Содержание к диссертации
Введение
1. Вирусные гастроэнтериты (обзор литературы) 15
1.1.Роль вирусов в этиологии ОКИ... 15
1.2. Этиологические агенты вирусных гастроэнтеритов 21
1.1.1. Аденовирусы 21
1.1.2. Астровирусы 25
1.1.3. Коронавирусы 27
1.1.4. Норовирусы. 31
1.1.5. Ротавирусы 36
1.1.6. Саповирусы 43
1.1.7. Торовирусы 46
1.1.8. Прочие кишечные вирусы 50
1.1.9. Нормальная вирусная флора кишечника человека 58
1.2. Практическая значимость дифференциальной диагностики вирусных гастроэнтеритов 60
1.4.Электронная микроскопия в диагностике вирусных гастроэнтеритов 62
1.4.1. Методы повышения чувствительности электронно-микроскопической диагностики 65
1.4.2. Адсорбция вирусных частиц 70
2. Материалы и методы 73
2.1 .Контингент обследованных пациентов 73
2.2.Электронно-микроскопическая диагностика 73
2.3. Исследование адсорбции вирусов на подложках, модифицированных полимерами 76
2.4.Иммуноферментная диагностика 79
2.5.Электрофорез ротавируснои РНК 80
2.6.Методы статистической обработки 81
3. Результаты исследований и обсуждение 82
3.3.Изучение адсорбции вирусных частиц при помощи подложек, модифицированных синтетическими полимерами 82
3.3.1. Предварительный отбор соединений 82
3.3.2. Определение коэффициентов адсорбции вирусов 83
3.3.3. Изучение эффективности применения полимеров в ЭМ-диагностике вирусных гастроэнтеритов 85
3.3.4. Обсуждение результатов 89
3.2. Электронно-микроскопические исследования фекалий госпитализированных детей 95
3.2.1. Нормальная вирусная флора кишечника 95
3.2.2. Морфологическое описание патогенных вирусов 97
3.2.3. Этиологическая структура вирусных гастроэнтеритов 104
3.2.4. Сезонное распределение вирусных гастроэнтеритов 107
3.2.5. Возрастное распределение вирусных гастроэнтеритов 111
3.2.6. Особенности клинического течения вирусных гастроэнтеритов различной этиологии 112
3.2.7. Обсуждение результатов 115
3.3.Сравнение различных методов диагностики ротавируснои инфекции 119
3.3.1. Сравнение методов ЭМ и ИФА 119
3.3.2. Определение форетипов ротавирусов 131
3.3.3. Сравнение чувствительности ЭМ и ЭФПААГ 133
3.3.4. Обсуждение результатов . 134
Заключение 138
Выводы 144
Практические рекомендации 146
Благодарности 149
Приложение
- Этиологические агенты вирусных гастроэнтеритов
- Практическая значимость дифференциальной диагностики вирусных гастроэнтеритов
- Исследование адсорбции вирусов на подложках, модифицированных полимерами
- Электронно-микроскопические исследования фекалий госпитализированных детей
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Вирусные гастроэнтериты (ВГЭ) у детей являются одной из важнейших проблем здравоохранения во всем мире Только от ротавирусных диареи умирает около 500 000 детей в год (Parashar U D et al, 2003) Второе место по этиологической значимости после ротавирусов занимают норовирусы, являющиеся наиболее распространенной причиной гастроэнтерита, связанного с употреблением контаминированных пищевых продуктов (Glass R I et al, 2000) Благодаря интенсивным исследованиям, список патогенных и условно-патогенных кишечных вирусов постоянно пополняется В настоящее время известно свыше десяти различных вирусов, вызывающих острый гастроэнтерит Некоторые из них, например, торовирусы человека были идентифицированы лишь недавно (JamiesonF В et al, 1998)
Ранняя диагностика ВГЭ имеет высокое значение при выборе оптимальных схем лечения заболевания В частности, ВГЭ не рекомендуется лечить с применением антибиотиков (Rhoads F А 1993, Rudolph J А , 1999) В связи с появлением на рынке новых противовирусных препаратов как широкого спектра действия, так и узконаправленных, точное определение этиологии заболевания приобретает все большую значимость
В настоящее время, по существу, единственным диагностическим методом, позволяющим одновременно выявить весь спектр патогенных кишечных вирусов, остается просвечивающая электронная микроскопия (ЭМ) Разнообразие этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов и их высокая изменчивость способствуют тому, что ЭМ продолжает интенсивно использоваться в крупных диагностических центрах наравне с иммуноферментным анализом (ИФА) и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (Biel SS, Gelderblom HR, 1999)
