Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1. Биологическая характеристика и лизоцимная активность различных видов стафилококков 11
2. Основные биологические свойства бактериального лизоцима, отличительные особенности бактериального лизоцима по сравнению с яичным, механизм его антимикробного действия и методы выделения 17
3^ Биологическая роль лизоцимного фактора у микроорганизмов и практическое использование лизоцима в медицине 21
4. Лизоцимная активность грамположительных микроорганизмов 27
5. Факторы межмикробного взаимодействия
стафилококков в бактериальном биоценозе 32
6. Генетические механизмы контроля факторов межмикробного взаимодействия 34
7. Клонирование генов литических ферментов грамположительных бактерий 36
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48
Глава П. Материалы и методы 51
1. Питательные среды и штаммы бактерий 51
2. Микробиологические методы 56
2.1. Качественный метод определения лизоцимной активности у клинических изолятов S. aureus, Lactobacillus fermentum, В. subtilis 56
2.2. Качественный метод определения лизостафиновой активности Staphylococcus simulans 58
2.3. Количественный метод определения лизоцимнои активности S. aureus, Lactobacillus fermentum, В.
subtilis 59
2.4. Определение антагонистической активности лактобацилл против условно-патогенных бактерий 60
3. Молекулярно-генетические методы 61
4. Методы статистического анализа 69
Глава III. Результаты собственных исследований 71
1. Коллекция клинических штаммов S. aureus и их общая характеристика .-. 71
2. Определение спектров лизоцимнои активности Staphylococcus aureus 118 и лизостафиновой активности Staphylococcus simulans RN3239 77
3. Выбор векторной системы и реципиента для клонирования гена лизоцима S. aureus 118 и гена лизостафина S. simulans RN3239 79
4. Проверка штаммов Bacillus subtilis AJ73 на лизоцимную и лизостафиновую активность, на устойчивость к лизоциму S. aureus 118 и лизостафину S. simulans RN3239 80
5. Клонирование гена, кодирующего лизоцим S. aureus 118
в клетках В. subtilis AJ73 82
6. Определение наличия вставки фрагмента чужеродной хромосомной ДНК S. aureus 118 в рекомбинантных плазмидах pLFi4Lyz+b pLFi4Lyz+2, pLFi4Lyz+3 методом ПЦР 89
7. Клонирование гена лизостафина S. simulans RN3239 в клетках Bacillus subtilis 94
8. Передача и наследование рекомбинантной плазмиды pLFKLyz+з в клетках В. subtilis, Е. coli, L. fermentum 97
9. Изучение антагонистической активности рекомбинантного штамма L. fermentum ЛВ 290 в отношении стафилококков 109
Ю.Выявление гена lyt А, контролирующего лизоцимную активность у клинических изолятов S. aureus с помощью
Пцр 111
Обсуждение результатов и заключение -. 115
Выводы 121
Список литературы 122
- Основные биологические свойства бактериального лизоцима, отличительные особенности бактериального лизоцима по сравнению с яичным, механизм его антимикробного действия и методы выделения
- Качественный метод определения лизоцимной активности у клинических изолятов S. aureus, Lactobacillus fermentum, В. subtilis
- Коллекция клинических штаммов S. aureus и их общая характеристика
- Изучение антагонистической активности рекомбинантного штамма L. fermentum ЛВ 290 в отношении стафилококков
Введение к работе
Стафилококки представляют собой большую гетерогенную группу грамположительных микроорганизмов. Они широко распространены в окружающей среде, и некоторые виды являются возбудителями ряда заболеваний человека и животных. В настоящее время все описанные виды стафилококков делятся на две основные группы - коагулазоположительные и коагулазоотрицательные. Самым же известным среди всех коагулазоположительных видов стафилококков является золотистый стафилококк- Staphylococcus aureus, который на протяжении всего XX века был одним из наиболее значимых оппортунистических патогенов в медицинской практике. Основной экологической нишей S. aureus являются апокриновые железы, расположенные в передних отделах носовых ходов человека, а также в подмышечных ямках и паховых складках, что связано с высокой степенью сродства данного вида микроорганизмов к расположенным там эпителиоцитам. Условием для освоения S. aureus данной экологической ниши является способность бактерий противостоять действующим в ней механизмам противоинфекционной резистентности организма хозяина (Дерябин Д.Г., 2000). S. aureus способен вызывать широкий спектр заболеваний - от «малых» кожных инфекций до тяжелых септических состояний с возможным летальным исходом (Grosserode, Wenzel, 1991, Бухарин О.В. и др., 2001).
