроорганизма. Почти все штаммы секретируют группу цитотоксинов и экзопротеинов, которая включает 4 гемолизина (альфа-, бета-, гамма-, дельта-), нуклеазы, протеазы, липазы, гиалуронидазы и коллагеназы. Основная функция этих ферментов состоит в превращении тканей хозяина в питательный субстрат, необходимый для размножения бактерии. Некоторые штаммы продуцируют один или несколько дополнительных экзопротеинов, которые детерминируют развитие тех или иных форм стафилококковой инфекции. К их
21 числу относятся токсин, детерминирующий развитие синдрома токсического шока (TSST-1), вызывающие развитие пищевых токсикоинфекции многочисленные стафилококковые энтеротоксины (SEA, SEB, SECn, SEE, SEG, SEH, SEI), эксфолиативные токсины ETA и ETB, обнаруживаемые у штаммов, выделенных от пациентов с некоторыми кожными заболеваниями, лейкоцидины [для обзора см. Dinges М. М., Orwin P.M. and Schlievert P.M, 2000]. Число вновь открываемых факторов патогенности постоянно растет [Kuroda М. et al., 2001; van Wamel W.J.B. et al., 2006]. Сложный и не до конца изученный патогенез стафилококковых инфекций рассматривают как результат согласованного взаимодействия многих клеточно-ассоциированных и секретируемых протеинов микроорганизма. Процесс выработки этих протеинов тщательно контролируется, как на уровне микробной клетки, так и всей микробной популяции, и следует определенной временной программе [для обзора см. Novick R.P., 2003; Yarwood J.M., Schlivert P. M., 2003].
В результате проведенных в последние годы исследований было установлено, что некоторые факторы патогенности S. aureus, не только самостоятельно могут вызывать развитие определенных заболеваний, но и существенно осложняют течение и патогенез многих других форм стафилококковой инфекции. К ним относят, прежде всего, вызывающие токсикоинфекции стафилококковые энтеротоксины и токсин синдрома токсического шока. Каждый из этих токсинов имеет несколько биологических эффектов, основным из которых является способность взаимодействовать с клетками иммунной системы макроорганизма-хозяина и подавлять иммунный ответ на S. aureus. Они также известны как пирогенные токсины суперантигены (PTSAgs). Суперантигены являются причиной или осложняют патогенез таких заболеваний, как токсический шок, сепсис, септические артриты, гломерулонефрит, и некоторых других [Dinges М. М., Orwin P.M., Schlievert P.M., 2000]. TSST-1 рассматривают как главную причину развития токсического шока во время менструации. Его уникальной чертой является
22 способность проникать через мукозные мембраны и вызывать фатальную токсинемию в отсутствии бактериемии [Hamad A.R., Marrack P., Kappler J.W., 1997]. Кроме того, продуцирующие TSST-1 штаммы S. aureus изолируют у 60% пациентов с синдромом Kawasaki - системным васкулитом, который рассматривают в качестве ведущей причины приобретенных заболеваний сердца у детей в США [Wann E.R; et al., 1999]. Описанный в последние годы неменструальный синдром токсического шока ассоциируют не только со штаммами-продуцентами TSST-1, но и со штаммами, секретирующими энтеротоксины A (SEA), В (SEB) и С (SEC). [Schlivert P.M., 1986; Campbell W. N. et al., 1997; Czachor J.S., Herchline Т.Е., 2001].
Участие PTSAgs в патогенезе стафилококковых инфекций носит плейотропный характер. Полагают, что, по крайней мере, три механизма лежат в основе способности PTSAgs вызывать гипотензию и гиповолемический шок,. которые предшествует развитию мультиорганной недостаточности и, по-видимому, служат основной причиной смерти при токсическом шоке. Этими механизмами являются: неспецифическая стимуляция клеток иммунной системы, повреждение клеток сосудистого эндотелия и повышение чувствительности к действию эндотоксинов [Kushnaryov V.M. et al., 1989; Uchiyama Т. et al., 1992; Miethke T. et al., 1993; Dinges M. M., Orwin P.M. and Schlievert P.M., 2000]. Неспецифически взаимодействуя с вариабельной областью Р-цепи рецепторов Т-клеток, PTSAgs активируют значительную популяцию (5%-30%) Т-лимфоцитов, что приводит к выбросу большого количества монокинов и лимфокинов, включая гамма-интерферон и фактор некроза опухолей а (TNF-а). Кроме того, они индуцируют Vp-специфическую экспансию CD4 и CD8 - позитивных субклонов Т- лимфоцитов. Индуцируемая PTSAgs гиперчувствительность к эндотоксинам является следствием прямого цитотоксического эффекта на гепатоциты и возникающего нарушения антитоксической функции печени. Накопление в крови циркулирующих эндотоксинов в свою очередь способствует высвобождению летальных
23 количеств монокинов, в особенности, TNF-a [Fujikawa Н. et al., 1986; Stone R.L. et al., 1987]. PTSAgs способны вызывать гипотензию не только за счет высвобождения вазоактивных медиаторов, но и в результате связывания с рецепторами на поверхности эндотелиальных клеток. Полагают, что молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса являются рецепторами на эндотелиальных клетках, которые взаимодействуют с стафилококковыми энтеротоксинами A (SEA) и В (SEB) [Kushnaryov V.M. et al., 1989; Uchiyama Т. et al.,1992]. PTSAgs могут вызывать капиллярную течь, непосредственно связываясь с эндотелиальными клетками, вызывая их гибель и образование брешей, и/или в результате индукции гиперчувствительности к действию эндотоксинов.
