Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Биологические ритмы различных свойств микроорганизмов (обзор литературы) 12
1.1. Современное представление о биологических ритмах 12
1.2. Биологические свойства S. aureus 21
1.3. Влияние различных факторов на биологические свойства S. aureus 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Материалы исследования 33
2.1.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе... 33
2.1.2. Выделение и идентификация микроорганизмов, используемых в работе 35
2.2. Методы изучения биологических свойств S. aureus 36
2.2.1. Определение пролиферативной активности 36
2.2.2. Определение активности плазмокоагулазы 36
2.2.3. Определение активности протеазы 37
2.2.4. Определение активности каталазы 38
2.2.5. Определение гемолитической активности 39
2.3. Определение антибиотикочувствительности S. aureus 39
2.4. Определение чувствительности S. aureus к дезинфектантам... 40
2.5. Методика изучения регулирующего влияния
антимикробных препаратов на биологические свойства S. aureus... 41
2.5.1. Методика определения суббактериостатических концентраций антимикробных препаратов 41
2.5.2. Методы изучения влияния антимикробных препаратов на биологические свойства S. aureus 41
2.6. Статистическая обработка результатов 44
ГЛАВА 3. Особенности биологических свойств музейных штаммов и госпитальных изолятов s. aureus в суточной динамике 46
3.1. Суточная динамика пролиферативной активности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus 47
3.2. Суточная динамика протеазной активности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus 52
3.3. Суточная динамика каталазной активности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus 56
3.4. Суточная динамика гемолитической активности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus 60
3.5. Суточная динамика плазмокоагулазной активности S. aureus... 64
ГЛАВА 4. Чувствительность s. aureus к антимикроб ным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики 71
4.1. Суточная динамика антибиотикочувствительности S. aureus... 71
4.2. Суточная динамика чувствительности S. aureus к дезинфектантам 78
ГЛАВА 5. Влияние антимикробных препаратов на биоритмы биологических свойств s. aureus 84
5.1. Влияние пероксимеда на пролиферативную активность музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus 85
5.2. Влияние пероксимеда на плазмокоагулазную активность музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus 93
5.3. Влияние гентамицина на пролиферативную активность S. aureus 103
5.4. Влияние ванкомицина на пролиферативную активность S. aureus 106
5.5. Влияние ванкомицина на плазмокоагулазную активность музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus 112
Заключение 118
Выводы 135
Список литературы
- Биологические свойства S. aureus
- Определение активности плазмокоагулазы
- Суточная динамика каталазной активности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus
- Влияние пероксимеда на плазмокоагулазную активность музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus
Введение к работе
Актуальность проблемы
Для современного этапа развития медико-биологических наук характерен возрастающий интерес к закономерностям организации живого во времени. Ритмы охватывают все проявления живого – от деятельности субклеточных структур и отдельных клеток до сложных форм поведения организма, популяций и экологической системы. Это свидетельствует, что биоритмы являются универсальным и важнейшим свойством жизни (Агаджанян Н.А., Башкиров А.А., 1987; Арушанян Э.Б., 2000; Романов Ю.А., 2000; Halberg F., 1994, 2006). Изучение биоритмов открывает новые возможности в решении ряда медико-биологических проблем – механизмов гомеостаза, адаптации, чувствительности к лекарственным средствам, диагностики, лечения, профилактики заболеваний человека (Комаров Ф.И. с соавт., 2008; Aschoff J., 1985; Cornelissen G., 1993; Halberg F., 1991; Minors D.S., 1992). Поэтому чрезвычайно важным является обнаружение в живой системе ритмических колебаний различных жизненных процессов (Романов Ю.А., 2005; Ноздрин Г.А., 2006; Маркина В.В., 2008; Смирнов С.Н., 2008).
Биологические ритмы различных функций хорошо изучены у эукариотических клеток. Сведения же о биоритмах прокариот единичны, противоречивы, не систематизированы (Павлович Н.В., 1991; Капитанов Е.А., Жмакин А.И., 1992; Kippert F., Lloyd D., 1987; Lloyd A., Rossi E., 1992; Min H. et al., 2005).