Одним из недостатков ЭМ, снижающим эффективность ее применения, является относительно низкая чувствительность метода Традиционно для увеличения чувствительности электронно-микроскопической диагностики применяют концентрирование исследуемых препаратов с помощью ультрацентрифугирования, а также сенсибилизацию подложек антителами к искомому вирусу (иммуноэлектронная микроскопия) Указанные способы однако, не лишены целого ряда недостатков Ультрацентирифугирование требует наличия дорогостоящего оборудования и связано со значительными временными затратами Для иммуноэлектронной микроскопии необходим, в свою очередь, набор сывороток ко всему спектру выявляемых вирусов, что не всегда возможно
В работе был избран оригинальный подход к увеличению чувствительности ЭМ, основанный на повышении адсорбционной способности углеродных подложек при помощи их модификации синтетическими полимерами
Другим существенным фактором, влияющим на результат электронно-микроскопической диагностики, является умение выделить характерные морфологические особенности кишечных вирусов В 1980-х годах в НИИ полиомиелитов и вирусных энцефалитов (г Москва) проводилось изучение этиологии вспышек острого гастроэнтерита с использованием ЭМ в качестве основного метода детекции (Дроздов С Г. 1983, Хаустов В И с соавт , 1989) Применялась ЭМ и в исследованиях, проводимых в те же годы в Ленинграде (Васильев Б Я с соавт, 1986, 1989, 1990, 1991) Исследования тех лет фокусировались в основном на этиологической роли ротавирусов Прочие вирусные агенты были выявлены в ряде случаев, но их роль в кишечной патологии у детей исследована недостаточно Из-за неполноты данных по этиологии ВГЭ. в отечественной литературе отсутствует морфологическое описание некоторых патогенных кишечных вирусов, в частности, торовирусов и норовирусов Поэтому важной задачей настоящего исследования было подробное изучение этиологии вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге и составление морфологического описания всех обнаруженных этиологических агентов
Для того чтобы оценить достоверность данных по этиологии ВГЭ, полученных при помощи ЭМ, необходимо было также провести сравнительное исследование по выявлению ВГЭ различными методами В настоящей работе такое исследование проведено на примере ротавирусной инфекции, выявляемой методами ЭМ, иммуноферментного анализа (ИФА) и РНК- электрофореза в полиакриламидном геле
С учетом всего вышесказанного были сформулированы следующие цепи и задачи
Цель исследования
Разработать метод повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции вирусных частиц и помощью данного метода изучить этиологию вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге
Задачи исследования: 1 Изучить адсорбцию вирусных частиц на углеродных подложках, модифицированных синтетическими полимерами
Разработать метод повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции агентов ВГЭ
Изучить этиологическую структуру и сезонное распределение ВГЭ у детей в Санкт-Петербурге
Описать особенности морфологии патогенных кишечных вирусов и характерных представителей нормальной вирусной флоры кишечника
Провести сравнительный анализ эффективности выявления ротавирусной инфекции методами ИФА и ЭМ с использованием углеродно-полимерных подложек
Научная новизна.
Разработана новая экспериментальная модель, позволяющая исследовать адсорбцию вирусных частиц при помощи подложек, модифицированных синтетическими полимерами. Впервые выявлено избирательное сродство кишечных вирусов к различным синтетическим полимерам. Впервые показано, что частицы норовирусов, саповирусов, ротавирусов и торовирусов обладают отрицательным электростатическим зарядом при нейтральных значениях рН.
В исследовании впервые было обнаружено, что адсорбционные свойства кишечного аденовируса 41 типа (Ad41) и респираторного аденовируса 5 типа (Ad5) существенно различаются. Показано, что частицы Ad5 имеют выраженный отрицательный заряд, в то время как заряд вирионов Ad41 близок к нейтральному.
Разработан оригинальный метод повышения чувствительности электронно-микроскопической диагностики, позволяющий увеличить эффективность выявления этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов на 20% - 50%. По эффективности разработанный метод не уступает концентрированию исследуемых препаратов при помощи ультрацентрифугирования, но значительно быстрее и проще последнего.
Впервые обнаружено явление декапсидации частиц ротавируса на подложках, модифицированных полимером ПДМАЭМ. Обнаруженный факт свидетельствует в пользу гипотезы, согласно которой проникновение ротавируса в клетки-мишени происходит «прямым» путем с «раздеванием» вирусных частиц непосредственно на наружной мембране (Tihova М. et al, 2001).
