Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современные представления о роли условно-патогенных микробов в патологии человека и их лекарственной устойчивости 15
1.1 Роль условно-патогенных микробов в нарушении микробной экологии и развитии воспалительного процесса различной локализации 17
1.2 Эпидемиология и механизмы лекарственной устойчивости бактерий и грибов 35
1.3 Способы преодоления лекарственной устойчивости микробов 52
Собственные исследования 60
Глава 2 Материал и методы исследований 60
2.1 Характеристики обследованных лиц 61
2.2 Методы исследований 63
2.2.1 Клинические исследования 63
2.2.2 Микробиологические исследования 64
2.2.3 Эпидемиологические исследования 68
2.2.4 Экспериментальные исследования на лабораторных животных 68
2.2.5 Технологические методы 72
2.2.6 Методы статистической обработки результатов исследований 73
2.2.7 Техническое оформление результатов исследований 74
Глава 3 Эпидемиологические особенности циркуляции лекарственно-устойчивых факультативных микробов при дисбиозе кишечника 76
3.1 Оценка роли факультативных бактерий и грибов в нарушении микробной экологии в кишечнике 76
3.2 Анализ лекарственной устойчивости факультативных микробов микробиотопа кишечника 92
Глава 4 Эпидемиологические особенности циркуляции лекарственно-устойчивых факультативных бактерий и грибов при некоторых видах акушерско-гинекологической патологии 102
4.1 Эпидемиология дисбиотических изменений в составе микрофлоры влагалища при вульвовагинитах и бактериальном вагинозе 103
4.2 Оценка возможности применения систем искусственного интеллекта для дифференциальной диагностики акушерско-гинекологических заболеваний, обусловленных микроорганизмами 121
4.3 Определение особенностей лекарственной устойчивости факультативных бактерий микробиотопа влагалища 127
4.4 Анализ чувствительности грибов рода Candida к антимикотическим препаратам 134
Глава 5 Сравнительная оценка лекарственной устойчивости условно-патогенных бактерий при патологических процессах различной локализации 144
5.1 Золотистый стафилококк 146
5.2 Эпидермальный стафилококк 153
5.3 Лактозонегативные эшерихии 162
Глава 6 Эпидемиологический анализ циркуляции лекарственно устойчивых микроорганизмов по факторам риска 165
6.1 Оценка условий колонизации микробиотопа влагалища лекарственно-устойчивыми бактериями 167
6.2 Определение особенностей клинических проявлений гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных MRSA и MRSE 177
6.3 Выявление факторов риска персистенции грибов рода Candida, резистентных к антимикотическим препаратам 180
Глава 7 Обоснование схем эмпирической антимикробной терапии и профилактики воспалительных заболеваний применительно к условиям г. Самара 185
Глава 8 Разработка способа преодоления лекарственной устойчивости условно-патогенных бактерий и грибов 195
8.1 Выбор оптимальных условий преодоления резистентности микробов к антимикробным препаратам различных групп in vitro 197
8.2 Определение механизма преодоления лекарственной устойчивости при применении разрабатываемого способа 206
8.3 Анализ действия комбинированных антимикробных рецептур на полирезистентные бактерии и грибы in vitro и in vivo 209
8.4 Оценка безвредности, острой и хронической токсичности, раздражающего действия комбинированных антимикробных рецептур 225
8.5 Разработка технологии приготовления и определение допустимых сроков хранения комбинированных антимикробных рецептур 228
Обсуждение результатов исследования 239
Выводы 270
Практические рекомендации 273
Список литературы 276
- Эпидемиология и механизмы лекарственной устойчивости бактерий и грибов
- Анализ лекарственной устойчивости факультативных микробов микробиотопа кишечника
- Эпидермальный стафилококк
- Оценка условий колонизации микробиотопа влагалища лекарственно-устойчивыми бактериями
Введение к работе
Актуальность проблемы
Со второй половины ХХ века в экономически развитых странах мира наблюдается устойчивый рост уровня заболеваемости патологией, вызываемой условно-патогенными бактериями и грибами. Антропогенное воздействие, как мощный фактор эволюции живой материи, привело в последние годы к стиранию грани между ними и облигатно-патогенными микроорганизмами, т.е. возбудителями «классических» инфекций [Яковлев В.П. и др., 2003; Rolston K.V.I., 2005].