Золотистый стафилококк характеризуется многообразием факторов патогенности, к которым относятся экзотоксины, факторы адгезии, инвазии и иммунорезистентности. Среди многочисленных экстрацеллюлярных продуктов стафилококков наибольший интерес представляет бактериолитический лизоцимподобньш фермент /ЛПФ/, относящийся к аутолитическим ферментам-гидролазам, и стафилококковый бактериоцин /лизостафин/. Эти два фермента
отличаются по механизму действия, спектру и структуре. Если лизоцим
стафилококков, представляющий р /1—4/ ацетилглюкозаминидазу,
j разрывает Р /1—4/ глюкозидные связи в полисахаридной составляющей
пептидогликана, входящего в состав клеточной стенки, то лизостафин, представляющий глицилглициновый комплекс, воздействует на белки клеточной стенки (Бухарин О.В., Васильев Н.В., Усвяцев В.Я., 1985).
Лизостафин могут синтезировать только стафилококки, а лизоцим является широко распространенным в природе белком, который способны синтезировать не только микроорганизмы, к которым относятся стафилококки, но и высшие организмы. Из всех известных лизоцимов в настоящее время в Латвии налажено промышленное производство только куриного лизоцима из белка куриных яиц. Основное отличие яичного лизоцима от лизоцима бактериального происхождения заключается в том, что несмотря на общий субстрат действия этих ферментов -пептидогликан (муреин) клеточной стенки бактерии - они расщепляют его на различные конечные продукты.
У бактериального лизоцима, по сравнению с яичным, выше степень и шире спектр логического действия. Куриный лизоцим не действует на грамположительные бактерии (в частности стафилококки) в отличие от лизоцима S. aureus, который разрушает клеточные стенки коагулазоотрицательных видов стафилококков (Акатов А.К., Зуева B.C., 1983). Кроме того, микробные лизоцимы в отличие от яичного взаимодействуют с другими группами гидролитических ферментов, что приводит к большему суммарному литическому эффекту (Афанасьева Т.И., Леоненко В.А., 1975). В настоящее время промышленное производство препаратов, содержащих стафилоккокковый лизоцим, лизирующий клеточные стенки грамотрицательных видов стафилококков, не разработано, хотя не вызывает сомнения, что во многих случаях
практическое применение микробных ферментов гораздо экономичнее, чем применение яичного лизоцима.
Известно, что резкое снижение уровня эндогенного лизоцима свидетельствует о серьезных дефектах систем регуляции гомеостаза, неблагоприятно отражается на морфогенезе и функционировании иммунной системы организма.
Многие условно-патогенные бактерии могут снижать концентрацию лизоцима за счет продукции антилизоцимного фактора (Бондаренко В.М., Романова Ю.М., Яблочков А.Я., 1988). Поэтому восполнение дефицита лизоцима является патогенетически вполне оправданным в лечении и профилактике многих заболеваний, в том числе дисбактериозов, тесно взаимосвязанных со вторичными иммунодефицитными состояниями, ослабляющими колонизационную резистентность открытых полостей организма хозяина (Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Г.В., 2003). Разработка нового препарата-пробиотика, в основе которого могут быть молочнокислые бактерии, продуцируюпще лизоцим, весьма перспективна и нова.
Что касается другого фермента стафилококкового происхождения — лизостафина, который разрушает как грамотрицательные виды стафилококков, так и грамположительные, то он необходим в генетических исследованиях стафилококков для получения протопластов этих микроорганизмов. Но в настоящее время не существует промышленного производства препаратов, содержащих этот фермент, и работа в данном направлении также является актуальной и перспективной. Особенно эффективным и экономичным было бы создание препарата, содержащего оба вышеуказанных фермента стафилококкового происхождения (лизоцим и лизостафин).
Одним из подходов к решению этой проблемы является клонирование гена, детерминирующего синтез стафилококкового
лизоцима, и передача его представителям нормальной микрофлоры
человека, например лактобациллам, и создание таким образом новых
J видов пробиотиков. В настоящее время существуют единичные работы по
клонированию гена стафилококкового лизоцима и лизостафина в клетках Е. coli, характеризующихся слабым уровнем экспрессии этих генов. Практически отсутствуют данные о клонировании и экспрессии генов стафилококкового лизоцима и лизостафина в других видах бактерий (сенной палочке, лактобациллах), поэтому данное направление в генетике стафилококков является актуальным и перспективным.