Для изучения биоритмов прокариот нами в качестве модели был использован Staphylococcus aureus, который является уникальным микроорганизмом, колонизирующим и поражающим многие органы и ткани, демонстрируя при этом широкий диапазон адаптационных возможностей (Николаева И.В., 2000; Учайкин В.Ф., 2003; Габриэлян Н.И., 2004; Чернуха М.Ю., 2005; Кафарская Л.И., 2006, Флуер Ф.С., 2006; Поспелова С.В. с соавт., 2008). Успехи в изучении биологии стафилококков позволили относительно полно охарактеризовать механизмы и факторы, способствующие развитию инфекционной патологии у человека (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Карташова О.Л., 2002).
Изучение ритмических колебаний различных функций стафилококков позволяет по-новому подойти к оценке биологических свойств возбудителя, способствуя разработке новых подходов к микробиологической диагностике стафилококковых инфекций, созданию предпосылок для дальнейших исследований по осуществлению рациональных антимикробных мероприятий.
Цель и задачи исследования
Цель исследования - изучение особенностей биологических свойств S. aureus и влияние на них антимикробных препаратов в разное время суток.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Изучить биологические ритмы пролиферативной активности и патогенных характеристик (протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной активности) музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus в разное время суток.
-
Определить чувствительность S. aureus к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики.
-
Оценить влияние антимикробных препаратов на биоритмы пролиферативной и плазмокоагулазной активности S. aureus.
Новизна исследования
Впервые представлена характеристика суточной динамики пролиферативной активности и патогенных свойств S. аureus. Обнаружены циркадианные ритмы пролиферативной активности у музейных штаммов S. аureus, в отличие от госпитальных изолятов, у которых выявлены преимущественно ультрадианные ритмы. У музейных штаммов S. аureus отмечены в основном циркадианные ритмы факторов патогенности с акрофазами протеазной, каталазной и плазмокоагулазной активности в утренние часы, гемолитической – в вечернее время. У госпитальных изолятов обнаружены ультрадианные ритмы данных факторов, с акрофазами в вечернее и ночное время. Полученные результаты, расширяя теоретические представления о различных периодах физиологической активности биологических свойств патогенов в течение суток, позволили разработать способ дифференциации госпитальных изолятов S. аureus от музейных штаммов (патент РФ № 2285258, от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).
Исследование гемолитической активности у госпитального изолята S. aureus, типированного как негемолитический вариант во временном аспекте, позволило выявить наличие данного признака в ночное время (02.00 час), что расширяет возможность лабораторной идентификации золотистых стафилококков.
Определена прямая корреляция между пролиферативной и гемолитической активностью и обратная корреляция между пролиферативной активностью и протеазной, каталазной, плазмокоагулазной активностью S. aureus в течение суток, что указывает на способность микроорганизмов в период минимальной пролиферации более успешно противостоять факторам защиты организма хозяина за счет максимального количества факторов патогенности (протеазы, каталазы, плазмокоагулазы).
Обнаружена суточная динамика чувствительности к антимикробным препаратам музейных и госпитальных изолятов S. aureus. Определено варьирование минимальных подавляющих концентраций (МПК) дезинфектантов в разное время суток. Выявлены периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов S. aureus и периоды чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток.
Установлено модулирующее влияние антимикробных препаратов на пролиферативную и плазмокоагулазную активность S. аureus. Показано изменение среднесуточного значения показателей, колебание амплитуды, смещение акрофазы под действием антимикробных препаратов, что свидетельствует о возможностях микроорганизма адаптироваться к изменяющимся условиям путем координации и регуляции собственных ритмометрических параметров и синхронизации их с внешними циклами.
Научно-практическая значимость
Выявленные биоритмы пролиферативной активности, факторов патогенности, их взаимосвязь в суточной динамике, лабильность биоритмов под влиянием антимикробных препаратов расширяют теоретические представления о физиологии биологических свойств S. аureus, его способности к адаптации в изменяющихся условиях среды.
Практическое значение исследований определяется разработкой хронобиологического метода изучения пролиферативной активности S. аureus, позволяющего дифференцировать госпитальные изоляты микроорганизмов на основе сравнительного анализа суточной динамики данного биологического свойства S. aureus.