В настоящее время доказана этиологическая роль целого ряда условно-патогенных бактерий и грибов в возникновении инфекционного процесса различной локализации [Анкирская А.С. и др., 2006; Веселов А.В., Козлов Р.С., 2006; Muratani T., 2004]. Однако в отношении некоторых из них данный вопрос не в полной мере изучен, хотя отрицательное влияние избыточной микробной колонизации слизистых оболочек различных органов на структуру, метаболическую и ферментативную активность эпителиальных клеток показано целым рядом ученых [Ардатская М.Д. и др., 1996, 2001; Шендеров Б.А., 1998; Коршунов В.М. и др., 1999].
Другой важнейшей проблемой современной медицины стало массовое распространение лекарственной устойчивости в популяциях условно-патогенных бактерий и грибов [Манграм А.Дж. и др., 2003; Шагинян И.А., Чернуха Ю.М., 2005; Rex J.H. et al., 1995]. В последнее десятилетие сформировалось устойчивое мнение, что одним из важнейших признаков микробной патологии в XXI веке станет появление новых полирезистентных штаммов возбудителей, против которых лечащий врач будет бессилен подобрать необходимый антимикробный препарат [Mazuda N. et al., 1995; Davies J.E., 1997; Jones A.M. et al., 2001]. Разработка универсальных рекомендаций по эмпирической антимикробной терапии невозможна вследствие выраженных колебаний в уровнях и частоте распространения резистентных штаммов бактерий и грибов в разных географических регионах и даже разных биотопах тела человека [Страчунский Л.С.и др., 2003; Тец В.В., 2003; Янов Ю.К., 2003; Бухарин О.В. и др., 2005].
Эпидемиологический надзор за микробным пейзажем заболеваний и резистентностью их возбудителей к антимикробным препаратам в каждом конкретном регионе является в настоящее время единственно приемлемым инструментом обоснования адекватной эмпирической антимикробной химиотерапии [Cuevas О. et al., 2004; Sader H.S., Jones R.N., 2005]. Другое важнейшее направление в повышении ее эффективности – разработка фармакологических способов преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов.
Исходя из вышеизложенного, актуальным является изучение связи условно-патогенных бактерий и грибов с патологией человека, их резистентности к антибиотикам, а также разработка методических подходов к ее преодолению.
Цель исследования
Разработка и обоснование способа преодоления лекарственной резистентности условно-патогенных микроорганизмов на основе системного анализа закономерностей ее распространения при патологических процессах, возникающих за пределами госпитальной среды.
Задачи исследования
1 Выявить особенности циркуляции условно-патогенных бактерий и грибов при воспалительных процессах различной локализации, а также роль некоторых из них в возникновении и развитии патологии у больных амбулаторного профиля.
2 Определить спектр резистентности условно-патогенных микробов к антимикробным препаратам, а также характер и причины распространенности множественной лекарственной устойчивости в их популяциях за пределами госпитальной среды.
3 Сравнить распространенность лекарственной устойчивости у гомологичных видов бактерий и грибов, выделенных из различных локализаций в макроорганизме.
4 Провести эпидемиологический анализ условий и факторов риска колонизации различных биотопов тела человека полирезистентными штаммами условно-патогенных микробов, а также особенностей клинических проявлений вызываемой ими патологии.
5 Разработать способ преодоления лекарственной устойчивости условно-патогенных бактерий и грибов, оценить его эффективность in vitro и in vivo, а также безвредность в экспериментах на лабораторных животных.
Научная новизна исследования
Доказана этиологическая роль коагулазонегативных стафилококков, отдельных видов коринебактерий и факультативных эшерихий в развитии воспалительных процессов различной локализации у больных.
Получены новые данные о региональных особенностях распространения лекарственной устойчивости в популяциях наиболее актуальных видов условно-патогенных бактерий и грибов у амбулаторных больных. Установлено, что отличия в резистентности к антимикробным препаратам эпидермального стафилококка и факультативных эшерихий определяются их локализацией в организме человека.
