Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .36
1.1.Основные возбудители гнойного бактериального менингита .36
1.1.1.Streptococcus pneumoniae. Факторы патогенности, фенотипы 36
1.1.2. Neisseria meningitidis. Факторы патогенности, фенотипы .39
1.1.3. Haemophilus influenzae. Факторы патогенности, фенотипы 41
1.2.Устойчивость основных возбудителей гнойного бактериального менингита к антибиотикам .42
1.3. Лабораторная диагностика гнойного бактериального менингита .45
1.4. Вакцинопрофилактика .54
Собственные исследования .57
Глава 2. Анализ распостранения основных возбудителей гнойного бактериального менингита в станах СНГ 57
2.1.Идентификация возбудителей гнойного бактериального менингита в спинномозговой жидкости 57
2.2. Характеристика выделенных штаммов .61
ГЛАВА 3. Профили чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителей гнойного бактериального менин гита, выделеных из смж больных детей 66
3.1. Анализ антибиотикочувствительности штаммов S.pneumoniae .66
3.2. Анализ антибиотикочувствительности штаммов N. meningitidis .70
3.3. Анализ антибиотикочувствительности штаммов H.influenzae 72
ГЛАВА 4. Филогенетический анализ штаммов, выделенных из СМЖ 74
4.1. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов S.pneumoniae 74
4.2. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов N.meningitidis 75
4.3. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов H.influenzae 77
ГЛАВА 5. Сравнительый анализ штаммов s. pneumoniae, вызыва ющих инвазивные и неинвазивные формы инфекций 79
ГЛАВА 6. Алгоритма идентификации возбудителей гнойного бактериального менингита .83
Заключение 85
Выводы 93
Практические рекомендации 94
Преспективы дальнейшей разработки темы 94 список сокращений .95
Список литературы
- Neisseria meningitidis. Факторы патогенности, фенотипы
- Характеристика выделенных штаммов
- Анализ антибиотикочувствительности штаммов N. meningitidis
- Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов N.meningitidis
Введение к работе
Актуальность проблемы
Гнойный бактериальный менингит (ГБМ), как форма инфекционной нейропа-тологии, занимает важное место в структуре заболеваний нервной системы и остается одной из причин летальности и инвалидизации больных. Ведущими возбудителями данного заболевания являются Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae тип b (Hib) (Сорокина М.Н. и др., 2003; Королева И.С., 2004). Ежегодно в мире, по расчетным данным, регистрируется более 1,2 миллиона случаев бактериальных менингитов (WHO Vaccine Preventable Diseases Monitoring System, 2010)
Для идентификации N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae широко используются микробиологические методы: бактериологический, микроскопический, иммунохимический (реакция латекс-агглютинации). Хотя бактериологический метод и принято считать золотым стандартом для подтверждения случаев заболевания в условиях клиники, уровень положительных результатов этого исследования относительно низкий по причине несоблюдения оптимальных условий хранения и транспортировки материала, и/или проведения антибактериальной терапии до взятия клинического материала, а учет результатов реакции латекс-агглютинации носит субъективный характер и может быть сложным для интерпретации (Королева И.С. , 2004; Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae, 2011). Поэтому, в последние годы для диагностики основных возбудителей гнойного бактериального менингита широко применяются молекулярные методы, в частности, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который находит широкое применение благодаря своей высокой чувствительности, специфичности и большей производительности (Carvalho M. G. et all, 2007; Maroufi Y., 2007; Mothershed E. A., 2004).
Определение серотипового и серогруппового пейзажа N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae играет важную роль при внедрении вакцин, необходимых для профилактики гнойных бактериальных менингитов (WHO Vaccine Preventable Diseases Monitoring System, 2010). Для полноценного эпидемиологического надзора за N. meningitidis, H. influenzae и S. pneumoniae необходимы данные, которые позволяют проанализировать популяцию возбудителей (Brehony C., 2007). Данные об эволюции и закономерностях распространения патогенных бактерий, полученные с помощью метода мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ), наиболее информативны, так как позволяют находить генетическую связь между штаммами и оценивать степень филогенетического родства возбудителей, а также дают представление о их географическом распространении (Лукашов В.В., 2009; Brehony C., 2007; Selender R. K., 1987).
Своевременная и адекватная антибиотикотерапия гнойного бактериального менингита позволяет снизить смертность и инвалидизацию пациентов (Королева И.С., 2007; Mortensen, J. E., 2006). Однако, лечение данного заболевания может быть неэффективными вследствие пониженной чувствительности к антибактериальным препаратам (АБП) штаммов N. meningitidis, H. influenzae и S. pneumoniae. Трудности в оценке антибиотикорезистентности культур обуславливают необходимость использования молекулярно-генетических методов для выявления маркеров, определяющих устойчивость к антибиотикам (Chiba N. et all, 2011).
В ряде стран, входящих в состав содружества независимых государств (СНГ), для идентификации S.pneumoniae, N.meningitidis, H.influenzae в лабораториях используются, в основном, бактериологические и иммунохимические методы, нет полноценной картины о распространении на этих территориях возбудителей гнойного бактериального менингита.
Актуальность работы заключается в необходимости всестороннего изучения циркулирующих штаммов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae, вызывающих гнойный бактериальный менингит у детей в странах СНГ.