Расширены представления об этиологической структуре вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге. Установлена этиологическая значимость ротавирусов (46,1%), норовирусов (13,4%), торовирусов (11,5%). кишечных аденовирусов (2,3%), коронавирусов (1,2%), астровирусов (0,6%) и саповирусов (0,2%) в кишечной патологии детей, госпитализированных с диагнозом «острый гастроэнтерит». Впервые в России показано, что вторыми по значимости возбудителями острых гастроэнтеритов у детей после ротавирусов являются норовирусы.
Впервые в России выявлена существенная этиологическая значимость торовирусной инфекции. Обнаружено значительное число (6% от общего количества обследованных детей) сочетанных вирусных кишечных инфекций с участием торовирусов, что свидетельствует о возможности внутрибольничного распространения торовирусной инфекции.
Получены оригинальные электронно-микроскопические изображения патогенных вирусов и нормальной вирусной флоры кишечника. Выявлены новые морфологические особенности строения норовирусов.
С использованием ЭМ в качестве референс- метода впервые подробно охарактеризованы отечественные тест-системы ИФА для выявления ротавирусного антигена.
Практическая значимость работы
Предложенная экспериментальная модель позволила получить качественно новую информацию об адсорбционных свойствах различных вир) сов Данная информация может найти применение в вирусологической диагностике, а также при разработке противовирусных препаратов, блокирующих инфекцию на стадии адсорбции
Разработан новый метод, позволяющий существенно повысить эффективность выявления различных кишечных вирусов Метод обладает наиботыпей эффективностью при выявлении норовирусов, что имеет особое значение, поскольку тест-системы ИФА для выявления норовирусной инфекции в России не выпускаются
Уникатьлые адсорбционные свойства аденовируса 41 типа выявленные в исследовании, позволяют определять принадлежность кишечных аденовирусов к подгруппе F в отсутствие иммунных сывороток
Проведенное исследование позволило врачам-педиатрам,
участвующим в исследовании выявить клинические особенности вирусных гастроэнтеритов различной этиологии и сформулировать критерии симптоматической диагностики вирусных ОКИ у детей
Подготовлен материал для издания атласа этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов включающий в себя оригинальные электронно-микроскопические изображения и описание всех известных на сегодняшний день патогенных кишечных вирусов и характерных представителей нормальной вирусной флоры кишечника
Показано, что ЭМ с использованием углеродно-полимерных подложек может использоваться в качестве эффективного референс- метода для оценки чувствительности и специфичности иммуноферментных тест-систем
Основные положения, выносимые на защиту
Предложена новая экспериментальная модель, позволяющая исследовать адсорбцию вирусных частиц методами просвечивающей электронной микроскопии при помощи подложек, модифицированных различными синтетическими полимерами
Разработан новый метод повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции вирусных частиц Показана эффективность метода в диагностике вирусных гастроэнтеритов у детей, в особенности при выявлении калицивирусной инфекции
Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге в 2001-2003 гг отличалась разнообразием циркулирующих агентов Наибольшее значение в кишечной патологии детей имели (в порядке значимости) ротавирусы норовирусы торовирусы, аденовирусы, коронавирусы и астровирусы
Апробация работы
Результаты исследований были доложены на международных симпозиумах и конференциях "Molecular Order and Mobility in Pol>mer Systems", Санкт-Петербург, 3-7 июня 2002г, «Ликвидация и этиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», Санкт-Петербург, 4-5 сент 2003г, «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций», Санкт-Петербург, 16-18 апр 2001, «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций», Санкт-Петербург, 16-18 апр 2002, а также на заседаниях общества эпидемиологов России
Сведения о внедрении
Усовершенствованный метод электронно-микроскопической
диагностики применяется в расшифровке этиологии ОКИ в НИИ детских инфекций и других больницах Санкт-Петербурга Подана заявка на патент
Электронные микрофотографии вирусов и другие материалы работы используются на лекциях и практических занятий по вирусологии на биолого-почвенном факультете СПбГУ, а также на сертификационных курсах для вирусологов при ГУ НИИ гриппа РАМН
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 22 научные работы в том числе 9 статей в реферируемых российских научных журналах
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста содержит 8 таблиц, 17 рисунков, 25 электронных микрофотографий Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложения, включающего электронно-микроскопические изображения патогенных вирусов и нормальной вирусной флоры кишечника Список литературы включает 32 отечественных и 266 зарубежных источников
Ключевые слова: электронная микроскопия, адсорбция вирусных частиц, синтетические полимеры, вирусный гастроэнтерит
Этиологические агенты вирусных гастроэнтеритов
В середине 1970-х годов в разгар «охоты за кишечными вирусами» несколькими группами исследователей почти одновременно было установлено, что 2-5% детей с диареями выделяют в фекалиях большое количество (до 10 ч/мл) частиц аденовируса (Flewett Т.Н. et al, 1974; Flewett Т.Н. et al, 1975; White G.B, & Stancliffe D., 1975). По морфологии кишечные аденовирусы не отличались от ранее открытых респираторных аденовирусов, но, в отличие от последних, практически не поддавались культивированию на клеточных линиях. Оказалось, что по серологическим свойствам их нельзя было отнести ни к одной из известных антигенных групп (аденовирусы разделяют на пять групп от А до Е). Впоследствии кишечные аденовирусы на основании серологических реакций и рестрикционного анализа генома были выделены в самостоятельную подгруппу F, представленную двумя серотипами 40 и 41.