Хронобиологические исследования определили новый методический подход к изучению временной организации биологических свойств прокариот на модели S. аureus, что позволило выявить различные суточные периоды активности патогенных свойств микробных культур, чувствительности к антибиотикам и дезинфектантам, а также генетически детерминированные признаки, не определяемые традиционными методами.
Предложенный методический подход к изучению биологических свойств S. aureus может быть рекомендован для идентификации S. aureus и дальнейших исследований в области рациональной антимикробной терапии, а также использован в учебно-педагогическом процессе (акт внедрения результатов диссертационной работы № 01/1928 от 06.09.2010 г.).
Положения, выносимые на защиту:
-
Госпитальные изоляты S. aureus имеют преимущественно ультрадианные ритмы пролиферативной активности, факторов патогенности, в отличие от музейных штаммов, для которых характерны циркадианные ритмы.
-
Хронобиологический подход изучения биологических характеристик S. aureus выявляет различные суточные периоды активности патогенных культур в отношении их устойчивости к антимикробным препаратам.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: V Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006); научной сессии, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН «Медицинская академическая наука – здоровью населения Урала» (Челябинск, 2008); выездной сессии Президиума РАМН (Челябинск, 2009); заседании Тюменского филиала Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (ВНПОЭМП), Тюмень, 2009.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Получен патент (№ 2285258, от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).
Объем и структура диссертационной работы
Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 129 отечественных и 100 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 16 таблицами и 32 рисунками.
Биологические свойства S. aureus
Амплитуда - величина наибольшего отклонения полезного сигнала от МЕЗОРа. Амплитуда ритма имеет важное биологическое значение, поскольку служит признаком мощности ритма: установлено, что высокая циркадианная амплитуда (особенно морфологических и метаболических показателей) сопровождается меньшими изменениями в течение нескольких дней, т.е. ритм более стабилен во времени, и чем больше амплитуда, тем труднее индуцировать сдвиг акрофазы (Катинас Г.С., 1989, Czeisler С.А., 1992; Reinberg А., 1978; Reynolds C.F., 1991). Величина амплитуды, как правило, коррелирует с устойчивостью ритмического колебания и косвенно свидетельствует о биологической ценности компонента хронома -комплексной временной организации живых систем (Comelissen G. 1993; Comelissen G., Halberg F., 1994; 1996; Halberg F., 1991,1992). МЕЗОР, наряду с амплитудой, фазовой структурой ритма и пределами их обратимых изменений при воздействии входит в понятие хронобиологической нормы (Алпатов A.M., 2000; Романов Ю.А., 2002).
В любом организме имеется большое количество биологических ритмов, составляющих основу временной организации и отличающихся не только функциональной принадлежностью, но и своими параметрами, значением, соподчиненностью, поэтому временную организацию нельзя рассматривать как простую сумму составляющих ее ритмов, хотя каждый участвующий в ее образовании ритм является элементом временной организации (Романов Ю.А. с соавт., 2000).
Из всего многообразия циклических процессов основное внимание ученых сосредоточено на изучении суточных биоритмов, так как они в сложной иерархии ритмов выступают в роли дирижера всех колебательных процессов организма и имеют столь же фундаментальное значение, как и генетический код. Этот постоянный 24-х часовой ритм геофизических параметров на планете не мог не оказать влияние на становление жизни и ее эволюцию (Агаджанян Н.А., 1998; Губин Д.Г., Губин Г.Д., 2000; Созаева З.Ю., 2008; Johnson С.Н., 2005; Robertson McClung С, 2007).
Исследования последних лет продемонстрировали, что большинство организмов имеют, по крайней мере, одно внутреннее циркадианное устройство хронометрирования, которое колеблется с периодом близким к астрономическим суткам (Губин Г.Д., Герловин Е.Ш., 1980, Комаров Ф.И., 1989).
Биоцикличность живых клеток была убедительно подтверждена «открытием регуляторов клеточного цикла» в работах Leland Н. Hartwell, R. Timaty Hunt, Paul M. Nurse (Ерюхин И.А., 2003).