Степень разработанности темы исследования
Гнойный бактериальный менингит по-прежнему остается серьезной проблемой здравоохранения, поэтому необходимо внедрение новых вакцин против возбудителей данного заболевания (WHO Vaccine Preventable Diseases Monitoring System, 2010). Для введения вакцинации проводится мониторинг циркулирующих штаммов. Исследование возбудителей на пост-вакцинальном этапе необходимо для выявления серогрупповых/серотиповых замен в структуре циркулирующих штаммов (Платонов А.Е., 2011). В современных условиях использование молекулярно-генетических методов, совместно с классическими бактериологическими методами, позволяет провести всесторонние наблюдения за возбудителями, определить детерминанты, отвечающие за устойчивость к антибактериальным препаратам, расшифровать природу их устойчивости (Платонов А.Е., 2011). В России мониторингом циркулирующих возбудителей гнойного бактериального менингита с использованием как классических бактериологических, так и современных молекулярно-генетических методов занимается ряд исследователей (Козлов Р.С., 2005; Королева И.С., 2013; Мирнов К.О., 2011; Платонов А.Е , 2011; Савинова Т.А., 2011). Однако работ, посвященных изучению возбудителей гнойного бактериального менингита в странах СНГ, нет. Остается невыясненным состав доминирующих штаммов, их антибиотикорезистентность и филогенетические отношения. Данные исследования являются актуальными для Российской Федерации, в связи с ее географическим расположением и активной миграцией населения из стран СНГ.
Цель исследования
Провести микробиологический и молекулярно-генетический скрининг образцов СМЖ и штаммов из ликвора и носоглотки, полученных от детей, больных гнойным бактериальным менингитом, для оценки фенотипических, молекулярно-генетических и филогенетических свойств S. pneumoniae, N. meningitidis и H.influenzae.
Задачи исследования
1. Провести мониторинг циркуляции N. meningitidis, S. pneumoniae и H.
influenzae в странах СНГ. Определить их серогрупповую и серотиповую принадлеж
ность.
2. Оценить уровень фенотипической антибиотикочувствительности штаммов N.
meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae. Выявить наличие изменений в генах
pbp1a, pbp2x и pbp2b, обуславливающих снижение чувствительности к пенициллину,
и наличие генов mefA и ermB, ответственных за устойчивость к макролидам, у штаммов S. pneumoniae.
3. Определить доминирующие сиквенс-типы и клональные комплексы штаммов S. pneumoniae, N. meningitidis и H. influenzae, циркулирующих в странах СНГ, провести анализ филогенетического родства с построением дендрограмм.
4. Установить степень филогенетического родства между штаммами S. pneumoniae, выделенными из СМЖ и со слизистой носоглотки.
5. Разработать алгоритм идентификации возбудителей гнойного бактериального менингита.
Научная новизна
1. Впервые охарактеризована популяционная структура штаммов S.
pneumoniae, N. meningitidis и H. influenzae, вызывающих гнойный бактериальный ме
нингит у детей в странах СНГ с помощью метода мультилокусного сиквенс-
типирования (МЛСТ). Выявлено, что штаммы S.pneumoniae относились к сиквенс-
типам СТ 239, 246, 2436, 473, а также СТ 230 и СТ 1176, в которые вошли штаммы,
устойчивые к пенициллину, N.meningitidis - к клональному комплексу ST-11
complex/ET-37 complex и H. influenzae - к клональному комплексу А1/А2.
2. Проведено молекулярно-генетическое исследование детерминант антибио-
тикорезистентности S. pneumoniae и показано, что устойчивость к пенициллину у S.
pneumoniae связана с изменениями в генах, кодирующих чувствительность к пени
циллину, а устойчивость к эритромицину обусловлена приобретением соответству
ющих островков патогенности (генов резистентности к антибиотикам).
3. Впервые идентифицированы два новых сиквенс-типа N.meningitidis CT-10735
и СТ- 10736, которые размещены в международной базе Neisseria PubMLST под
идентификационными номерами 28790
и 28791 что способ
ствует повышению эффективности эпидемиологического надзора за менингококко-
вой инфекцией.
4. Разработанный алгоритм идентификации возбудителей гнойного бакте
риального менингита позволяет сделать заключение о клинической значимости воз
будителя в инфекционном процессе и оптимизировать лечебно-профилактические
мероприятия.
Теоретическая и практическая значимость работы
Предложенный алгоритм идентификации инвазивных и неинвазивных штаммов с применением классических бактериологических и молекулярно-генетических методов позволит оценить патогенетическую значимость различных возбудителей гнойного бактериального менингита в инфекционном процессе.
Сведения о составе и распределении серогруппового/серотипового пейзажа N.meningitidis, S.pneumoniae и H. influenzae в странах СНГ дают возможность обосновать введение в национальный календарь прививок вакцин против данных возбудителей.
Данные о наличии антибиотикорезистентности у штаммов S.pneumoniae и N.meningitidis могут быть использованы для оптимизации антибиотикотерапии гнойных бактериальных менингитов в странах СНГ.
Создан банк ДНК N.meningitidis, S.pneumoniae, H.influenzae для дальнейших исследований, определения генетической структуры (сиквенс-типы) и определения антибиотикорезистентности, связанной с генетическими изменениями циркулирующих патогенов.