Цель работы - клонирование гена, кодирующего синтез лизоцима Staphylococcus aureus, и гена, кодирующего синтез лизостафина Staphylococcus simulans, и изучение экспрессии клонированных генов в гетерологичных хозяевах.
Задачи исследования
изучение коллекции штаммов Staphylococcus aureus с целью выявления штаммов с наибольшей лизоцимной и лизостафиновой активностями;
создание геномной библиотеки (банка генов) Staphylococcus aureus и Staphylococcus simulans при помощи вектора pLFi4 в клетках Bacillus subtilis AJ73;
3) отбор рекомбинантных клонов с лизоцимной и лизостафиновой
активностями на специально разработанных селективных средах,
выделение рекомбинантных плазмид, содержащих вставки стафикокковых
генов, кодирующих синтез лизоцима и лизостафина соответственно;
4) перенос гена лизоцима S. aureus, клонированного в клетках В. subtilis в составе вектора pLF]4, в клетки Lactobacillus fermentum методом
электропорации и создание потенциального штамма-продуцента
стафилококкового лизоцима;
5) разработка тест-системы на основе ПЦР для идентификации лизоцимактивных штаммов золотистого стафилококка среди клинических изолятов стафилококков.
Научная новизна
Впервые в качестве реципиента для клонирования генов стафилококкового лизоцима (ЛПФ) и лизостафина был использован протеазодефицитный мутант В. subtilis AJ73.
Показано, что гены, кодирующие синтез лизоцима и лизостафина стафилококков, стабильно наследуются в клетках В. subtilis AJ73 в составе вектора pLFh и экспрессируются. Уровень продукции лизоцима в клетках бацилл в 2,5 раза превышал такавой в исходном штамме S. aureus 118, тагда как уровень продукции лизостафина был сравним с уровнем продукции фермента у исходного родительского штамма S. simulans.
Показана экспрессия гена, кодирующего синтез лизоцима стафилококков в клетках штамма Lactobacillus plantarum 8R-A3, не обладающего собственной лизоцимной активностью. Продукция лизоцима в клетках других гибридных штаммов Lactobacillus fermentum 90Т-С4 и L. fermentum 81Т-В5, характеризующихся различным уровнем собственной лизоцимной активности, превышала исходный уровень продукции фермента.
Впервые были получены гибридные штаммы лактобацилл, несущие ген, кодирующий синтез стафилококкового лизоцима, которые наряду с повышенным уровнем лизоцимообразования, обладали повышенной антагонистической активностью по сравнению с родительскими штаммами, особенно в отношении клеток золотистого стафилококка и
Гибридные штаммы лактобацилл подавляли рост практически всех клинических изолятов S. aureus.
Практическая значимость работы
В настоящее время активно разрабатываются новые виды пробиотиков, включающие в себя генноинженерные штаммы сенной палочки, дрожжей, лактобацилл, кишечной палочки. Сконструированные нами штаммы лактобацилл и сенной палочки, обладающие повышенным уровнем лизоцимообразования и антагонистической активностью против условнопатогенных бактерий, могут быть рекомендованы в качестве потенциальных штаммов для создания высокоэффективных пробиотиков.
Сконструированы штаммы B.subtilis, стабильно наследующие ген, кодирующий синтез лизоцима и лизостафина стафилококков и характеризующиеся повышенным уровнем его продукции, которые могут быть использованы для промышленного получения фермента.
Разработана тест-система на основе ПНР для идентификации и выявления лизоцимактивных штаммов золотистого стафилококка среди клинических изолятов, выделенных от больных, а также из окружающей среды (смывы с медицинских инструментов, мебели, белья, медицинской одежды в поликлиниках, больницах и роддомах). По сравнению с более трудоемкими, требующими больших затрат времени и средств традиционными чашечными методами определения лизоцимной активности, разработанная ПЦР-тест-система значительно ускоряет и упрощает процедуру отбора лизоцимактивных штаммов стафилококков.