Аденовирусы человека относятся к роду Mastadenovirus семейства Adenoviridae. Генетическим материалом аденовирусов является линейная двуспиральная ДНК, размер которой в пределах семейства варьирует от 33т.н. до 45т.н. Кишечные аденовирусы подгруппы F обладают относительно маленьким геномом 34,2т.н. кодирующим около 15 структурных и 20 неструктурных белков. Гомология ДНК кишечных аденовирусов с аденовирусами других антигенных групп составляет не более 25%. Особенности организации генома аденовирусов подгруппы F подробно рассмотрены в работе Tiemessen СТ. & Kidd А.Н. (1995).
Частицы аденовирусов имеют характерное строение в виде икосаэдра с фибриллами на каждой из вершин. Размер вирионов составляет около 80 нм в диаметре (без фибрилл). Вирусный капсид состоит из отдельных белковых субъединиц. Основной мажорный белок капсида носит название гексона, поскольку тримеры этого белка соседствуют с шестью такими же молекулами. На вершинах икосаэдра находится белок основания пентона (penton base) и сам пентон (penton) в виде протяженных фибрилл с утолщением на концах.
Структурной особенностью аденовирусов подгруппы F является наличие фибрилл разной длины 20нм и ЗОнм, прикрепленных к различным вершинам икосаэдра. Количество фибрилл двух видов одинаково (Kidd А.Н. et al, 1993; Favier A.L. et al, 2002). В соответствии с морфологическими особенностями в геноме «кишечных» аденовирусов имеются два различных гена, кодирующие белки фибрилл (Kidd А.Н. et al, 1990). Наличие фибрилл разной длины не имеет практического значения для электронно-микроскопической диагностики, поскольку в клинических образцах фибриллы, как правило, не видны.
Из-за трудности адаптации кишечных аденовирусов к перевиваемым клеточным линиям долгое время их так и называли - «капризные» (fastidious) аденовирусы. Не так давно исследователям все же удалось вырастить аденовирусы 40 и 41 типа на органных культурах эпителия кишечника и на клетках НТ-29, НЕр-2, HEF, А-293, Chang conjunctiva и пр. (Kidd А.Н. & С, R. Madeley, 1981; Tiemessen СТ. et al, 1993; Tiemessen C.T. et al, 1994). Было показано, что сложность культивирования кишечных аденовирусов связана с делециями в участках Е1 и ЕЗ экспрессии ранних генов. Успешной репликации кишечных аденовирусов удалось добиться, восполнив недостающие функции их генома с помощью репликативно- дефектных мутантов аденовируса 2-го типа (Tiemessen СТ., Kidd А.Н., 1995). Клеточная линия А-293, хронически инфицированная аденовирусом 5 типа, также оказалась пермиссивна для аденовирусов 40 и 41 типа.
Адсорбция аденовирусов на мембране инфицируемых клеток представляет собой сложный процесс, в котором со стороны вируса участвуют фибриллы, белок основания пентона и гексон. Со стороны клетки участвуют интегрины и так называемый CAR-рецептор (Coxsackievirus-Adenovirus Receptor) - трансмембранный белок, являющийся компонентом плотных клеточных контактов (Nemerow G.R., 2000; Roelvink P.W. et al, 1998). Адсорбция кишечных аденовирусов начинается с прикрепления частиц посредством фибрилл к рецептору CAR (Roelvink P.W. et al, 1998). Другие клеточные рецепторы, необходимые для проникновения аденовирусов 40, 41 типа в клетку, не известны. Аденовирусы 2, 5 и 6 типов при интернализации используют клеточные альфа -интегрины, связывающиеся с RGD-мотивом белка основания пентона (Nemerow G.R. and Stewart P.L. 1999; Nemerow G.R., 2000). В отличие от респираторных аденовирусов, кишечные аденовирусы не содержат RGD-мотива в белке основания пентона, поэтому предполагается, что они используют другие клеточные рецепторы для адсорбции и проникновения в клетки-мишени (Albinsson В. & Kidd А.Н., 1999; Wadell G. & Allard A., 1994).