Результаты исследований и разработок внедрены в научно-исследовательскую работу лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (Акт внедрения от 24 июля 2014 г.)
Оптимизированные молекулярно-генетические методы типирования основных возбудителей гнойного бактериального менингита используются в Региональном ре-ференс-центре по инвазивным бактериальным заболеваниям, управляемым вакцинацией (РРЛ по ИБЗ), Европейского Регионального Бюро Всемирной Организации Здравоохранения (ЕРБ ВОЗ) при проведении мониторинга за основными возбудителями гнойных бактериальных менингитов в странах СНГ. Результаты проведенных исследований размещены в базе данных ВОЗ и включены в ежегодно издаваемые бюллетени по наблюдению за возбудителями гнойных бактериальных менингитов в Европейском регионе ВОЗ.
Методология и методы и исследования
Методология данной работы спланирована согласно поставленной цели. Ос
новными объектами исследования стали фенотипические, молекулярно-генетические
и филогенетические свойства циркулирующих штаммов, вызывающих ГБМ. Научная
литература, посвящённая проблеме основных свойств S.pneumoniae, N.meningitidis и
H.influenzae, была проанализирована формально-логическими методами исследова
ния. Предметом исследования явились штаммы S.pneumoniae, N.meningitidis и
H.influenzae, выделенные из спинномозговой жидкости (СМЖ) детей больных ГБМ. В
работе использованы бактериологические, иммунохимические и молекулярно-
генетические методы исследования.
Материалы и методы исследований
Результаты диссертационной работы основаны на лабораторном
исследовании 810 образцов СМЖ и 33 клинических штаммов, выделенных из СМЖ, взятой у детей в возрасте от 1 месяца до 59 месяцев и 29 дней, поступивших в дозорные госпиталя с подозрением на менингит. СМЖ и клинические штаммы поступали из следующих стран: Азербайджан, Армения, Грузия, Белоруссия, Узбекистан и Украина за период 2007-2013 г.г. Для сравнения с клиническими штаммами S.pneumoniae, выделенными из СМЖ детей в странах СНГ, были взяты 5 клинических штаммов из СМЖ и 9 клинических штаммов, выделенных со слизистой носоглотки у пациентов клинико-диагностического центра ФБУН МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора.
Бактериологические методы. Для видовой идентификации полученные штаммы засевали на кровяной и «шоколадный» агар (Oxoid, Великобритания), тер-мостатировали в течение 24-48 часов при 370С в атмосфере с ~5% CO2 и идентифицировали с использованием микроскопических, бактериологических и биохимических методов ( «Лабораторные методы диагностики бактериальных менингитов, вы-6
званных Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae. Пособие ВОЗ, 2-е издание», 2011г.).
Серологические методы. Для серологического типирования штаммов H.influenzae, N.meningitidis применяли коммерческие тест системы Pastorex meningit-idis Latex kit (Biorad, США), индивидуальные антисыворотки к N. meningitdis (BD, США). Серотипирование штаммов S.pneumoniae проводили с помощью коммерческого набора Pneumotest Latex kit (SSI, Дания) и реакции набухания капсулы (проба Нейфельда) с использованием индивидуальных антисывороток (SSI, Дания). Постановку реакций и оценку результатов проводили в соответствии с инструкциями производителей.
Определение чувствительности культур S.pneumoniae, N.meningitidis и
H.influenzae к антибиотикам проводили с помощью диско-диффузионного метода
Кирби-Бауэра (ДДМ) и определения минимальной ингибирующей концентрации
(МИК) с использованием тест-полосок «E-test», содержащими антимикробные пре
параты («Oxoid», Великобритания): пенициллин, ампициллин, цефотаксим, ципро-
флоксацин, хлорамфеникол, эритромицин, ванкомицин, триметро-
пим/сульфаметоксазол. Оценку чувствительности микроорганизмов осуществляли
согласно МУК 4.2. 1890-04 и стандартам, рекомендуемым Институтом клинических
и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standarts Institute, CLSI, США).
Для выявлявления продукции -лактамаз у штаммов H. influenzae использовали экс
пресс-тест с нитроцифином (Oxoid, Великобритания), результат оценивали согласно
инструкции производителя.
Молекулярно-генетические методы исследования. Экстракцию ДНК из
СМЖ осуществляли с помощью коммерческого набора для выделения ДНК QIAmp
DNA Mini Kit (Qiagen, США), согласно протоколу с частичной модификацией
(Carvalho M. G.et all, 2007). Экстракцию хромосомальной ДНК из культур
N.meningitidis и H. Influenzae осуществляли методом кипячения, согласно общепринятому протоколу (Маниатис Т.,1984). Для экстракции хромосомальной ДНК из культур S.pneumoniae использовали дополнительный ферментативный лизис. Для приготовления ферментативного буфера в 50 мкл Трис буфера (pH 8,0) добавляли 10 мкл мутанолизина (3000 Ед/мл) (Sigma, США) и 8 мкл гиалуронидазы (30 мг/мл) (Sigma, США). 18-24 часовую культуру клеток S. pneumoniae, выросшую на кровяном агаре, вносили в 0,85% раствор NaCl до получения суспензии, сопоставимой со стандартом 3,0 по МакФарланду, и инкубировали при 700С в течение 15 минут. Затем, пробирки с суспензией центрифугировали при 12000 об/мин в течение 2 минут, после чего сливали супернатант, а осадок ресуспензировали в 50 мкл ферментативного буфера, пробирки с буфером инкубировали при 370С в течение 30 минут, затем кипятили содержимое при 1000С 10 минут, пробирки с суспензией центрифугировали при 13000 об/мин в течение 3 минут (Carvalho M. G. et all, 2007).