Эндогенность циркадианных ритмов была продемонстрирована на животных и человеке исследованиями с изоляцией от известных внешних синхронизаторов и датчиков времени, при поддержании неизменными внешних факторов (Aschoff J., 1985; Comelissen G., Halberg F., 1994; Halberg F., 1958; 1959; 1970), а также подтверждена впоследствии исследованиями на молекулярно-генетическом уровне, в результате которых был выделен ген, ответственный за период циркадианного ритма — «рег»-ген (Konopka R., 1971). Исходя из данных о генетической основе биологической ритмичности, обосновано говорить о потенциальной способности каждой клетки проявлять ритмическую активность в определенных частотных областях (Губин Д.Г., Губин Г.Д., 2000).
Исследования многих авторов подтверждают, что циркадианные ритмы присущи всем без исключения эукариотическим организмам, а таюке отдельным тканям, органам и даже клеткам. И у всех изученных типов живых существ (простейших, растений, животных) основные свойства ритмов одинаковы: стабильность фазы, независимость периода от температуры, устойчивость к метаболическим ядам. Есть общие закономерности для одноклеточных организмов и человека. Это питание, обмен веществ, рост, размножение, передача наследственной информации. Следовательно, околосуточные ритмы действительно являются фундаментальным всеобщим свойством живого (Агаджанян Н.А., 1998; Алпатов A.M., 1993; Комаров Ф.И., Рапопорт СИ., 2000). Неспецифический характер изменений со стороны ритмических процессов жизнедеятельности может быть охарактеризован с позиции теории циркадианного десинхроноза, поскольку именно относительная выраженность эдогенного сигнала, каковым является циркадианный ритм, служит наиболее общим, интегральным критерием благополучия организма (Губин Д.Г., 2008).
Долгое время считалось, что циркадианные ритмы свойственны лишь эукариотам. Данные о ритмах прокариот в литературе немногочисленны и противоречивы. В работах Загускина С.Л. утверждается, что у прокариот сохранились лишь реликтовые биоритмы с периодом равным 8 часам. Реликтовые ритмы меньше по периоду основных биоритмов многоклеточных организмов примерно в 3 раза. Одноклеточные микроорганизмы не имеют суточного 24-х часового ритма, потому что не стали многоклеточными. (Загускин С.Л., 2000). Некоторые авторы считают, что у прокариотических органзмов не могут быть обнаружены циркадианные ритмы, так как их клетки не имеют оформленного ядра и митохондрий, а часовым механизмом в ядре служит ядерная оболочка (Ноздрин Г.А., 2006). Ю.А. Романов (2002) отвергает наличие циркадианных ритмов у бактерий, мотивируя это тем, что жизненный цикл бактерий длится всего от 4-х до 8-й часов, но допускает присутствие других ритмов - часовых и минутных. Другие авторы считают, что роль таймера (биологических часов) у безъядерных прокариотов играет сам цикл развития клетки. Каждый цикл клеточного деления бактерий — это заново возникающий «временной водитель», который не только воссоздает определенный биологический ритм функционирования внутриклеточных систем, но и тонко согласует периоды жизнедеятельности бактериальной клетки с меняющимися условиями среды обитания (Смирнов С.Г., 2006).
Определение активности плазмокоагулазы
В настоящее время возрос интерес к изучению ритмических колебаний различных функций организмов (Романов Ю.А., 2000; Чибисов СМ., 2006). Основное внимание ученых сосредоточено на изучении суточных биоритмов. Они имеют фундаментальное значение, так как постоянный 24-х часовой ритм геофизических параметров на планете оказывает влияние на становление жизни и ее эволюцию (Губин Д.Г., 2000; Созаева З.Ю., 2008; Johnson С.Н., 2005; Robertson McClung С, 2007).
Биологические ритмы играют важную роль в изучении механизмов гомеостаза, адаптации, чувствительности к лекарственным средствам, диагностики, лечения, профилактики заболеваний человека (Агаджанян Н.А., 1998; Романов Ю.А., 2002). Авторы связывают это с тем, что биоритмам присущи такие свойства, как эндогенность, способность к самоподдержанию, пластичность. В связи с этим биоритмы выполняют функцию обеспечения экономного режима функционирования, единства организма и среды (адаптация), построения периодической программы организма, памяти на время, фотопериодической реакции (Шурлыгина А.В., 2001).