Аденовирусным диареям в основном подвержены дети в возрасте до 5 лет. Однажды перенесенная инфекция вызывает стойкий иммунный ответ. В клинических исследованиях установлено, что аденовирусы подгруппы F являются причиной длительных диарей продолжительностью 7-14 дней и более. Интересно отметить, что аденовирус 41-го типа вызывает более длительные диареи, чем аденовирус 40-го типа. В среднем аденовирусные гастроэнтериты протекают легче, чем ротавирусные (Wadell G. & Allard А., 1994).
Доля аденовирусных диарей в общей структуре ОКИ у детей в различных регионах мира варьирует от 2% в странах Европы и Азии (Saderi Н. et al, 2002; Waters V. et al, 2000; Wadell G. and Allard A., 1994) до 30% в ЮАР (Moore P.L. et al 2000). Каких-либо сезонных особенностей в распространении кишечных аденовирусов не отмечено, они выявляются с одинаковой частотой в течение всего года. В последние два десятилетия исследователи отмечают повсеместное преобладание 41 типа над 40-м (Moore P. et al, 2000; Pang X.L. et al, 2000; Wadell G„ 2000). Считается, что у детей основным механизмом распространения инфекции является фекально-оральный путь передачи. Изредка наблюдаются вспышки аденовирусных диарей в домах престарелых (Reid J.A. et al, 1990), а также у ВИЧ-инфицированных и иммунодефицитных больных (Kang G. et al, 2002; Thomas P.D. et al, 1999; Schmidt W. et al, 1996).
Практическая значимость дифференциальной диагностики вирусных гастроэнтеритов
Дифференциальная диагностика вирусных гастроэнтеритов имеет непосредственное значение для здоровья больных, поскольку позволяет вовремя назначить соответствующее лечение. Многочисленными исследованиями показано, что неоправданное применение антибиотиков при вирусных гастроэнтеритах, в особенности у грудных детей приводит к ухудшению состояния ребенка и увеличению продолжительности заболевания. Напротив, отмена антибиотиков и назначение поддерживающих солевых растворов типа «Регидрон» существенно сокращает сроки лечения вирусных гастроэнтеритов (Rhoads F.A. 1993; Rudolph J.A. and Cohen M.B., 1999, Sullivan A. et al, 2001). Отечественными педиатрами постоянно подчеркивается необходимость экстренной диагностики вирусных гастроэнтеритов как одного из важнейших средств снижения детской смертности (Тихомирова О.В. 2001).
Помимо регидратации, положительный эффект в терапии вирусных гастроэнтеритов был отмечен при назначении культур бифидобактерий и других пробиотиков (Тихомирова О.В. с соавт., 2002; de Roos N.M., Katan М.В., 2000; Sullivan A, and Nord C.E., 2002). В последнее время в лечении вирусных кишечных инфекций наметился существенный прогресс - появился положительный опыт применения ингибиторов секреции, таких как racecadotril (ацеторфан) и лоперамид (Salazar-Lindo Е. et al, 2000; Lecomte J.M., 2000; Turck D. et al, 1999). В литературе обсуждается вопрос о применении в лечебных целях интерферонов и индукторов при вирусных кишечных инфекциях, в частности, при коронавирусных диареях (Beilharz M.W., 2000). Недавно обнаружен противовирусный эффект бета-интерферона в отношении коронавируса SARS (Hensley L.E. et al, 2004).
Особое значение имеет дифференциальная диагностика торовирусов, поскольку торовирусная инфекция часто сопровождается появлением крови в кале, что может быть ошибочно интерпретировано как признак бактериальной инфекции. Одним из наиболее эффективных диагностических методов, позволяющих выявить весь спектр патогенных кишечных вирусов, является просвечивающая электронная микроскопия.