Видовую детекцию N.meningitidis, H. influenzae и S. pneumoniae осуществляли с помощью метода ПЦР РВ. Использовали последовательности праймеров и флуоресцентно меченные зонды, рекомендованные согласно руководству «Лабораторные методы диагностики бактериальных менингитов, вызванных Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae. Пособие ВОЗ, 2-е издание» (2011г.). Амплификацию с детекцией в режиме реального времени проводили в ам-плификаторе ABI 7500 (Applied Biosystems, США). Для определения серотипа
S.pneumoniae применяли метод мультиплексной ПЦР (мПЦР), согласно схемам и
протоколам, представленным на веб сайте CDC, Атланта, США
.
Определение генетической чувствительности к пенициллину и генетической резистентности к макролидам штаммов S. pneumoniae проводили с помощью ПЦР РВ с использованием праймеров и флуоресцентно меченных зондов, рекомендованных Chiba N et all., 2011.
Мультилокусное сиквенс типирование. Последовательность праймеров для
амплификации и секвенирования генов «домашнего хозяйства», протоколы амплифи
кации и реакции секвенирования использовали согласно рекомендациям базы данных
S.pneumoniae MLST
net/), Neisseria PubMLST . Опреде
ление нуклеотидной последовательности фрагментов проводили модифицированным
методом Сенгера на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems, США) с использованием набора реагентов для
секвенирования BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), согласно рекомендациям производителя. Исследования проводились на базе ЗАО «ПИННИ» («Постгеномные и нанотехнологические инновации», CJSC «PYNNY» Инновационного центра медицинских нанобиотехнологий ГУ НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, г. Москва).
Статистическая обработка, анализ данных и программное обеспечение.
Статистическую обработку полученных данных проводили, применяя стандартный пакет статистических программ Microsoft Excel 2007. Для сравнения качественных признаков между исследуемыми группами использовали критерий хи-квадрат (2) (Винник А.Л., 1991; Гланц С., 1998). Результаты секвенирования, полученные в формате хроматограммы, обрабатывали в программе CromasLite, секвенированные последовательности сопоставляли с международной on-line базой MLST
. Для определения клональности исследуемых штаммов использовали алгоритм eBURSTv3, интегрированный в МЛСТ вебсайт (). С использованием программы «Vector NTI Suite v. 9» проводили склеивание полученных нуклеотидных последовательностей. Выравнивание последовательностей осуществляли с помощью сервиса BLAST. Построение филогенетической дендрограммы осуществляли методом присоединённых соседей (Neigbor joining –NJ) с использованием программного обеспечения MEGA 5.0 (Tamura K., 2011).
Личное участие автора в получении результатов.
Личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации, заключалось в выполнении молекулярно-генетических исследований (ПЦР РВ, мПЦР), в обработке и анализе данных секвенирования, проведении биоинформационного анализа полученных данных, теоретическом обобщение результатов, статистической обработка данных. Бактериологические исследования проводились совместно с сотрудниками лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора: ведущим научным сотрудником Егоровой Е.А., младшим научным сотрудником Оганесяном А.Н.
Положения, выносимые на защиту.
1. Для выявления и определения серогрупп и серотипов N. meningitidis, S.
pneumoniae и H. influenzae в спинномозговой жидкости целесообразно использовать
молекулярно-генетические и бактериологические методы.
-
Среди циркулирующих штаммов N. meningitidis, H. influenzae и S. рneumoniae в странах СНГ механизмы антибиотикорезистентности определялись видовыми особенностями возбудителей.
-
Исследуемые штаммы N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae принадлежат к широко распространённым сиквенс-типам и клональных комплексам.
4. Филогенетический анализ позволил установить определённую связь между
штаммами S. pneumoniae, выделенными из спинномозговой жидкости и со слизи
стой носоглотки.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
О достоверности полученных результатов работы свидетельствует достаточный объем выборки анализируемых образцов (810 образцов СМЖ и 47 клинических штаммов), использование сертифицированных бактериологических, иммунохимиче-ских и молекулярно-генетических методов, которые характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Комплексное бактериологическое, иммунохимиче-ское и молекулярно-генетическое исследование клинических штаммов позволило получить сопоставимые данные, что свидетельствует о достоверности полученных результатах.
Диссертация апробирована на заседании секции Учёного Совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (протокол № 2 от 22 мая 2014г.).
Результаты диссертационной работы представлены, доложены и обсуждены на The 29th Annual Meeting of the European society for pediatric infectious diseases, 7-11 June, 2011, Hague, Netherlands; The 4th Congress of Europen Microbiologist , June 26-30, 2011, Geneva, Switzerland; The 27th International Congress of Pediatrics 2013 (ICP), August 24-29, 2013, Melbourne, Australia; на VI ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 24-26 марта, 2014.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 – в рецензируемых изданиях, 6 – в сборниках материалов конференций.