Биоритмы различных функций хорошо описаны у эукариотических организмов. Однако сведения о ритмических колебаниях биологических свойств прокариот единичны, не систематизированы. Имеются данные о цирканнуальных ритмах пролиферативной активности кишечных палочек, сальмонелл, стафилококков, а также ритмах факторов патогенности стафилококков - ДНК-азы, плазмокоагулазы, желатиназы (Павлович Н.В., 1991; Поликарпов Н.А., 1995). Не было найдено данных по биоритмам госпитальных изолятов патогенов. S. aureus - один из основных возбудителей нозокомиальных инфекций (Яковлев СВ. с соавт., 2003; Чучалин А.Г. с соавт., 2005; Флуер, Ф.С. 2007; Fein A. et al., 1999; Osmon S., 2004). Способность S. aureus поражать многие органы и ткани, вызывать госпитальные инфекции связана с многообразием у них факторов патогенности (протеаза, каталаза, плазмокоагулаза, гемолизины и др.) и приобретением устойчивости ко многим антибиотикам (Сидоренко СВ., 2005; Веретельникова И.Ю., 2007; Holden М.Т., 2004).
Учитывая все вышеперечисленное, нам представилось целесообразным изучить некоторые биологические свойства, патогенные характеристики S. aureus в различное время суток.
Результаты исследований выявили существенные изменения пролиферативной активности в течение суток у музейных штаммов S. aureus.
В таблице 3 представлены основные ритмометрические показатели, свидетельствующие о том, что для музейных штаммов S. aureus (209-Р и 25923) характерен достоверный циркадианный (околосуточный) ритм (вклад ритма - 38,4%) и 56,1%, при р 0,05). Амплитуда циркадианного ритма музейных штаммов характеризовалась сходными значениями (37,9±7,9 КОЕ/мл и 31,0±6,9 КОЕ/мл). Максимальные значения пролиферативной активности наблюдались как для штамма 209-Р, так и для штамма 25923 в вечернее и ночное время. Минимум пролиферативной активности для обоих штаммов отмечался в утреннее время - 11.00 часов (рис. 1). Таким образом, у музейных штаммов микроорганизмов были выявлена суточная динамика изучаемого свойства. Между штаммами S. aureus 209-М и 25923 наблюдалось сходство ритмометрических показателей по вкладу циркадианного ритма, мезору, амплитуде и акрофазе. Для музейных штаммов S. aureus преобладающим ритмом являлся циркадианный.
По оси ординат - количество колониеобразующих единиц на 1 мл (КОЕ/мл) Результаты исследований пролиферативной активности госпитальных изолятов S. aureus также выявили ее изменения в течение суток (табл. 4). У госпитальных изолятов не было обнаружено циркадианного ритма данного свойства, они характеризовались ультрадианным (период менее 20 часов) ритмом. Изолят S. aureus 2305 обладал ультрадианным ритмом с периодом 12 часов (вклад ритма - 44,0%, р 0,001), с максимумами роста в 8.00 и 20.00 часов и минимумами в 5.00 и 14.00 часов (рис. 2). У S. aureus 2891 также был выявлен ультрадианный ритм, но в отличие от изолята 2305 вклад 12-ти часового периода был значительно меньше (17,8%, р 0,04). Максимальные показатели пролиферативной активности наблюдались в 2.00 и 20.00 часов, минимальные значения регистрировались в 17.00 и 23.00 часа. Для S. aureus 2888 12-ти часовой период ритма характеризовался низким вкладом — 15,6% (р 0,05), для этого штамма достоверным оказался период, близкий к 8-ми часовому (вклад 74,6%, р 0,05), с максимумами пролиферативной активности в 5.00; 14.00 и 23.00 часа, и минимумами - в 2.00; 11.00 и 20.00 часов. По оси ординат - количество колониеобразующих единиц на 1 мл (КОЕ/мл) Следовательно, для госпитальных изолятов S. aureus характерна гетерогенность биоритмов пролиферативной активности. Каждый из изолятов S. aureus 2305, 2888 и 2891 имели свой индивидуальный профиль ритма, отличающийся периодами вкладов, амплитудами и акрофазами.
