Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в конце XX века в борьбе с инфекционными заболеваниями человека, внутрибольничные инфекции (ВБИ) остаются одной из острейших проблем современной медицины, которая приобретает все большую экономическую и социальную значимость Рост заболеваемости ВБИ связан со значительным ростом числа госпитальных штаммов микроорганизмов, обладающих устойчивостью к широкому кругу антимикробных препаратов, увеличением частоты инвазивных лечебных процедур и методов диагностики, качественными изменениями структуры популяции пациентов (Прозоровский С.В , Генчиков Л А, 1994, Покровский В И и др 2000, Семина Н А , Ковалева Е П, Акимкин В Г, Сидоренко С В., 2006)
Среди возбудителей ВБИ одно из ведущих мест во многих развитых странах мира принадлежит микроорганизмам рода Staphylococcus, наиболее патогенным представителем которого является Staphylococcus aureus Эпидемиологическая обстановка осложняется в связи нарастанием частоты выделения клинических изолятов золотистого стафилококка, устойчивых к оксациллину (метициллину), сокращенно называемых ORSA или MRSA, которые наряду с устойчивостью ко всем р-лактамным антибиотикам нередко обладают резистентностью и ко многим другим классам антимикробных препаратов (Ayhffe, G А , 1997, Воусе J М ,1997, Lowy F D , 2003) По данным зарубежных исследований MRSA вызывают разнообразные формы внутрибольничной инфекции, включая наиболее тяжелые, такие как бактериемия, пневмония, синдром токсического шока, септический артрит, остеомиелит, которые требуют длительного и дорогостоящего лечения (Edmond MB et al ,1999, Dinges M M , Orwin P.M. and Schlievert P M, 2000, Engelmann J J et al, 2003)
В конце 80-х годов XX века на основании сходства фенотипических характеристик клинических изолятов MRSA, выделенных во время вспышек ВБИ в разных стационарах, сформировалось представление о способности некоторых госпитальных штаммов MRSA к эпидемическому распространению (MarplesR. R, and Cooke Е,1985) Внедрение молекулярных методов типирования в эпидемиологические исследования явилось мощным инструментом идентификации и изучения механизмов формирования эпидемически значимых штаммов прокариот На стыке микробиологии, молекулярной биологии и эпидемиологии возникло новое направление исследований — молекулярная эпидемиология инфекционных заболеваний, основными задачами которого являются изучение географического распространения различных генотипов патогенных микроорганизмов, их роли в формировании особенностей клинических форм заболеваний, т.е углубленного изучения паразитарной системы как биологической основы эпидемического процесса инфекционных болезней (Черкасский Б Л, 2001) Использование молекулярных методов типирования позволило нескольким группам
,V \ -ч \
зарубежных исследователей выявить циркуляцию MRSA, сходных по ряду молекулярно-генетических характеристик, не только в стационарах различных городов, но даже стран, расположенных на разных континентах. Такие MRSA в работах английских исследователей получили название эпидемических штаммов (Hookey J.V., Richardson J F and Cookson В D, 1998) В отличие от идентифицированных в Великобритании, выделенные в стационарах некоторых стран Латинской Америки и на европейском континенте, в США и Японии, схожие изоляты MRSA, охарактеризованные американскими исследователями с использованием других молекулярных методов типирования, были названы эпидемическими клонами Было показано, что рост частоты ВБИ, наблюдаемый в стационарах, в значительной степени обусловлен распространением эпидемических штаммов или клонов MRSA (Ayhffe, G A , 1997, Oliveira D et al, 1998)
Достигнутый на рубеже веков существенный прогресс в изучении молекулярных механизмов резистентности S aureus к антимикробным препаратам, расшифровка полных нуклеотидных последовательностей геномов нескольких метициллинрезистентных и метициллинчувствительных штаммов S aureus выявили, что этот микроорганизм принадлежит к гетерогенным и полиморфным видам, у которого не только гены антибиотикорезистентности, но и многие гены патогенности присутствуют в хромосоме в составе геномных островов различных типов островов «патогенности», стафилококковых хромосомных кассет (SCC), профагов В разных штаммах эти генетические элементы существуют в виде аллельных форм и характеризуются различной степенью мобильности (KurodaM et al., 2001, BabaT et al,2002) Генетическое разнообразие внутри вида является следствием горизонтального переноса генов, расположенных на мобильных генетических элементах (МГЭ) Стало очевидным, что многие из широко используемых методов молекулярно-генетического типирования не способны выявить наличие МГЭ в хромосоме MRSA, и лишь косвенно отражают различия в геноме тестируемых клинических изолятов