Структура и объем и диссертации. Диссертация изложена на 117 странице печатного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, заключение, выводы, практические рекомендации, перспективы дальнейшей разработки темы. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками и 23 таблицами. В библиографическом указателе приведен 188 источник, из них 47 –на русском и 141 – на иностранном языках.
Neisseria meningitidis. Факторы патогенности, фенотипы
1. Впервые охарактеризована популяционная структура штаммов S. pneumoniae, N. meningitidis и H. influenzae, вызывающих гнойный бактериальный менингит у детей в странах СНГ с помощью метода мультилокусного сиквенс типирования (МЛСТ). Выявлено, что штаммы S.pneumoniae относились к сиквенс-типам СТ 239, 246, 2436, 473, а также СТ 230 и СТ 1176, в которые во шли штаммы, устойчивые к пенициллину, N.meningitidis - к клональному ком плексу ST-11 complex/ET-37 complex и H. influenzae - к клональному комплексу А1/А2.
2. Проведено молекулярно-генетическое исследование детерминант анти биотикорезистентности S. pneumoniae и показано, что устойчивость к пеницилли ну у S. pneumoniae связана с изменениями в генах, кодирующих чувствительность к пенициллину, а устойчивость к эритромицину обусловлена приобретением соответствующих островков патогенности (генов резистентности к антибиотикам).
3. Впервые идентифицированы два новых сиквенс-типа N.meningitidis CT 10735 и СТ- 10736, которые размещены в международной базе Neisseria Pub MLST под идентификационными номерами 28790 (http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?page=profileInfo&db=pubmlst_neisseria_seqd ef&scheme_id=1&profile_id=10735) и 28791 (http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?page =profileInfo&db=pubmlst_neisseria_seqdef&scheme_id=1&profile_id=1073, что способствует повышению эффективности эпидемиологического надзора за менин-гококковой инфекцией.
4. Разработанный алгоритм идентификации возбудителей гнойного бак териального менингита позволяет сделать заключение о клинической значимо сти возбудителя в инфекционном процессе и оптимизировать лечебно профилактические мероприятия.
Теоритическая и практическая значимость работы
Предложенный алгоритм идентификации инвазивных и неинвазивных штаммов с применением классических бактериологических и молекулярно-генетических методов позволит оценить патогенетическую значимость различных возбудителей гнойного бактериального менингита в инфекционном процессе.
Сведения о составе и распределении серогруппового/серотипового пейзажа N.meningitidis, S.pneumoniae и H. influenzae в странах СНГ дают возможность обосновать введение в национальный календарь прививок вакцин против данных возбудителей.
Данные о наличии антибиотикорезистентности у штаммов S.pneumoniae и N.meningitidis могут быть использованы для оптимизации антибиотикотерапии гнойных бактериальных менингитов в странах СНГ.
Создан банк ДНК N.meningitidis, S.pneumoniae, H.influenzae для дальнейших исследований, определения генетической структуры (сиквенс-типы) и опре 9 деления антибиотикорезистентности, связанной с генетическими изменениями циркулирующих патогенов.
Результаты исследований и разработок внедрены в научно исследовательскую работу лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (Акт внедрения от 24 июля 2014 г.)
Оптимизированные молекулярно-генетические методы типирования основных возбудителей гнойного бактериального менингита используются в Региональном референс-центре по инвазивным бактериальным заболеваниям, управляемым вакцинацией (РРЛ по ИБЗ), Европейского Регионального Бюро Всемирной Организации Здравоохранения (ЕРБ ВОЗ) при проведении мониторинга за основными возбудителями гнойных бактериальных менингитов в странах СНГ. Результаты проведенных исследований размещены в базе данных ВОЗ и включены в ежегодно издаваемые бюллетени по наблюдению за возбудителями гнойных бактериальных менингитов в Европейском регионе ВОЗ.
Методология и методы исследования Методология данной работы спланирована согласно поставленной цели.
Основными объектами исследования стали фенотипические, молекулярно генетические и филогенетические свойства циркулирующих штаммов, вызывающих ГБМ. Научная литература, посвящённая проблеме основных свойств S.pneumoniae, N.meningitidis и H.influenzae была проанализирована формальнологическими методами исследования. Предметом исследования явились штаммы S.pneumoniae, N.meningitidis и H.influenzae, выделенные из спинномозговой жидкости (СМЖ) детей больных ГБМ. В работе были использованы бактериологические, иммунохимические и молекулярно-генетические методы исследования.
Материалы исследования
Результаты диссертационной работы основаны на лабораторном исследовании 810 образцов СМЖ и 33 клинических штаммов, выделенных из СМЖ, взятой у детей в возрасте от 1 месяца до 59 месяцев и 29 дней, поступивших в дозорные госпиталя с подозрением на менингит. СМЖ и клинические штаммы поступали из следующих стран: Азербайджан, Армения, Грузия, Белоруссия, Узбекистан и Украина за период 2007-2013 гг. Для сравнения с клиническими штаммами S.pneumoniae, выделенных из СМЖ детей из стран СНГ были взяты 5 клинических штаммов из СМЖ и 9 клинических штаммов, выделенных со слизистой носоглотки, у пациентов клинико-диагностического центра ФБУН МНИ-ИЭМ им. Г.Н.Габричевского. Исследования с применением бактериологических, цитологических, серологических, биохимических и молекулярно-генетических методов проводились в ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребна-дзора на базе которого располагается Региональная Референс Лаборатории (РРЛ) по инвазивным бактериальным заболеваниям ЕРБ ВОЗ. Часть работы проводилась в Глобальной Референс Лаборатории (ГРЛ) по инвазивным бактериальным заболеваниям расположенной на базе Клинического Диагностического Центра (CDC) г. Атланта, США.