Впервые показано, что полирезистентные и панрезистентные штаммы условно-патогенных бактерий и грибов получили широкое распространение среди населения вне госпитальной среды. Ведущую роль в их формировании играет не вынос госпитальных штаммов за пределы лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), а массовое потребление антимикробных препаратов, приобретаемых в аптеках.
На основании данных эпидемиологического анализа впервые определены факторы риска и условия колонизации микробиотопов тела человека антибиотикорезистентными штаммами условно-патогенных микробов; выявлены особенности клинических проявлений вызываемой ими патологии; установлена передача детерминант резистентности к ряду антимикробных препаратов в ассоциациях грамположительных бактерий.
Впервые разработан способ преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов, основанный на эффекте синергизма в комбинированном действии антимикробных препаратов и анилиновых красителей,применяемых в субингибирующих дозах. Показана его эффективность и безвредность в доклинических испытаниях. Установлено, что разработанный фармакологический способ преодоления лекарственной устойчивости является универсальным не только в отношении различных микроорганизмов (бактерий, грибов), но и широкого спектра антимикробных препаратов (антибиотиков разных групп, фторхинолонов, нитрофуранов и антимикотиков).
Разработаны новые лекарственные средства для реализации способа преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов, определены их оптимальные технологические параметры приготовления и допустимые сроки хранения.
Разработан универсальный способ постановки реакции задержки цитотоксического гемолиза эритроцитов для подтверждения этиологической роли выделенного клинического штамма микроорганизма в патологии данного пациента.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретический вклад в клиническую микробиологию заключается в установлении закономерностей циркуляции лекарственной устойчивости в популяциях условно-патогенных микробов, выявлении самостоятельной роли некоторых бактерий как возбудителей неспецифических воспалительных заболеваний различной локализации, доказательстве факта распространения полирезистентных бактерий и грибов за пределами госпитальной среды, определении факторов риска и условий колонизации ими слизистых оболочек человека.
Теоретический вклад в фармакологию заключается в обосновании нового подхода к преодолению лекарственной устойчивости микроорганизмов, основанного на повреждении различных структур микробной клетки, отвечающих за признак резистентности, субингибирующими дозами анилиновых красителей. Данный подход быть использован в качестве основы для решения проблемы преодоления лекарственной устойчивости в вирусологии, паразитологии и онкологии.
Для практического здравоохранения предложены схемы эмпирический антимикробной химиотерапии ряда гастроэнтерологических и акушерско-гинекологических видов патологии в амбулаторно-поликлинической практике, а также патологических процессов других локализаций, вызванных условно-патогенными бактериями и грибами. Кроме того, рекомендованы для использования в практике работы ЛПУ разработанные блок-программы организации мероприятий по инфекционному контролю за циркуляцией лекарственной резистентности условно-патогенных микроорганизмов в госпитальной среде и за ее пределами и составления схем эмпирической антимикробной химиотерапии.
Успешно проведенные доклинические испытания лабораторных образцов новых антимикробных лекарственных средств обосновывают целесообразность доведения их до фармакопейных лекарственных форм, что позволит повысить эффективность лечения патологии, обусловленной полирезистентными микроорганизмами.
Положения, выносимые на защиту
1 У амбулаторных больных г. Самара доминирующая роль в этиологии воспалительных заболеваний различной локализации принадлежит условно-патогенным микроорганизмам: стафилококкам (золотистому и эпидермальному), энтеробактериям (клебсиеллам, энтеробактерам, лактозонегативным эшерихиям) и различным видам грибов рода Candida.
2 Множественная лекарственная устойчивость условно-патогенных микроорганизмов получила широкое распространение за пределами госпитальной среды. Ее характер определяется структурой продаж антимикробных препаратов через аптечную сеть в конкретном географическом регионе, а также локализацией возбудителя заболевания в организме больного.
3 Воспалительные заболевания, обусловленные полирезистентными микроорганизмами, характеризуются более тяжелыми клиническими и дисбиотическими проявлениями. Факторами риска колонизации ими слизистых оболочек являются длительность заболевания и кратность предшествующей антимикробной химиотерапии.