Несмотря на введение Международной классификации болезней 10-го пересмотра, в РФ до настоящего времени не осуществляется регистрация стафилококковых инфекций Данные официальной отчетности (ф№2) не отражают этиологическую роль в развитии ВБИ условно-патогенных микроорганизмов и не позволяют определить частоту инфекций, вызванных MRSA Вместе с тем с конца 90-х годов в РФ отмечался рост числа научных публикаций, посвященных выделению MRSA в стационарах. Известно, что нарастание доли MRSA среди клинических изолятов S aureus значительно ограничивает возможности эмпирической антимикробной терапии, сокращает арсенал используемых антибактериальных препаратов, существенно ухудшает качество медицинской помощи, оказываемой населению В этих условиях назрела неотложная необходимость совершенствования методов микробиологического мониторинга S aureus, проводимого в отечественных стационарах
Однако на момент начала нашей работы не существовало общепризнанных методов и схем молекулярно-генетического типирования MRSA, были не известны какие-либо генетические характеристики штаммов MRSA, циркулирующих в стационарах РФ, отсутствовали представления о наличии возможных генетических связей между эпидемическими штаммами и клонами, выделенными в стационарах других стран мира и охарактеризованными с помощью разных молекулярных методов
Цель работы: исследование геномного полиморфизма как основы
молекулярно-генетического мониторинга метициллинрезистентных
Staphylococcus aureus в системе эпидемиологического надзора за возбудителями внутрибольничных инфекций
Задачи исследования:
Создание коллекции клинических изолятов Staphylococcus aureus, выделенных в многопрофильных и специализированных стационарах нескольких регионов Российской Федерации от пациентов и медицинского персонала, а также из объектов окружающей среды, для анализа частоты распространения и определения значения метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) как возбудителей внутрибольничных инфекций
Выявление детерминант антибиотикорезистентности и фагочувствительности и определение возможности их использования в качестве маркеров в эпидемиологических исследованиях для дифференциации MRSA
3. Изучение структурного полиморфизма генов хромосомного «ядра» и набора генов, входящих в состав мобильного генетического пула микробной клетки, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность. Определение критериев дифференциации эпидемически значимых штаммов MRSA
Разработка схемы молекулярно-генетического типирования, учитывающей особенности структурной организации генома метициллинрезистентных S aureus, и исследование генетических связей между клиническими изолятами MRSA, выделенными в разных стационарах Идентификация эпидемически значимых штаммов, выявление их клональности
Определение наличия (отсутствия) генетической общности между циркулирующими в стационарах России и эпидемическими метициллинрезистентными штаммами S aureus, циркулирующими в других странах мира Выявление возможных механизмов появления и генетической изменчивости эпидемических штаммов MRSA
Определение возможности применения разработанной схемы молекулярно-генетического типирования MRSA при проведении локальных эпидемиологических расследований
Научная новизна. Разработана схема молекулярно-генетического
типирования возбудителей инфекционных заболеваний
метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, основанная на изучении молекулярных маркеров двух типов генов, входящих в состав хромосомного « ядра», и генов, являющихся структурными компонентами геномных островов различных классов, которая позволяет
дифференцировать эпидемические штаммы;
выявлять случаи заноса в стационары РФ эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих в других странах мира;
обнаруживать появление новых эпидемических штаммов и изучать механизмы их формирования,
прослеживать генетические связи между штаммами
Впервые у метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах нескольких регионов Российской Федерации исследован полиморфизм генов, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность, входящих как в состав хромосомного «ядра», так и являющихся структурными компонентами мобильных генетических элементов (МГЭ), принадлежащих к различным классам
Впервые показано, что в стационарах России циркулируют эпидемически значимые штаммы MRSA, способные вызывать разнообразные, в том числе и генерализованные, формы внутрибольничной гнойно-септической инфекции, получены приоритетные данные о структурных особенностях их геномов