Характеристика выделенных штаммов
Neisseria meningitidis относится к семейству Neisseriaceae, род Neisseria. Грамотрицательные диплококки в форме кофейного зерна, располагаются как внеклеточно, так внутриклеточно. Оптимальный рост наблюдается при температуре 35-37оС в атмосфере с 5% СО2. Менингококк способен расти как на кровяном, так и на «шоколадном» агаре. На кровяном агаре N.meningitidis формирует серые непигментированные колонии, гладкие, влажные с блестящей поверхностью, выпуклые с округлой формой и идеально ровными краями. На «шоколадном» агаре N.meningitidis растет в виде крупных, от бесцветных до серых полупрозрачных колоний [32, 68, 181]. Штаммы N.meningitidis могут быть как капсу-лированные, так и некапсулированные. Капсула играет важную роль для выживания организма в крови или спинномозговой жидкости, так как обеспечивает резистентность к антителам, компонентам комплимента и препятствует фагоцитозу [68]. Капсулы основных серогрупп менингококков, ассоциируемых с инвазивны-ми заболеваниями, состоят из сиаловой кислоты, за исключением серогуппы А, капсула которой состоит из повторяющихся единиц N-ацетил-маннозамин-1-фосфата, N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac) и синтезируется из N-ацетилманозамина (ManNAc) и фосфоенолпирувата [58]. Neu5Ac является общим компонентом всех сиаловых кислот организма человека, таким образом, включение Neu5Ac в капсулу позволяет капсулярным менингококкам становиться незаметным для иммунной системы организма хозяина [83, 107]. Яркий пример представляет собой капсула серогруппы В, в которой A (2–8)- связывающий сиаловую кислоту гомополимер, идентичен гомополимеру в нервных клетках человека, тем самым обеспечивая слабый иммунный ответ против данного серотипа [71, 188]. На основании различий в химическом составе капсулярных полисаха-ридных антигенов вид N.meningitidis разделяют на следующие серогруппы: A, B, C, D, X, Y, Z, W135, 29E, H, I, K, L. С менингококковыми инфекциями наиболее часто связаны серогруппы A, B, C, X, Y, W135 [28, 31].
Кроме полисахаридной капсулы вирулентными факторами N.meningitidis являются поверхностный адгезивный белок, наружные мембранные белки, пили, порины – PorA и PorB, адгезивные молекулы Opa и Орс [84, 88, 120].
Менингококки имеют пили, представляющие собой полифункциональные и изменчивые органеллы. Пили состоят из весьма изменчивого белка – пилина. Пили играют ключевую роль в дебюте каждого этапа патогенеза менингококко вой инфекции [101] . Именно они в большей степени обеспечивают прочное прикрепление клеток менингококка к эпителию и эндотелию [31.] Без адге зии попавшие на слизистую бактериальные клетки будут удалены за счет меха низмов мукоцилиарного клиренса [105]. Пили способствуют и сцеплению кле ток менингококка друг с другом, что проявляется у бескапсульных штаммов в виде спонтанной агглютинации [42, 72, 104]. Белки-порины, способствуют адге зии и инвазии менингококков, блокируют также функцию фагоцитов [169].
Белок Por В имеет структурно-функциональную гомологию с анионными по ринами митохондрий эукариотической клетки, оба пориновых белка (А и В) способны связывать пуриннуклеозидтрифосфаты, регулируя размер и селектив 41 ность пор клетки хозяина [87, 115]. Так же белки Por А и Por В характеризуются и высокой иммуногенностью, индуцируя синтез бактерицидных антител и опсонинов. Благодаря этим свойствам они могут быть использованы в качестве компонентов будущей менингококковой вакцины [31, 32, 43].
Ора В и Ора D-белки способствуют адгезии к эпителию и эндотелию макроорганизма. Орс-белок (инвазин) ответственен за инвагинацию менингококков в клеточную стенку и дальнейшую пенетрацию внутрь клетки [65]. В развитии последней, участвуют также два белка хозяина: сывороточный (гепаринс-вязывающий гликопротеин) и витронектин из семейства интегринов. Образовавшийся «тройной комплекс» (белок Орс + витронектин +гепарин) способствует распространению и диссеминации патогена через клетки в подслизистый слой [8, 65]. Для N.meningitidis так же характерен горизонтальный перенос генов, антигенные вариации, «молекулярная» мимикрия, позволяющая организму успешно адаптироваться на слизистой оболочке [165].
Анализ антибиотикочувствительности штаммов N. meningitidis
В результате исследования штаммов N.meningitidis было выявлено, что 33,33% (n=3) исследуемых штаммов были резистентные к пенициллину. Данные штаммы обладали устойчивостью к пенициллину в концентрации 1,5 мг/л - 67% (n=2) и 2 мг/л - 33% (n=1). Оставшиеся 66,6% исследуемых штаммов N.meningitidis были чувствительны к пенициллину. МИК составила 0,06 мкг/мл - 50% (n=3) исследуемых штаммов , 0,045 мкг/мл - 33,4% (n=2); 0,008 мкг/мл -16,6 % (n=1) штаммов (таблица 17).