Основные биологические свойства бактериального лизоцима, отличительные особенности бактериального лизоцима по сравнению с яичным, механизм его антимикробного действия и методы выделения
Повышенный интерес к физиологически активным веществам микроорганизмов в последние годы во многом объясняется тем, что целый ряд теоретических вопросов биохимии решается ныне на модели микробных энзимов. Сейчас не вызывает сомнения, что во многих случаях практическое использование микробных ферментов весьма экономично. Литические ферменты микроорганизмов являются одним из самых мягких средств разрушения клеток, обладающих широким спектром действия (Богданова Л.Ф., 1976). Они также могут быть использованы в качестве лечебных препаратов, благодаря высокой эффективности и специфичности действия, как на другие микроорганизмы, так и на обмен веществ микроорганизмов (Имшенецкий А. А., 1978).
Лизоцим выгодно отличается от других химиотерапевтических препаратов, так как он характеризуется не только сильным бактерицидным и бактериолитическим действием, но также, вероятно, стимулирует механизм иммуногенеза, ускоряет процессы заживления и рассасывания патологического очага (Ермольева З.В., 1972; Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974).
Согласно определению Jolles (1968) к лизоцимам как микробного, так и животного происхождения, относятся такие вещества, которые имеют 6 основных признаков: 1) белковую природу, 2) низкий молекулярный вес -около 15000, 3) термолабильность в кислой среде (способность выдерживать нагревание до 100С в течение 1-2 минуты при рН 4,5), 4) термостабильность в щелочных растворах, 5) способность к лизису суспензии или клеточных стенок М. lysodeikticus, М. luteus, 6) способность разлагать пептидогликан грамположительных бактерий.
В настоящее время известно около 50 представителей данного класса. Важной вехой в изучении химии лизоцима послужила работа Salton (1952), показавшего, что субстратом действия этого фермента у М. lysodeikticus является мукополисахарид (пептидогликан) бактериальной стенки.
Одно из названий микробного лизоцима S. aureus по субстрату действия - эндо-Р-Ы-ацетилглюкозаминидаза. Лизоцимы - это ферменты, которые расщепляют Р-/1 4/, а также Р-Д-/1 2/-гликозидные связи (Pollock, Sharon, 1970). Как уже сообщалось выше, субстратом действия лизоцимов у бактерий является сополимер ї [-ацетилглюкозамин-М-ацетилмурамовая кислота, а также олигосахариды с такой же чередующейся структурой и даже полимеры, содержащие только N-ацетилглюкозамины (Munoz, 1972). Гексамер реагирует с ферментом в 3000 раз быстрее, чем мономер. Имеются данные о наличии у этого фермента и эстеразной активности.
Стафилококковый лизоцим, выделенный Леоненко В.А. (1974) из культуральной жидкости золотистого стафилококка, отличается по свойствам, как от яичного лизоцима, так и от других лизоцимов бактериального происхождения по конечным продуктам, на которые он расщепляет пептидогликан клеточной стенки. При этом, несмотря на то, что объектом действия как яичного лизоцима, так и стафилококкового лизоцима, является пептидогликан (муреин) клеточной стенки, но конечные продукты, на которые расщепляют муреин эти два фермента, при этом разные.
Стафилококковый лизоцим, в отличие от яичного лизоцима, содержал больше липидов (80% сухого вещества), отношение белка к липидам равнялось 1:4. Обезжиренный фермент по многим признакам был сходен с яичным лизоцимом: молекулярный вес был 53815, сходным оказался аминокислотный состав. Отмечены лишь небольшие различия в количественном содержании отдельных аминокислот (Леоненко В.А., 1974). Активность лизоцима в виде липопротеидного комплекса (в пересчете на белок) оказалась в 1,5 раза выше белка яичного лизоцима. Вместе с тем, после удаления из лизоцима липидного комплекса активность обезжиренного лизоцима оказывалась равной активности яичного лизоцима. Очевидно, что липидная часть стафилококкового лизоцима является его неотъемлемым компонентом "и способствует функции белка: создавая для последнего окружение, она сохраняет более выгодную его третичную структуру, а, возможно, и облегчает проникновение белка к клеточной стенке. Кроме того, липидная оболочка лизоцима может способствовать его концентрации на липидных структурах чувствительной бактериальной клетки.
Таким образом, в механизме действия бактериального и яичного лизоцима много сходного. Они оказывают на микроорганизмы многообразные и разносторонние действия (Pellegrini et al., 1976), которые классифицируют происходящие при этом явления следующим образом: 1) лизис, 2) бактериостаз, 3) бактерицидное действие, 4) морфологические и тинкториальные изменения, 5) влияние на клеточные компоненты и ферментные системы, 6) агглютинация, а также важно влияние мурамидазы как фактора генетической изменчивости.