Выявлено генетическое родство идентифицированных эпидемических штаммов с международными эпидемическими штаммами и клонами MRSA, указывающее на то, что появление MRSA в России является результатом их заноса из европейских стран Получены приоритетные данные о распространении эпидемических штаммов MRSA в стационарах нескольких регионов РФ Расширены представления об эпидемическом распространении MRSA в Евразии
Установлено, что в процессе распространения эпидемических штаммов MRSA на отдельных территориях может происходить их дальнейшая дивергенция за счет изменения набора генов в составе мобильного генетического пула микробной клетки, которая может приводить к формированию новых эпидемических штаммов
Идентифицированы новые представители геномных островов золотистого стафилококка семейства стафилококковых хромосомных кассет (SCC) Показано, что формирование новых кассет происходит в результате делеций и рекомбинаций, затрагивающих как отдельные фрагменты, так и целые генетические элементы SCC
Идентифицирован новый эпидемический штамм MRSA, содержащий композитный генетический элемент SCCwec
Установлено наличие связи между определенным генетическим «бэкграундом» и присутствием в бактериальной клетке генов патогенности, расположенных на мобильных генетических элементах
Практическая значимость и внедрение. Разработана молекулярно-генетическая основа для создания национальной базы данных эпидемических метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus - возбудителей ВБИ
Усовершенствована система эпидемиологического надзора (ЭН) за внутрибольничными инфекциями, вызванными множественно-устойчивыми к антибиотикам патогенами научно обоснованы схема и необходимость проведения молекулярно-генетического мониторинга MRSA в стационарах РФ Разработаны и внедрены в практику работы территориальных управлений Роспотребназора и региональных центров гигиены и эпидемиологии методические рекомендации «Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus - возбудители внутрибольничных инфекций идентификация и генотипирование», утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Л П Гульченко 23 июля 2006 г
Предложена новая экономичная методика выделения ДНК из S aureus, с использованием в качестве лизирующего агента гуанидина тиоционата вместо лизостафина, которая гарантирует стабильность полученной ДНК в течение нескольких лет и расширяет возможности для проведения генетических исследований S aureus
Впервые создан музей и банк ДНК эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих на территории РФ, а также музей клинических изолятов метициллинрезистентных и метициллинчувствительных S aureus, выделенных при различных формах внутрибольничной инфекции, в лаборатории стафилококковых инфекций ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН
Полученные в проведенном исследовании результаты могут быть использованы в работе клинических микробиологических лабораторий лечебно-профилактических учреждений хирургического, акушерско-гинекологического, травматологического профиля, ожоговыми центрами, а также специалистами, осуществляющими эпидемиологический надзор за внутрибольничными инфекциями
Апробация диссертационной работы Материалы диссертационной работы доложены на VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002 г), Международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 2002 г), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004 г), Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004 г), VII Международной конференции MAKMAX/ESMID (Москва,
2005 г), 16-Европейском конгрессе «Клиническая микробиология и инфекционные болезни» (Ницца, 2006 г), VIII Международном конгрессе MAKMAX/ASM по антимикробной терапии (Москва, 2006 г ), VIII Российской конференции «Современные проблемы антимикробной терапии», (Москва, 2006 г), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г). Апробация диссертации состоялась на конференции отдела бактериальных инфекций совместно с отделами генетики и молекулярной биологии бактерий и эпидемиологии в ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН 14 мая 2007 г
Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 227 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 232 источника (57 отечественных и 175 зарубежных) Работа иллюстрирована 30 рисунками и содержит 24 таблицы
Основные экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом Исследования по определению нуклеотидных последовательностей генов соа и spa выполнены в соавторстве с сотрудниками лаборатории «Группа анализа генома» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии (рук к б н Шилов И А) Эксперименты по разработке методики выделения ДНК из золотистого стафилококка выполнены совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики плазмид ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН (рук член-корр РАМН, д б н, профессор Смирнов Г Б )