К цефотаксиму были чувствительны 88,8% исследуемых штаммов менингококков. У 37,5% (n=3) штаммов N.meningitidis МИК составляла 0,012 мкг/мл, 12,5% (n=2) имели МИК 0,09 мкг/мл, 25% (n=2) - 0,023 мкг/мл, 25% исследуемых штаммов имели МИК 0,045 мкг/мл у 25% штаммов менингококков. Резистентность к цефотаксиму с МИК 12 мкг/мл наблюдалось у 11,2 % (n=1) исследуемых штаммов. Чувствительность к ципрофлоксацину была обнаружена у 88,8% штаммов менингококков. МИК чувствительных штаммов составила 0,004 мкг/мл, 0,003 мкг/мл, 002 мкг/мл у 25% (n=2), 25% (n=2) и 50% (n=4),соответственно. Устойчивость к ципрофлаксацину с МИК 0,5 мкг/мл наблюдалась у 11,2% (n=1) исследуемых штаммов. Таким образом, 33,3% исследуемых штаммов менингококков были пенициллин резистентными. В ходе исследования был обнаружен мультирезистент-ный штамм N.meningitidis к пенициллину, цефотаксиму, сульфаметоксазолу, ци-профлоксацину.
Анализ антибиотикочувствительности штаммов H.influenzae Среди исследуемых штаммов H.influenzae 90,9% (n=10) штаммов были -лактомазонегативные, 9,1% (n=1) штаммов были положительные по -лактомазе. Данные были подтверждены после постановки штаммов на чувствительность к ампициллину. Оказалось, что 90,9% (n=10) штаммов H.influenzaе были чувствительны к ампициллину и имели МИК 0,18 мкг/мл - 60% (n=6); 0,25 мкг/мл -20% (n=2); 0,375 мкг/мл – 20% (n=2) и 24 мкг/мл - 9,1% (n=1) (таблица 18).
К цефотаксиму были чувствительны все исследуемые штаммы, МИК у данных штаммов составила 0,03 мкг/мл – 9% (n=1), 0,023 мкг/мл – 18,2% ( n=2) , 0,015 мкг/мл – 72,7% ( n=8). К ципрофлаксацину штаммы также были чувствительны с МИК 0,012 мкг/л и 0,008 мкг/л (таблица 17). Среди исследуемых штаммов H.influenzaе у 36,3% (n=4) наблюдалась промежуточная устойчивость к хло-рамфениколу с МИК равной 4 мкг/мл и 63,4% (n=7) исследуемых штаммов были чувствительны к данному препарату. МИК чувствительных штаммов составила 0,03 мкг/мл - 57,1% (n=4) и 0,06 мкг/мл – 42,9% (n=3) (таблица 18).
К триметоприму/сульфаметоксозолу наблюдалась промежуточная устойчивость у 36,3% (n=4) исследуемых штаммов с МИК равной 1/19 мкг/мл; 63,4% (n=7) штаммов H.influenzae были чувствительны к данному АБП и их МИК составлял 0,125/2,37 мкг/мл – 28,6% (n=3); 0,25/4,74 мкг/мл - 42,8% (n=3) и 0,5/9,5 мкг/мл - 28,6% (n=3) (таблица 18).
Таким образом, среди исследуемых штаммов H.influenzae не наблюдалось широкого распространения антибиотикорезистентности к часто применяемыми АБП. Тест на продукцию -лактомазы был положительным только у одного штамма, который обладал устойчивостью к ампициллину, что еще раз подтверди 73 ло целесообразность использования данного теста, как экспресс метода при определении антибиотикочувствительности к -лактамным антибиотикам у штаммов H.influenzae.
Примечание: СТ - сиквенс тип, гПЧ – генетическая пенициллин чувствительность, гППУ- генетическая промежуточная пенициллин устойчивость, гПУ - генетическая пенициллин устойчивость.
Генотипические и фенотипические характеристики исследуемых штаммов показали, что СТ 230 включил 2 штамма серотипа 19F, которые были гППУ, при этом изменения касались генов pbp1a-pbp2x, а МИК к пенициллину составила 1-1,5 мкг/л. СТ 473 включил в себя как пенициллин чувствительные штаммы 6А серотипа, так и гППУ штамм с изменениями в гене pbp2x, МИК которого составила 0,375 мкг/л. СТ 9 включал в себя штамм, у которого были изменения в гене pbp2x, однако, МИК составляла 0,03 мкг/л. По данным базы МЛСТ S.pneumoniae (веб сайт http://spneumoniae.mlst.net/sql/allelicprofile_choice.asp) СТ 230, СТ 473 имеют широкое распространение по всему миру, СТ 246 широко распространены на территории Японии, СТ 239 распространены в странах Восточной Европы, СТ 235 распространены в Европейском регионе, СТ 1176 в Южной Америке, Германии и США.
Для выявления родственных связей между штаммами был проведен филогенетический анализ по степени гомологии выявленных сиквенс-типов с построением дендрограммы (рисунок 12). Анализ филогенетического дерева показал, что большинство штаммов вошли в кластер I. В данный кластер были включены СТ 239, 246, 2436, 473. СТ 230 и СТ 1176, в которые вошли штаммы, имеющие изменения в ПСБ, находились на отдельных ветвях, но имели общие узлы и входили в единый кластер с выше перечисленными сиквенс типами. СТ 235 находился на отдельной ветви, что подчеркивает, его возможное более древнее эволюционное происхождение и его отличие от штаммов, входящих в кластер I.
Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов N.meningitidis
Среди исследуемых штаммов N.meningitidis 33,33% (n=3) были устойчивы к пенициллину, 1 штамм из них обладал мультирезистентностью, кроме резистентности к пенициллину у него имелась резистентность к цефатоксиму и ци-профлаксацину. Среди исследуемых штаммов H.influenzae не было широкого распространения антибиотикорезистентности.
МЛСТ анализ показал, что среди исследуемых штаммов S.pneumoniae встречались сиквенс типы 230, 246, 473 239, 2436,1176 и 235. СТ 230 имеет широкое распространение во всем мире, к данному сиквенс типу относятся различные серотипы S.pneumoniae: 19F, 19A, 14, 20, 23F, 24F. В нашем исследовании к данному сиквенс типу относились S.pneumoniae серотипа 19F. Согласно базе данных http://spneumoniae.mlst.net СТ 230 серотипа 19F был зарегистрирован в Португалии, Южной Африке, Швеции, России. К СТ 244 в настоящее время относится серотип 4. Данный сиквенс тип имеет широкое распространение в Японии, а также был зарегистрирован во Франции и Великобритании. СТ 473 включает в себя различные серотипы 6-й серогруппы: 6A, 6B, 6C. В нашем исследовании в СТ 473 вошли штаммы с серотипом 6A. Согласно базе данных данный сиквенс тип включающий серотип 6А имеет широкое распространение во всем мире, были зарегистрированы случаи в США, Австралии, Южной Африке, Греции, Франции и в других странах. В СТ 239 включены различные серотипы : 9V, 20, 22, данный сиквенс тип был зарегистрирован в Польше, России, Чехии. В нашем исследовании к данному СТ относился серотип 19F. СТ 2436 включает в себя серотип 14 и был зарегистрирован в Великобритании. СТ 1176 согласно базе данных включает в себя серотип 7F, данный сиквенс тип был зарегистрирован в США, Германии, Южной Америке. В нашем исследовании к данному сиквенс типу относился штамм серотипа 6А. В СТ 230 включены серотипы 20 и 7С. В нашем исследовании к данному сиквенс типу относился штамм с серотипом 20. Данный СТ был зарегистрирован в Испании и Польше. Выявленные сиквенс типы не входят в состав международных эпидемических клонов. Однако, филогенетический анализ показал, что СТ 239, 246, 2436, 473 находятся в тесном родстве и имеют тесную взаимосвязь с СТ 230 и СТ 1176, в которые вошли пенициллин-резистентные штаммы, в то время как СТ 235 находится на отдельной ветви ден-дограммы и вполне возможно имеет более древнее эволюционное происхождение. В России циркулирует большое количество различных сиквенс типов S.pneumoniae , такие как 81, 236, 271, 651, 315, 1500, 790,423 и другие [45]. В Российской Федерации также были обнаружены штаммы, входящие в состав инва зивных генетических международных клонов Spain 23 (ST81), Sweeden 15A - 25 (ST6), Greece 21 – 30 (ST 193), Netherlands 3 – 31(ST180). Однако они представлены в небольшом количестве и пока не способны оказывать существенного влияния на формирования популяции антибиотикорезистентных пневмококков [7]. Филогенетический анализ между штаммами вызывающими инвазивные и неинва-зивные формы инфекции показал, что между штаммами имеется тесное родство. Так в СТ 473, 320 вошли штаммы, выделенные как из СМЖ, так и со слизистой носоглотки. При этом одни и те же серотипы не всегда включены в единые сиквес типы, так, например, серотип 19F входил в состав СТ 230, 320 и 423. По литературным данным, для S.pneumoniae характерен горизонтальный перенос генов и пневмококк может изменять свой серотип, однако изменения сиквенс типа при этом не происходит [170].
Среди исследуемых штаммов N. meningitidis было обнаружено два новых сиквенс типа, не имевших клональной принадлежности. 4 штамма принадлежали к гиперэндемичному широко распространенному клональному комплексу ST-11 complex/ET-37 complex. В данный комплекс входили СТ 11, 3751, 3537. СТ 11 характеризуется тем, что является одним из наиболее часто встречаемых сиквенс типов во всем мире, в данный сиквенс тип включены серогруппы В, С, W135. В ходе исследования были найдены два новых СТ 10735 и 10736, которые были включены в базу данных Neisseria Pubmlst. Филогенетический анализ показал тесные родственные связи между сиквенс типами, входящими в КК ST-11 complex/ET-37 и новым СТ 10735, который не имел клональной принадлежности. СТ 10736, в который вошел штамм с мульти резистентностью к АБП, имел также родственную связь с образовавшимся кластером, но находился на отдельной ветви, что подчеркивает, его древнее эволюционное происхождение. В Российской Федерации так же циркулируют сиквенс типы, принадлежащие к кло-нальному комплексу ST-11 complex/ET-37 complex, но так же имеется и циркуляция других клонов, особенно КК ST-1 complex/subgroup I/II, в который входят N. meningitidis серогруппы А [37].