В работах Strominger и Ghuysen (1967) приведена классификация, согласно которой микробные лизоцимы по типу расщепления связи между ацетилглюкозамином и ацетилмурамовой кислотой делятся на эндоацетилмурамидазы (при вызываемом ими гидролизе на конце расщепленного полимера остается N-ацетилмурамовая кислота) и эндоацетилглюкозаминидазы (при гидролизе на конце субстрата остается N-ацетилглюкозамин). Ферменты, обнаруженные у стафилококков, можно отнести к классу эндоацетилглюкозаминидаз. В отличие от яичного лизоцима, который по типу расщепления связи в пептидогликане является эндоацетилмурамидазой и расщепляет гликопептид микрококка на ди-, тетра- и более крупные пептиды, эндо-Р-М-ацетилглюкозаминидаза стафилококков расщепляет полигликан микрококка до дисахаридов (Леоненко В.А., 1974; Kiehmond, 1978).
Таким образом, микробные лизоцимы, по сравнению с яичным лизоцимом, характеризуются большей литической активностью: у них выше степень литического действия. Помимо эндо-Р-1-4-ацетилглюкозаминидазы у стафилококков обнаружены еще два литических фермента: N ацетилмурамилаланиномидаза, разрывающая связи между N-аланином и N-ацетилмурамовой кислотой, и эндопептидаза, разрывающая связь между двумя аминокислотами в пептидогликане (Бердзулишвили Э.М., 1973).
Таким образом, S. aureus имеет 3 вида литических ферментов (пептидогликановых гидролаз): эндо- P-l-4-ацетилглюкозаминидазу (ЛПФ), N-ацетилмурамилаланинолидазу и эндопептидазу, у которых, по сравнению с яичным лизоцимом, выше степень литического действия. Микробные лизоцимы часто взаимодействуют друг с другом и с другими гидролитическими ферментами, что приводит к большему суммарному литическому эффекту, хотя . для каждого фермента сохраняется специфически для него участок субстратного действия.
Качественный метод определения лизоцимной активности у клинических изолятов S. aureus, Lactobacillus fermentum, В. subtilis
В работе использовали три способа определения лизоцимной активности стафилококков: чашечный с убитой индикаторной культурой (Hawiger, 1968), чашечный с живой индикаторной культурой (Смолягина А.И., 1974) и метод отсроченного антагонизма в агаре (Muriana, IClaenhammer, 1987). При использовании чашечного метода с убитой индикаторной культурой суточную культуру М. lysodeikticus 2669 смывали 0,5% раствором и убивали в автоклаве при 1 атм. в течение 15 минут. Взвесь убитого нагреванием микрококка вносили в L-arap из расчета создания концентрации микрококка 108 клеток на 1 мл среды. После застывания агара чашки подсушивали в термостате при t=37C в течение двух часов. Затем на поверхность подсушенного агара с микрококком вносили каплями исследуемые культуры микроорганизмов по 20-25 капель на чашку. Результаты учитывали через 24-48 часов инкубации. Вокруг макроколоний выросших лизоцимактивных штаммов образовывались зоны лизиса клеток М. lysodeikticus, внесенного в агар.
Определение лизоцимной активности по Смолягину А.И. отличалось от предыдущего метода тем, что использовали живую культуру М. lysodeikticus.
При этом брали 0,2 мл 2-х миллиардной взвеси суточной агаровой культуры М. lysodeikticus и засевали на чашки Петри с 0,7% питательным агаром. На поверхность подсушенного агара с микрококком наносили в виде капель суточные бульонные культуры исследуемых штаммов (по 8-10 штаммов на чашку). Результаты опытов учитывали через 24 часа инкубации при t=37C по наличию зон лизиса микрококка вокруг макроколоний исследуемой культуры. Метод отсроченного антагонизма отличался от вышеуказанных методов тем, что использовали высушенный в ацетоне порошок М. lysodeikticus 2669. В этом методе бактерии испытуемых штаммов, предварительно выращенные на МПБ до 108, наносили на поверхность 1,5% мясо-пептонного агара каплями диаметром 4-5 мм и инкубировали при t=37C в течение 24 часов. Затем бактерии убивали в парах хлороформа, и на поверхности агара наслаивали в виде «газона» порошок микрококка, ресуспендированного в 4,5 мл 0,7% агара Зона лизиса порошка микрококка свидетельствовала о наличии у бактерий лизоцимной продукции.