Еще одним важным механизмом участия некоторых PTSAgs, и в частности TSST-H и SEB, в патогенезе хирургического токсического шока является их способность подавлять местную воспалительную реакцию в области входных ворот инфекции. Этот эффект носит опосредованный характер и реализуется как за счет индукции TNF-a, подавляющего мобильность полинуклеаров (PMN), так и за счет супрессии синтеза стафилококковой липазы, обладающей хемоантрактантной активностью и вызывающей хемотаксис PMN в очаг воспаления. Отсутствие характерных гнойных проявлений в области хирургической раны, типичных для стафилококковой инфекции, существенно затрудняет своевременную диагностику и назначение адекватного лечения [Voitov N., Ross H.F., Novick R., 2003;NovickR.P.,2003].
Показано, что некоторые эпидемические госпитальные штаммы MRSA могут являться продуцентами TSST-1, стафилококковых энтеротоксинов А, В и С [Revised guidelines for the control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in hospitals, 1998].
24 1.3. Структурная организация генома MRS А
1.3.1. Хромосомное «ядро» и мобильный генетический пул бактериальной
клетки
Механизмы формирования резистентности к антимикробным препаратам у S.aureus можно классифицировать на две категории: мутации в расположенных на хромосоме бактериальных генах и приобретение генов резистентности от других микроорганизмов с помощью различных видов генетического обмена (трансдукции, конъюгации или трансформации). В случаях передачи резистентности экзогенные гены, детерминирующие устойчивость к антибиотикам, находят на мобильных генетических элементах: плазмидах, инсерционных последовательностях, транспозонах или геномных островах патогенных бактерий. Множество исследований посвящено изучению плазмид и транспозонов S.aureus, несущих гены антибиотикорезистентности [для обзора см. B.R. Lyon and R.Skuray, 1987; R.Novick, 1990; Projian, 2000.] Однако более полное представление о наличии и распределении в хромосоме S. aureus мобильных генетических элементов, кодирующих как его антибиотикорезистентность, так и патогенность, появилось только после полной расшифровки генома нескольких штаммов S. aureus.
В настоящее время полностью определена нуклеотидная последовательность геномов 7 штаммов S. aureus, среди них: 5 метициллинрезистентных штаммов (MRS А N315, MRS А 252, MW2, COL, в том числе и обладающий промежуточным уровнем резистентности к ванкомицину штамм VRSA Ми50), а также метициллинчувствительные штаммы MSSA 476 и NCTC 8325 [Kuroda М. et al, 2001; Baba Т. et al., 2002; Holden M.T.G. et al., 2004; Grill R.S. et al., 2005]. Известно, что штаммы NCTC 8325, MRSA252 и VRSAMu50 вызвали тяжелые инвазивные формы инфекции у госпитализированных пациентов, а штаммы MW2 и MSSA явились причиной септициемии у пациентов во внебольничной среде. Штамм MRSA252 принадлежит к эпидемическому клону EMRSA-16, который в последние 10 лет
25 распространился во многих лечебных учреждениях Великобритании и США. Его появление привело к значительному росту инфекций, обусловленных S.aureus, в стационарах этих стран [Griffiths С. et al., 2004]. Заболевания, вызванные штаммами MRSA252 , VRSA Ми50 и MW2 оказались фатальными. Некоторые дополнительные характеристики упомянутых штаммов представлены в таблице 1.
Результаты секвенирования показали, что геномы штаммов имеют низкое содержание G+C (32,8-32,9%). Хромосомы содержат 2565-2714 открытых рамок считывания, а их протяженность варьирует от 2799802 до 2902619 н.п. Сравнительный анализ выявил, что более 50% протеинов, кодируемых геномом S.aureus, проявляют наибольшее сходство с таковыми же, обнаруженными у микроорганизмов рода Bacillus (Bacillus subtilis и Bacillus halodurans). Эти протеины обеспечивают важные для вегетативной жизни бактерии функции, такие как репликация ДНК, синтез протеинов, метаболизм углеводов. Кодирующие их гены формируют основу или «ядро» (от английского "core") генома S. aureus. Было обнаружено, что большинство нуклеотидных различий, выявленных между секвенированными штаммами, являются результатом интеграции некоторых генетических областей, отличающихся как по содержанию G+C, так и по использованию кодонов. Это позволило заключить, что хромосома S. aureus составлена из двух типов ДНК: относительно стабильного генетического «бэкграунда» или «ядра», полученного от бактерии-предшественницы, тесно связанной с родом Bacillus и геномных островов, приобретенных от других бактерий в результате горизонтального переноса [Kuroda М. et al., 2001; Baba Т. et al., 2002].