Вместе с тем хроноинфраструктура госпитальных изолятов S. aureus отличалась от музейных штаммов. В спектральном составе биоритмов пролиферативной активности у музейных штаммов преобладали циркадианные ритмы, у госпитальных изолятов — ультрадианные ритмы. Отличия были выявлены по величине амплитуды, как показателя, коррелирующего со вкладом. Величины вкладов и амплитуд являются показателями стабильности и мощности ритма. Ультрадианные ритмы, выявленные у госпитальных изолятов, характеризуюся вариабельностью периодов, что имеет важное биологическое значение, так как определяет устойчивость к внешним воздействиям и способность к адаптивному ответу на периодические раздражители. Наблюдались различия между музейными и госпитальными штаммами и по акрофазам ритмов. У госпитальных изолятов S. aureus максимальные значения пролиферативной активности наблюдались в разное время суток, у музейных - только в вечернее и ночное время. Достоверные отличия вкладов, амплитуды и акрофазы ритмов музейных штаммов от госпитальных изолятов S. aureus может использоваться для их дифференциации.
Суточная динамика каталазной активности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus
Таким образом, в течение суток выявлены различные периоды чувствительности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus к антимикробным препаратам. Определено варьирование МПК амоксиклава, цефазолина, имипенема, гентамицина, рифампицина, клиндамицина, ванкомицина в течение суток по отношению к музейному штамму S. aureus Максимальная чувствительность музейного штамма S. aureus практически ко всем изученным антибиотикам была определена в 5.00; 17.00; 20.00 и 23.00 часа. Выявлена достоверная обратная корреляция между минимальными значениями подавляющей концентрации имипенема, клиндамицина и пролиферативной активностью (г = -0,50; г = -0,42; р 0,05).
У музейного штамма S. aureus отмечены периоды резистентности к изучаемым антибиотикам в различное время суток. Эти периоды соответствовали периодам минимальной пролиферативной активности данного штамма. У госпитального изолята была выявлена суточная динамика только к тем антибиотикам, которые широко не используются в практике, как антистафилококковые, (моксифлоксацин, гатифлоксацин, синерцид). К этим антибиотикам обнаружены периоды чувствительности в течение суток. На всем протяжении суточного периода госпитальный штамм был чувствителен только к ванкомицину.
Обнаружена суточная динамика чувствительности к пероксимеду, хлорамину, жавелиону как у музейных, так и у госпитальных штаммов S. aureus. При оценке чувствительности имело значение время экспозиции культуры с рабочими концентрациями дезинфектантов. Различная чувствительность музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus к антимикробным препаратам может иметь значение для дальнейших исследований в направлении рациональной антибиотикотерапии и проведении дезинфекционных мероприятий. ГЛАВА 5.
В настоящее время имеется ряд сведений о влиянии различных факторов на биологические свойства бактерий. Показано появление штаммов с низкой плазмокоагулазной, ДНК-азной, гемолитической активностью под влиянием химических факторов (Фадеева Н.И., 1978; Ильинская О.Н., 2002; Isken S., 1998), мелких негемолитических G-колоний, с высокой устойчивостью к повышенным температурам (стрессоустойчивые) при культивировании S. aureus с алкилоксибензолом (Ильинская О.Н., 2002), изменение суточной и сезонной активности роста под влиянием различных физических и химических факторов (Павлович Н.В., 1991; Karu Т., 1999; Ильинская О.Н., 2002), изменение активности каталазы S. aureus под действием метаболитов микробов (Бухарин О.В., Сгибнев А.В., 2002).
Известно, что ритмометрические параметры, как наиболее чувствительные, первыми реагируют на влияние факторов окружающей среды (Хетагурова Л.Г., 2005; Валиева М.В., 2006). Изменения биоритмов (лабильность) под влиянием каких-либо факторов являются частью приспособительных реакций, выражающихся в том, что система, реагируя на изменение существенных для нее параметров и факторов среды, перестраивает, изменяет свои структурные связи для сохранения функций, обеспечивающих ее существование как целого в изменившейся среде (Воложин А.И., 1987; Комаров Ф.И., 1989; Романов Ю.А., 2005; Маркина В.В., 2008; Смирнов С.Н., 2008).