Качественный метод определения активности методом лунок у Lactobacillus fermentum (Бухарин О.В., Борисов С.Д., 1982) состоял в следующем. Культуру L. fermentum выращивали на жидкой среде MRS-1 при t=37C и интенсивной аэрации в течение трех суток. Затем в 1% агаре «Difco» (США), разлитом по 10 мл в чашки Петри, стандартным стерильным пробойником вырезали лунки диаметром.3 мм, в которые вносили по 0,1 мл культуральной жидкости (супернатанта после центрифугирования культуры L. fermentum при 3000 об/мин). После 4-часовой диффузии при 37С, сверху наливали 4 мл 0,7% питательного агара (МПА), содержащего 0,5 мл взвеси М. lysodeikticus 2669 или М. luteus, убитых автоклавированием и доведенных по оптическому стандарту мутности до 10 единиц, или порошок М. lysodeikticus 2669, высушенного в ацетоне (20 мкг/мл). Убитый автоклавированием микрококк (100 единиц) или порошок высушенного в ацетоне микрококка (20 мкг/мл), также предварительно проавтоклавированный, разводили в 0,15М фосфатном буфере или бифталате калия (рН 6,5). Зоны лизиса индикаторного штамма микрококка на сплошном мутном газоне свидетельствовали о лизоцимной активности этого штамма. Порошок индикаторного штамма М. lysodeikticus предварительно проверяли на способность лизировать яичным лизоцимом. Для этого готовили микробную взвесь, содержащую 1 миллиард (109) микробных тел в 1 мл и разливали ее в две пробирки (опыт и контроль). В опытную пробирку добавляли 10 мкг яичного лизоцима (фирма «Sigma»), растворенного в 1 мл физиологического раствора. В контрольную пробирку добавляли равное количество физиологического раствора. Пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. Культура микрококка считалась пригодной для работы, если за указанный период времени в опытной пробирке происходил полный лизис находящихся в ней клеток.
Качественный метод определения лизостафиновой активности Staphylococcus simulans.
Качественный метод определения лизостафиновой активности (Суровцев В.И., Гусев В.В., 1999) отличался от определения лизоцимной активности по Hawiger только тем, что в качестве индикаторного штамма использовали не микрококк, а чувствительный к лизостафину штамм S. aureus 59. Суточную культуру S. aureus 59 смывали 0,5% раствором NaCl и убивали в автоклаве в течение 15 минут. Взвесь убитого нагреванием стафилококка вносили в слой МПА из расчета создания концентрации стафилококка 109 клеток на 1 мл среды. На поверхность подсушенного МПА с S. aureus 59 наносили в виде капель исследуемый штамм S. simulans RN 3239 (по 20-25 капель на чашку). Результаты учитывали через 24-48 часов инкубации. Вокруг макроколоний выросшего лизостафинактивного штамма образуется зона лизиса S. aureus 59, внесенного в слой агара.
Коллекция клинических штаммов S. aureus и их общая характеристика
Работа выполнена на 150 штаммах S. aureus, обладающих типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами. Данные штаммы были получены из детской городской поликлиники №121 г. Москвы и городской детской клинической больницы № 12 г. Казани и являлись клиническими изолятами, выделенными, в основном, от урологических больных, а также у больных с поражением респираторного тракта и с кишечной инфекцией.
Опыты по видовой идентификации были поставлены в соответствии с общепринятыми методиками. Все клинические штаммы были подразделены на 4 группы в соответствии с локализацией патологического процесса (табл. 4). Первая группа включала штаммы, выделенные от больных с поражением респираторного тракта (бронхит, острый и хронический фарингит, бронхоаденит, ангина, ОРЗ) — 30 штаммов. Вторая группа (72 штамма) включала штаммы, изолированные из мочи при урологических инфекциях (цистит, острый и хронический пиелонефрит). Третья группа включала штаммы, выделенные от больных с кишечной инфекцией (28 штаммов). Большинство внутриболышчных штаммов было выделено у детей раннего возраста от 1 до 3 лет и младшего школьного возраста (до 9 лет). Контрольную группу составляли 20 штаммов золотистого стафилококка, выделенных с поверхности кожи и из фекалий клинически здоровых детей.