Таблица 1 Некоторые микробиологические и молекулярно-генетические характеристики штаммов S. aureus, нуклеотидные последовательности
которых полностью определены
Примечание:
* MLST - мультилокусное секвенирование (multilocus sequence typing);
**ST250 является сингл-локусным вариантом ST8, т.е. отличается мутацией в
одном из семи housekeeping генов, используемых при мультилокусном
секвенировании;
***Рп - пенициллин, Оха - оксациллин, Em - эритромицин, СИ - клиндамицин,
Spm - спектиномицин, Cip - ципрофлоксацин, Gm - гентамицин,
Tbr -тобрамицин, Amk - амикацин, Tet - тетрациклин, Fus - фузидин,
Van - ванкомицин.
27 Все геномные острова, обнаруженные у S. aureus, можно разделить на две большие группы: это геномные острова, несущие, главным образом, гены антибиотикорезистентности, к их числу относят стафилококковые хромосомные кассеты (от английского staphylococcal chromosome cassette -SCC), и геномные острова, содержащие гены патогенности. Некоторые авторы к последней группе относят и интегрированные бактериофаги, которые также представляют пул мобильной ДІЖ микробной клетки и нередко несут гены патогенности [Baba Т. et al., 2002; Ito Т. et al., 2003].
Стафилококковые хромосомные кассеты
Генетической основой устойчивости штаммов S. aureus к р-лактамным
антибиотикам является ген тес А, кодирующий синтез
пенициллинсвязывающего протеина РВР-2' (penicillin-binding protein), отсутствующего у чувствительных микроорганизмов [Matsuhashi М. et al., 1986]. При подавлении fl-лактамным антибиотиком активности основных пенициллинсвязывающих белков, РВР-2' в силу своего более низкого сродства к препаратам данной группы, продолжает функционировать и сохраняет микробной клетке жизнеспособность. Ген тесК локализован в хромосоме S. aureus в специфической области, обнаруживаемой только у метициллинрезистентных штаммов стафилококка - тес ДНК, расположенной между геном nov, кодирующим ДНК-гиразу, и геном spa, кодирующим синтез протеина A [Beck W.D., Berger-Bachi В. and Kayser F.H., 1986; Song M.D. et al., 1987]. При секвенировании тес ДНК штамма N315 было обнаружено, что ген тесА находится на интегрированном в хромосому новом мобильном генетическом элементе, структурно отличающемся от транспозонов и бактериофагов, получившем название стафилококковая хромосомная кассета тес (SCCmec) [Ito Т., Katayama Y., and Hiramatsu К., 1999; Katayama Y., Ito Т., and Hiramatsu K., 2000]. Доказательства мобильности SCCmec основаны на экспериментах, в которых продемонстрированы точное вырезание и последующая интеграция кольцевой структуры в фиксированный сайт на
хромосоме вблизи точки начала репликации [Ito Т. et al., 2003]. Как мобильный генетический элемент SCCmec характеризуется присутствием концевых инвертированных и прямых повторов, набором сайт-специфических рекомбиназных генов (ссгА и ссгїї), а также генов комплекса тес. При дальнейшем изучении структуры тес ДНК у клинических изолятов MRSA выявлено существование нескольких аллотипов SCCmec, различающихся как размерами (от 21 до 67 т.п.н.), так и набором генов, составляющих кассеты [Ito Т. et al., 2001; Okuma К. et al., 2002]. (Рис.1).
TypeIVaSCOn
TjpelVbSCCmw Type IVc SCCmec
Type I SCCmec
10 kb
orfX
CZ072
IS-Ш A4S1272,
meet
Рис. 1. Структурные компоненты кассет различных типов [Ito Т. et al., 2003].
Условные обозначения:
сег - гены, кодирующие синтез рекомбиназ;
тес A, mecRl, тесі -гены комплекса тес;
рТ 181- плазмида, детерминирующая устойчивость к тетрациклину;
pUBHO - плазмида, детерминирующая устойчивость к канамицину, тобрамицину и блеомицину;
Тп554 - транспозон, кодирующий устойчивость к эритромицину и спектиномицину;
Тп4001 - транспозон, контролирующий устойчивость к гентамицину;
Ч? Тп554 - псевдотранспозон Тп554, детерминирующий устойчивость к ионам кадмия.