Однако данных о влиянии на суточные биоритмы бактерий крайне мало. Поэтому мы изучили влияние дезинфектантов и антибиотиков на биоритмы пролиферативной и плазмокоагулазной активности S. aureus для комплексной оценки их значения в механизмах адаптации патогенов к действию стрессовых факторов. 5.1. Влияние пероксимеда на пролиферативную активность музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus
В результате влияния суббактериостатических концентраций пероксимеда на пролиферативную активность музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus в течение суток обнаружено, что суточная динамика роста музейных штаммов S. aureus под действием пероксимеда отличалась от контрольных значений, т.е. динамики пролиферативной активности без воздействия дезинфектанта (табл. 9). Существенно снижалось среднесуточное значение показателя численности (ОМЧ) музейного штамма S. aureus 25923 и S. aureus 209-Р под влиянием пероксимеда (W = 34; 36, соответственно, р 0,05). У штамма 25923 сохранялся профиль циркадианного ритма, но увеличился его вклад, сдвигалась акрофаза с 17.00 на 14.00 часов, появлялся достоверный максимум роста на 8.00 часов, а в вечерние и ночные часы (17.00 - 2.00 часа) наблюдалась минимальная пролиферативная активность (в контроле в это время отмечалось увеличение численности бактерий), т.е. наблюдалась асинхронность ритма (рис. 18). У штамма 209-Р появлялся достоверный ультрадианный ритм (вклад 29,5%, р 0,05) с максимумами в 5.00 и 17.00 часов. Напротив, в 8.00 и 14.00 часов наблюдалась минимальная пролиферативная активность, а циркадианный ритм становился не достоверным (р 0,05), амплитуда его резко снижалась. Сравнительный анализ показал обратную корреляцию между профилем ритма до и после воздействия пероксимедом (25923 - г = -0,54; 209-Р — г = -0,64; при р 0,05).
Следовательно, у музейных штаммов на основании изменения всех ритмометрических параметров выявлен десинхроноз ритма. Отмечено, что в период максимальной пролиферативной активности суббактериостатические концентрации пероксимеда более эффективно воздействовали на музейные штаммы S. aureus, снижая их численность, чем в период минимальных показателей ОМЧ.
Влияние пероксимеда на плазмокоагулазную активность музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus
Выявлена суточная динамика чувствительности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus к пероксимеду, хлорамину. МІЖ хлорамина - 0,19% по отношению к музейному штамму S. aureus определена в 2.00 и 23.00 часа, к госпитальному изоляту S. aureus - в 2.00 часа; МІЖ пероксимеда зарегистрирована в 11.00 часов для музейного штамма, в 23.00 часа - для госпитального изолята S. aureus.
Таким образом, различная чувствительность S. aureus к антибиотикам и дезинфектантам в течение суток может иметь значение, как для идентификации штаммов, так и для дальнейших исследований по осуществлению рациональной антибиотикотерапии и проведению дезинфекционных мероприятий. Факт выявления периодов резистентности к некоторым антибиотикам музейного штамма S. aureus может рассматриваться как потенциальная способность патогена к формированию резистентности к этим препаратам.
Доказано, что при взаимодействии микроорганизмов с различными стрессовыми факторами (антисептики, метаболиты, алкилоксибензолы и др.), возможны изменения численности популяции, факторов патогенности, стрессоустойчивости (Красильников А.П., 1994; Сузина Н.Е., 2001; Эль-Регистан Г.И., 2001; Ильинская О.Н., 2002; Бухарин О.В., Сгибнев А.В., 2002; Иванова Е.Б., 2004). В нашей работе мы предприняли попытку исследовать влияние антимикробных препаратов (пероксимед, гентамицин, ванкомицин) на биоритмы пролиферативной и плазмокоагулазной активности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus.