С изобретением в 1960-х годах простого и быстрого метода негативного контрастирования, вирусологи получили возможность широкого применения ЭМ в диагностике различных вирусных инфекций. В медицинскую практику, в том числе, в диагностику вирусных гастроэнтеритов этот метод был введен во многом благодаря усилиям известного микроскописта Джона Альмейды (Almeida J.D., 1980; 1982). В настоящее время метод негативного контрастирования в различных его модификациях позволяет выжить электронно-микроскопическим лабораториям в постоянной конкуренции с новыми методами.
Основные преимущества ЭМ в диагностике вирусных гастроэнтеритов можно суммировать следующим образом (Biel S. and Gelderblom Н., 1999): 1. Быстрота диагностики. Для определения возбудителя часто требуется не более 20 мин. с момента получения клинического материала. 2. Широкий спектр выявляемых вирусных агентов. Все основные агенты вирусных гастроэнтеритов легко определяются по морфологическим признакам. Иногда ЭМ позволяет выявить какой-нибудь редкий агент, например, кишечный коронавирус, диагностика которого другими методами в вирусологической лаборатории невозможна из-за отсутствия тест-систем. Случаи смешанных инфекций, например, ротавирусной + аденовирусной также легко выявляются при помощи ЭМ. Генетическая и антигенная изменчивость не влияет на детекцию вирусов методами ЭМ, чего нельзя сказать о других методах диагностики. 3. Возможность выявления неизвестных ранее вирусов. Время от времени человечество сталкивается с новыми, неизвестными ранее вирусными заболеваниями. В таких случаях ЭМ оказывается наиболее подходящим методом, позволяющим быстро классифицировать новый инфекционный агент до уровня семейства. Примером успешного применения ЭМ в расшифровке этиологии новых инфекций может служить обнаружение парамиксовирусов Hendra (1995 г), Nipah (1997 г.) и коронавируса SARS (2003 г). 4. Достоверность положительных ответов. Обнаружение цельных вирионов и возможность количественной оценки содержания вирусных частиц в препарате делают ЭМ- диагностику особенно достоверной. Вирусологи в своей практике нередко сталкиваются как с ложноположительными, так и ложноотрицательньши ответами ИФА и ПЦР. К тому же, обычная (не количественная) ПЦР- диагностика ничего не говорит о жизнеспособности вирусного агента. Положительные ответы ЭМ воспринимаются клиницистами всегда с доверием. В диагностике вирусных гастроэнтеритов ЭМ недаром считается «золотым стандартом». 5. Наглядность в обучении. В образовательном процессе ЭМ обладает большими преимуществами в силу своей наглядности. Внешний вид вирусных частиц, обнаруженных при исследовании клинического материала, убеждает студентов гораздо больше, чем безликие бэнды электрофорезов.
Исследование адсорбции вирусов на подложках, модифицированных полимерами
Структурные формулы исследованных полимеров приводятся на рис. 1 и 2. В качестве препарата сравнения использовали также L-полилизин, 30 kDa фирмы Sigma. Модификация подложек. Готовили свежий ОД-0,5% раствор исследуемого полимера на бидистиллированной воде или на забуференном физиологическом растворе (фосфатный буфер не подходит для данной цели, поскольку аминогруппы полимеров реагируют с фосфатами). Стандартные медные сетки 400mesh с углеродными подложками помещали сверху на каплю раствора полимера на 15-20 сек, затем избыток влаги с сетки удаляли о край фильтровальной бумаги и отмывали сетку, помещая ее на 5-10 сек на каплю дистиллированной воды. Вирусы. Для изучения адсорбции на подложках с полимерами были использованы частично очищенные образцы фекалий, содержащие различные кишечные вирусы (ротавирусы, аденовирусы подгруппы F, норовирусы, саповирусы и торовирусы). Для сравнения адсорбции различных вирусов на подложках, обработанных полимерами, использовали также аденовирус 5 типа и вирус гриппа из коллекции НИИ гриппа РАМН. Определение коэффициентов адсорбции. После фиксированного времени адсорбции препарата (1мин) производили подсчет количества вирусных частиц на традиционных углеродных подложках и на подложках с полимерами. Контрольные образцы на обычных углеродных подложках всегда делались свежие. При работе с относительно крупными вирусами, такими как торовирусы, ротавирусы и аденовирусы производили полный подсчет вирусных частиц в контроле и опыте не менее чем на 5 ячейках стандартной сетки 400mesh при инструментальном увеличении хЗОООО.