4 Разработанный фармакологический способ преодоления лекарственной устойчивости обладает универсальностью не только в отношении различных микроорганизмов (бактерий, грибов) и способов введения в макроорганизм, но также широкого спектра антимикробных препаратов (антибиотики разных групп, фторхинолоны, нитрофураны и антимикотики). Новые лекарственные средства для его реализации эффективны in vivo, безвредны, сохраняют стабильность свойств в процессе длительного хранения, а технология их приготовления проста и доступна для предприятий фармацевтической промышленности.
Реализация
Результаты проведенных исследований реализованы изобретениями: «Способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий и грибов» (патент РФ № 2363470 от 10 августа 2009 г. - переуступлен заводу по производству медицинских препаратов ООО «ОЗОН» из г. Жигулевска - регистрация 26.06.2010 договор № РД0066300), «Способ постановки реакции задержки цитотоксического гемолиза» (патент РФ № 2352945 от 20 апреля 2009 г.), изданием Методических рекомендаций для врачей Министерства здравоохранения и социального развития Самарской области «Эмпирическая антимикробная химиотерапия воспалительных заболеваний, ассоциированных с условно-патогенными бактериями в амбулаторной практике» (2007), составлением отчета о НИР по проблеме № 3 Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский военно-медицинский институт» МО РФ на тему: «Микробная экология и ее нарушения при различных видах патологии человека» (2007). Полученные результаты внедрены в учебный процесс кафедры медико-биологических дисциплин НОУ ВПО СМИ «РЕАВИЗ», в клиническую практику гинекологического отделения ММУ «Городская клиническая больница №2 имени Н.А.Семашко», терапевтического отделения лечебно-диагностического комплекса «МЕДГАРД», поликлиники НОУ ВПО СМИ «РЕАВИЗ», стоматологической клиники ООО «К-Дент» г. Самары, Госпиталя МСЧ ГУВД по Самарской области.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении», XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», XI, XII и XIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека», 40-й и 41-й научно-практической конференции научно-педагогического состава Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский военно-медицинский институт» МО РФ «Актуальные вопросы военной медицины», VII научной Международной конференции «Гомеостаз и эндоэкология» (Египет, г. Хургада), V, VI Международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Таиланд, г. Бангкок, Паттайа), IV общероссийской научной конференции «Современные проблемы науки и образования», X Международном конгрессе МАКМАХ/ESMID по антимикробной терапии, III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням.
Публикации
По результатам проведенных исследований опубликовано 28 работ, в том числе 15 – в изданиях, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание учёной степени доктора и кандидата наук» ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации и одна монография.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 337 страницах машинописного текста, иллюстрирована 66 таблицами, 24 рисунками и двумя клиническими примерами. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», шести глав собственных исследований, обсуждения их результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы содержит 526 наименований, из которых 222 иностранных авторов.
Эпидемиология и механизмы лекарственной устойчивости бактерий и грибов
11 сентября 2001 года Всемирная Организация Здравоохранения опубликовала «Глобальную стратегию по сдерживанию резистентности к противомикробным препаратам», направленную на обеспечение гарантий эффективности антибиотиков не только для нынешнего поколения людей, но и в будущем. До этого, 16 сентября 2000 года, на Всемирном Дне Резистентности в Торонто (Канада) было признано, что антибиотики -социальные препараты, относящиеся к невосстановимым ресурсам, нерационально расходуемым самим человечеством, их создавшим. Специалисты медико-биологического профиля были вынуждены принять и реализовывать программу SENTRY, которая отслеживает частоту и типы устойчивости патогенов к антибиотикам на 5 континентах [Sader H.S. et al., 2005]. Наряду с этим была организована Европейская система по надзору за антибиотикорезистентностью (EARSS), а в России проведены исследования в данном направлении по программам ПеГАС-1 и ПеГАС-П [Страчунский Л. С. и др., 2003; Козлов Р.С. и др., 20061.