Основной задачей первого этапа исследований являлось решение вопроса о наличии у клинических изолятов лизоцимной и лизостафиновой активности. Лизоцимная активность была обнаружена только в двух группах клинических изолятов золотистого стафилококка, выделенных у больных с инфекцией верхних дыхательных путей и при уроинфекции (соответственно 46,6%±1,2 и 38,8%±3,5). Лизостафиновая активность не обнаружена ни у одного штамма. Штаммы, выделенные от больных с кишечной инфекцией (III группа), обладали лизоцимной активностью в единственном случае (один штамм из 28). Ни один штамм контрольной группы не проявлял лизоцимную активность.
Для качественного определения лизоцимной активности у изолятов использовали три чашечных метода: метод Hawiger (1968), метод Смолягина А.И. (1974) и метод отсроченного антагонизма.
При помощи трех чашечных (качественных) методов определения лизоцимной активности было установлено, что 42 штамма из 150 обладали лизоцимной активностью, причем 14 из них были выделены от больных с инфекцией верхних дыхательных путей и 28 от больных с уроинфекцией. При этом количество штаммов, выявленных методом Смолягина А.И. с живым микрококком было намного выше, чем при использовании других методов. Все 42 лизоцимактивных штамма давали положительную реакцию в методе Смолягина А.И.
Зоны лизиса, образуемые штаммами в методе Смолягина А.И., были более четкими, резкими, больше по диаметру, чем в других методах. Наименьшее количество лизоцимактивных штаммов удалось выделить с помощью метода отсроченного антагонизма, при котором использовался порошок М. lysodeikticus 2669, высушенного в ацетоне. Зоны лизиса в этом методе были размытыми, слабыми, нечеткими, меньшими по размеру.
Таким образом, из 14 лизоцимактивных штаммов, выделенных от больных с инфекцией верхних дыхательных путей, все давали лизоцимную активность с помощью метода Смолягина А.И. (100%). Всего 8 штаммов из 14 (57,7%) проявляли лизоцимную активность в методе Hawiger, и только 4 штамма (28,5%) - с помощью метода отсроченного антагонизма.
Из 28 лизоцимактивных штаммов, выделенных от больных с уроинфекцией, также все штаммы (100%) проявляли лизоцимную активность при помощи метода Смолягина А.И. с живым микрококком. 23 штамма (82,5%) образовывали зоны лизиса при помощи метода Hawiger с убитым автоклавированным микрококком, и только 16 штаммов (57,1%) давали лизоцимную активность при помощи метода отсроченного антагонизма с порошком микрококка, высушенным в ацетоне.
Таким образом, все 42 штамма из 150 клинических изолятов золотистого стафилококка образовывали зоны лизиса, обнаруженные при помощи метода Смолягина А.И. с использованием живого микрококка, и только 31 штамм (73%) давал лизоцимную активность при помощи метода Hawiger, а 20 штаммов (47,6%) - при помощи метода отсроченного антагонизма с использованием убитого микрококка. Все эти результаты подтверждают данные исследований Акатова А.К. и Бухарина О.В. (1985), что живой микрококк лизируется значительно активнее убитого, и этот метод с использованием живых культур является более чувствительным и не зависит от внешних условий, состояния и дозы индикаторного штамма микрококка, вида исследуемых культур, этапности в постановке экспериментов. Полученные нами данные отражены в таблице 5.
В целом все эти методы дополняют друг друга, и только совместное комплексное применение разнообразных методов качественного анализа дает возможность наиболее полно изучить лизоцимную активность клинических изолятов.
В результате проведенных исследований нами было отобрано 16 клинических изолятов золотистого стафилококка, выделенных от больных детей с инфекцией мочевыводящих путей, и 4 штамма, выделенных от больных с инфекцией верхних дыхательных путей, у которых лизоцимная активность определялась всеми тремя методами (Смолягина А.И., Hawiger, отсроченного антагонизма). Среди этих 20 штаммов были отобраны 9 штаммов, которые давали наибольший диаметр зон лизиса индикаторного штамма М. lysodeikticus 2669.
Изучение антагонистической активности рекомбинантного штамма L. fermentum ЛВ 290 в отношении стафилококков
Известно, что представители вида L. fermentum способны подавлять патогенные и условно-патогенные бактерии в кишечнике человека, причем их антагонистическая активность связана с продукцией бактериоцинов, лизоцима, перекиси водорода, молочной и уксусной кислот, других органических кислот и метаболитов, снижающих рН среды. Значительной антагонистической активностью обладает лизоцимактивный производственный штамм-пробиотик L. fermentum 90Т-С4, который способен задерживать рост таких бактерий как Escherichia coli, Klebsiella ozaenae, Shigella sonnei, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis (Пикина А.П., СмеяновВ.В., 1999).