Вируссодержащие образцы перед исследованием в случае необходимости разбавляли физиологическим раствором (рН 7,0) для того, чтобы количество вирусных частиц было удобно для подсчета (50-200 частиц на 1 ячейку сетки). При работе с мелкими вирусами, такими как астровирусы и калицивирусы, подсчитывали среднее количество вирусных частиц в 50 полях зрения при увеличении х50000.Условные коэффициенты адсорбции (К) определяли по относительному увеличению среднего количества вирусных частиц на единицу площади сетки по сравнению с контролем, Для проведения иммуноферментной диагностики использовали отечественные ИФТС "Рота-антиген" на разборных пластиковых планшетах производства фирмы "Аквапаст" (Санкт-Петербург). Планшеты были сенсибилизированы поликлональными антителами класса IgG сыворотки телят, иммунизированных ротавирусом телят, штамм РМ. Иммуноферментную диагностику осуществляли согласно рекомендациям производителя. Учет результатов ИФА проводили путем измерения оптической плотности растворов в лунках планшета при длине волны 492 нм (ОП492) с помощью вертикального фотометра Anthos 2010. Согласно рекомендации производителя, исследуемые образцы следовало считать отрицательными, если значения ОП492 для них были меньше или равны ОП крит-» определенной с помощью прилагаемого в наборе отрицательного контроля.
Среднее значение ОП492 для отрицательного контроля было равно 0,14, т.о. в данном случае, В процессе исследований было выяснено, что среднее значение оптической плотности для образцов, содержащих норовирусы (гетерологичный антиген), было равно 0,24. Для прочих вирусов средние значения ОП492 были еще выше, поэтому в качестве положительных значений ОП на наличие ротавирусного антигена в исследуемых образцах принимали значения оптической плотности выше ОПкрИт= 2x0,24=0,48. Для выделения РНК из осветленной суспензии фекалий использовали отечественный набор "Рибосорб" производства ЦНИИ эпидемиологии им. Габричевского. РНК выделяли из 200 мкл образца, соблюдая пропорции реагентов. Для электрофоретипирования отбирали образцы, содержание ротавирусов в которых было показано методом ЭМ. Диск-электрофорез (discontinuous electrophoresis) ротавирусной РНК в полиакриламидном геле (ПААГ) с SDS проводили по методу Laemmly (Маниатис Т. и др., 1984). Готовили блоки ПААГ размером 1,5x60x90 мм. При формировании блока на первом этапе готовили разделяющий 9,3% полиакриламидный гель высотой 5 см (0,ЗМ трис-HCl, рН 8,8; 0,1% SDS, 0,02% персульфат аммония, 0,01% ТЕМЕД). Для выравнивания поверхности геля сверху наслаивали 0,5мл воды и после полимеризации в течение 30- 40 минут в камеру заливали концентрирующий 4,5% гель (0,1М трис-НО, 0,1% SDS, 0,06% персульфат аммония, 0,01% ТЕМЕД). Карманы для нанесения проб формировали с помощью стандартной пластиковой гребенки с 10 зубцами. Пробы вносили в буфере (0,125 М трис-HCI, рН 6,8; 1% SDS, 40% глицерин, 0,01% бромфеноловый синий) из расчета 15 мкл буфера на 35 мкл пробы. Для электрофореза использовали следующий буфер; 1,4% глицин, 0,025М трис-НС1, 0,1% SDS.
Электронно-микроскопические исследования фекалий госпитализированных детей
В контрольной группе клинически здоровых детей патогенных вирусов выявлено не было. Нормальная вирусная флора кишечника была представлена бактериофагами различной формы (рис. 17-20, приложение 1). Доминировали бактериофаги средних размеров с диаметром головки 50-80 нм. Поскольку подробная характеристика нормальной вирусной флоры кишечника не входила в задачи настоящего исследования, мы ограничимся морфологическим описанием наиболее характерных ее представителей. В фекалиях контрольной группы достаточно часто встречались бактериофаги семейства Myoviridae с головкой в форме икосаэдра и длинным (100-200 нм) отростком, одетым в сократимый чехол (прилож. 1, рис 17). К этому семейству принадлежит, например, бактериофаг Т4 Escherichia Coli. Вторыми по частоте встречаемости были бактериофаги семейства Podoviridae, обладающие икосаэдр ическоЙ головкой и коротким (50-70 нм) несократимым отростком с хорошо заметным воротничком у его основания (прилож. 1, рис 19). В фекалиях контрольной группы встречались как одиночные частицы, так и скопления фагов Podoviridae. Примерами представителей данного семейства могут служить Coliphage Т7 и Salmonella phage Р22. Значительную часть нормальной вирусной флоры кишечника составляли различные бактериофаги семейства Siphoviridae, обладающие округлой или икосаэдрической головкой и гибким несократимым отростком (название семейства происходит от Siphon - трубка), (рис 18, прилож. 1). Достаточно часто в фекалиях контрольной группы детей и в группе больных детей встречались мелкие (30-50 нм) бактериофаги с короткими отростками или без них (прилож, 1, рис 20,). Именно наличие подобных бактериофагов в фекалиях затрудняет электронно-микроскопическую диагностику вирусных гастроэнтеритов. Не обладая достаточным опытом, головки бактериофагов можно легко принять за мелкие патогенные вирусы, например, пикорнавирусы. На основании анализа большого количества микрофотографий можно предложить следующие критерии, по которым мелкие бактериофаги можно отличить от патогенных вирусов: 1. Бактериофаги имеют головки более гладкие, чем вирионы астровирусов и калицивирусов. 2. Размер головок мелких бактериофагов обычно несколько больше (30-50нм), чем средний диаметр частиц мелких патогенных вирусов (28 32нм). 3.