Под влиянием пероксимеда (концентрация 0,5%) в структуре биоритмов микробов происходили изменения ритмометрических показателей. У музейных штаммов S. aureus наблюдалось достоверное снижение среднесуточного значения пролиферативной активности (W = 34, р 0,05).
Менялся профиль биоритма: для музейного штамма 209-Р становился характерным только ультрадианный (в контроле до воздействия пероксимеда у музейных штаммов присутствовал только достоверный циркадианныи ритм). Отмечено снижение амплитуды. Также у этих штаммов наблюдалось смещение акрофазы у штамма 25923 с 17.00 на 9.00 часов, у штамма 209-Р с 20.00 на 00.00 часов. Следовательно, на основании изменения всех ритмометрических параметров, существенном смещении акрофаз (асинхронности), вплоть до противофазности, у музейных штаммов выявлен десинхроноз ритма. Сравнительный анализ показал обратную корреляцию между ритмом пролиферативной активностью до и после воздействия пероксимедом (25923 - г = -0,54; 209-Р - г = -0,64; при р 0,05). В период максимальной пролиферативной активности суббактериостатические концентрации пероксимеда более эффективно воздействовали на музейные штаммы S. aureus, снижая их численность.
На основании проведенных исследований установлено, что под действием пероксимеда также происходило снижение среднесуточных значений показателей пролиферативной активности госпитальных изолятов S. aureus 2888 и 2891 (W = 36, р 0,05). Профили ритмов остались без изменений. У штамма S. aureus 2891 в 2.00 часа наблюдалась минимальная численность бактерий, до воздействия пероксимеда в этой точке наблюдалось увеличение количества микроорганизмов. У госпитального изолята 2888 появлялся достоверный циркадианныи (вклад 17,3%, р 0,05) и ультрадианный ритм (41,9%, р 0,05) по сравнению с контролем, где достоверным был ультрадианный ритм, с 8-ми часовой гармоникой (вклад 74,6%, р 0,05). Отмечались два выраженных достоверных пика пролиферативной активности — в 5.00 и 17.00 часов.
При 30 мин экспозиции культур с 1% раствором пероксимеда музейный штамм S. aureus 25923 приобретал достоверный ультрадианный ритм с акрофазами в 14.00 и 20.00 часов, по сравнению с контролем, с сильным увеличением амплитуды ритма, что может свидетельствовать об усилении адаптивного напряжения данного штамма. В 17.00 часов отмечено резкое снижение пролиферативной активности (в контроле в 17.00 часов — максимальная пролиферативная активность), т.е. наблюдалась инверсия ритма. При 60 мин экспозиции профиль ритма нивелировался, мезор снижался, в некоторых точках роста культуры не было. Следовательно, 1% раствор пероксимеда при 60 мин экспозиции оказывался губительным для музейного штамма S. aureus. Госпитальный изолят S. aureus 2305 характеризовался максимальным увеличением пролиферативной активности в утреннее время - 8.00 и 11.00 часов до воздействия пероксимедом. После воздействия 1% раствора пероксимеда отмечено снижение пролиферативной активности в это время. Госпитальный изолят S. aureus не отличался достоверными изменениями профиля ритма как при 30 мин, так и при 60 мин экспозиции с 1% раствором пероксимеда. Достоверно снижался только мезор.
Таким образом, под действием пероксимеда в структуре биоритмов пролиферативной активности микроорганизмов, как музейных штаммов, так и госпитальных изолятов происходили изменения, определяющие реакцию биологических объектов на влияние стрессовых факторов окружающей среды. Госпитальные изоляты менее чувствительны к пероксимеду, так как под влиянием дезинфектанта в структуре их биоритмов зарегистрировано только достоверное снижение мезора.
Влияние суббактериостатической концентрации пероксимеда на плазмокоагулазную активность проявлялось у музейных штаммов S. aureus увеличением времени коагуляции плазмы после 15-ти и 30-ти минутной экспозиции с дезинфектантом (W = -30; -36, р 0,05), смещением акрофаз, увеличением вклада циркадианного ритма и амплитуды, что свидетельствует об адаптивном напряжении изучаемых штаммов S. aureus.