Как указывалось выше, штамм L. fermentum JIB 290 был создан на основе лизоцимактивного штамма L. fermentum 90Т-С4. Нами изучена антагонистическая активность рекомбинантного штамма L. fermentum JIB 290 и исходного штамма L. fermentum 90Т-С4.
В работе были использованы 6 индикаторных тест-штаммов, полученных в ГИСК им. Л.А. Тарасевича: Shigella flexneri 337, Shigella sonnei 2802, S. aureus «Ф», Proteus vulgaris 177, E. coli 026 B6 №157, Proteus mirabilis H273. Антагонистическую активность рекомбинантного штамма L. fermentum JIB 290 и исходного штамма L. fermentum 90T-C4 по отношению к вышеуказанным шести тест-штаммам, определяли при помощи метода отсроченного антагонизма. Результаты данных исследований показали, что рекомбинантный штамм L. fermentum JIB 290, обладающий высоким уровнем лизоцимобразования, был более антагонистически активен по сравнению с исходным штаммом L. fermentum 90Т-С4, особенно в отношение Е. coli и S. aureus, поскольку зоны угнетения роста этих штаммов рекомбинантным штаммом были в 2 раза больше, чем у контрольного штамма (табл. 9).
Далее были проведены исследования по изучению антагонистической активности рекомбинантного штамма L. fermentum ЛВ 290 и штамма L. fermentum 90Т-С4 относительно 130 клинических изолятов S. aureus, которые ранее были исследованы нами на лизоцимную активность. Все 130 штаммов S. aureus были выделены у детей раннего возраста с гнойно-воспалительными заболеваниями респираторного и урогенитального трактов, причем 42 из них обладали лизоцимной активностью. Данный эксперимент проводили также при помощи чашечного метода отсроченного антагонизма при t=37C, в течение 3 суток инкубации на среде MRS-5.
Результаты экспериментов показали, что промышленный штамм-пробиотик L. fermentum 90Т-С4, обладающий определенным уровнем лизоцимобразования, и рекомбинантный штамм L. fermentum ЛВ 290, превышающий его по уровню продукции лизоцима в 2,5 раза, задерживали рост практически всех 130 штаммов S. aureus (как лизоцимактивных, так и не лизоцимактивных), однако зоны угнетения роста стафилококка у рекомбинантного штамма лактобацилл были значительно больше по сравнению с исходным штаммом.
Таким образом, рекомбинантный штамм L. fermentum ЛВ 290 являлся более антагонистически активным по отношению к золотистому стафилококку и кишечной палочке. Сконструированный штамм лактобактерий подавлял рост практически всех исследованных клинических изолятов S. aureus. Известно, что под влиянием лактобактерий усиливается активность клеток моноцитарно-макрофагального ряда, индуцируется синтез интерферона, II—I, IL-6 и TNF-a. Таким образом, клетки данного генно-инженерного штамма лактобактерий должны сочетать повышенную антимикробную и иммуностимулирующую активности. Использование полученного штамма L. fermentum ЛВ 290 для профилактики и лечения гнойно-воспалительных процессов, вызываемых стафилококками, в том числе лизоцимактивными, весьма привлекательно и противопоказаний не имеет. Данный штамм может быть рекомендован для создания новых видов пробиотиков. Для этого целесообразно было бы продолжить исследования с целью внедрения фрагмента рекомбинантной плазмиды в хромосому штамма L. fermentum ЛВ 290.
Так как мы предполагаем, что нами клонирован ген lytA, кодирующий продукцию внеклеточного лизоцима S. aureus, нами была разработана ПЦР - тест система для выявления этого гена у изучаемых нами штаммов и подтверждения этого предположения.
ПНР широко применяется не только для диагностики инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы, но и в молекулярной генетике для решения ряда проблем. Чтобы создать ПЦР-тест систему для выявления гена, контролирующего синтез стафилококкового лизоцима или пептидгликановой гидролазы (P-l-4-ацетилглюкозаминидазы) в работе решали следующие задачи:
1) выбор специфичных олигонуклеотидных праймеров,
2) отработка условий лизиса бактериальных клеток,
3) отработка условий проведения реакции.