При просмотре препаратов следует искать скопления бактериофагов, поскольку в скоплениях гораздо легче обнаружить характерные детали морфологии, например, отростки или воротнички. В фекалиях детей с клиническими появлениями острого гастроэнтерита наиболее часто встречались частицы ротавирусов (рис. 1-4, прилож.1). Подавляющее количество вирионов было представлено трехслойными частицами диаметром около 70нм (рисЛ и 2, прилож.1), а также двухслойными зубчатыми частицами диаметром около бОнм (рис.3, прилож.1). Характерная форма частиц в виде колеса со спицами чаще наблюдалась у «пустых» частиц с проникшим внутрь контрастирующим веществом (рис.1, прилож. 1, вверху). В некоторых случаях в фекалиях наблюдались частицы ротавируса, покрытые антителами (рис.2, прилож.1). В одном случае в препарате фекалий наблюдались скопления однослойных сферических и трубчатых частиц ротавируса диаметром около 40-45нм (рис.4, прилож.1). Ребенок поступил в стационар с ротавирусной инфекцией.
Спустя 4 дня к ротавирусной инфекции присоединилась норовирусная. Вероятно, появление однослойных частиц ротавируса в данном случае было связано с массовой гибелью инфицированных клеток в условиях поражения эпителия кишечника двумя различными вирусами. Количество частиц ротавируса в препаратах фекалий больных детей в среднем составляло около 10-10 ч/мл. Хорошо заметные частицы ротавируса, как правило, обнаруживались в течение первых трех- пяти минут просмотра. На втором месте по распространенности следовала торовирусная инфекция, обнаруженная у 18% детей (моноинфекции и сочетанные инфекции с участием торовирусов вместе взятые). Полиморфные частицы торовируса имели форму тороида (рис.5, прилож.1, верх) или подковы (рис.5, прилож.1, низ). Вирионы были покрыты короткими пепломерами длиной около Юнм. Иногда можно было наблюдать двойной ряд пепломеров разной длины 6 и 10 нм (рис.5, прилож.1, вверху). Отличительной особенностью торовирусов является их деформация под воздействием электронов, поэтому при длительном просмотре препаратов под электронным микроскопом пепломеры торовирусов постепенно становятся плохо различимыми. Частицы торовирусов отличались от присутствующих в препаратах окаймленных частиц (рис. 21, а также рис. 18 и 19, прилож.1) более выраженными пепломерами определенной длины и темным ободком контрастирующего вещества вокруг вирусных частиц, указывающего на их объем. При установлении диагноза единичные частицы, напоминающие по морфологии торовирусы, в расчет не принимались. Диагноз «торовирусная инфекция» ставился лишь в том случае, если в препаратах удавалось обнаружить не менее 10-15 частиц, по морфологии соответствующих описанию торовирусов человека (Duckmanton L., Luan В., et al, 1997). Округлые частицы норовирусов, обнаруженных в препаратах фекалий имели диаметр от 30 до 35 нм. Поверхность частиц была неровной с короткими выступами длиной около 3-4нм (рис.6, прилож.1). В одном случае удалось получить препарат с очень высоким содержанием частиц, при исследовании которого впервые была отмечена морфологическая особенность, не замеченная другими авторами: некоторые «пустые» частицы норовирусов имели форму ромба (рис.б, прилож.1, вверху справа). Указанная морфологическая особенность была нами впоследствии отмечена и на других препаратах норовирусов. «Полные» частицы норовирусов часто имели симметричное расположение капсомеров (рис.б, прилож.1).