Действительно, резистентность микроорганизмов к антибиотикам в последние годы стала одной из самых актуальных проблем современной медицины [Гудкова Е.И. и др., 1999; Соломенный А.П. и др., 2005; Wilson A.P.R. et al., 1992; Brandley ST., 1999; Vanderkooi O.G. et al., 2005]. По мнению В.Ф.Ковалева с соавт. (1988), Л.К.Катосовой с соавт. (2004), N.Datta (1984), ее возникновение является естественным биологическим ответом на использование антимикробных препаратов, которые создают селективное давление, способствующее отбору, выживанию и размножению резистентных штаммов микроорганизмов. Инфекции, вызванные такими бактериями и грибами, отличаются длительным течением, чаще требуют госпитализации и увеличивают продолжительность пребывания в стационаре, ухудшают прогноз для пациентов [Боровик А.В., 1996; Хуснутдинова Л.М., 2005; Perea S., 2002; Cosgrove S.E. et al.: 2003; Lautenbach E. et al.; 2005].
Под резистентностью понимают способность микроорганизма переносить значительно большие количества антимикробного препарата, чем остальные микроорганизмы данного штамма (вида), а также размножаться при таких концентрациях, которые превышают достигаемые в макроорганизме терапевтические дозы [Ковалев В.Ф. и др., 1988; Страчунекий Л.С. и др., 2002].
Существует несколько классификаций резистентности [Франклин Т., Сноу Дж., 1984; Ковалев В.Ф. и др., 1988; Семенов В.М. и др., 2004; Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии, 2007; McDermott P.F. et al., 2003]:
- первичная и вторичная;
- генотипическая и фенотипическая;
- развивающаяся быстро, постепенно и медленно;
- ассоциированная и перекрестная;
- обусловленная генетическими и биохимическими механизмами. Первичная резистентность закодирована в хромосомных генах и является видовым признаком. Она характеризуется отсутствием у микроорганизмов мишени действия антибиотиков или недоступности мишени, является ПОСТОЯШ1ЫМ видовым признаком и легко прогнозируется [Маянский А.Н., 1999]. Например, грибы Candida glabrata, Candida krusei, Candida dubliniensis обладают генетически обусловленной резистентностью к флуконазолу, а энтерококки - к аминогликозидам [Страчунекий Л.С. и др., 2002; Moran J.P. et al., 1998].
Под приобретенной устойчивостью понимают свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции [Обзор литературы «Антибиотикорезистентность: историческая перспектива», 2001]. Ее формирование в некоторых случаях обусловлено приобретением новой генетической информации или изменением уровня экспрессии собственных генов [Mazel D., Davies J., 1999]. Резистентные штаммы микроорганизмов часто возникают при изменении генома бактериальной клетки в результате спонтанных хромосомных мутаций [McDermott P.F. et al., 2002; Hisanaga Т. et al., 2005; Nordmann P., Poire L., 2005]. Л.С.Страчунский с соавт. (2002), В.А.Горбунов (2004) считают, что наиболее быстро и часто резистентность к антимикробным препаратам возникает у стафилококков, эшерихий, микоплазм, протеев и синегнойной палочки.
Другой ее генетической основой служит наличие в бактериях внехромосомных факторов устойчивости к лекарственным веществам - R-плазмид [Ковалев В.Ф. и др., 1988; Маянский А.Н., 1999; Березняков И.Г., 2001; Poirel L. et al., 2005]. Причем, по данным W.C.Noble et al. (1992), они являются фактором передачи резистентности даже между различными родами бактерий, например, энтерококками и стафилококками.
Согласно биохимической классификации, действие антимикробных препаратов блокируется вследствие следующих процессов [Франклин Т., Сноу Дж., 1984; РимжаМ.И., 2003; Davies J.E., 1997; Sheldon A.T.J., 2005]:
- ферментативной инактивации антибиотика;
- образования альтернативных метаболических путей;
- нарушения проницаемости внешних структур бактериальной клетки;
- изменения мишени действия препарата (модификация мишени).
Все эти механизмы детерминируются генами, которые локализованы на коньюгативных R-плазмидах, реже на трансдуцирующих бактериофагах. Дополнительно к вышеизложенному, в последние годы установлены эффлюкс (активный или «помповый» выброс антибиотиков из микробной клетки) и образование биопленок [Grcovic S. et al., 2002; Zhanel G.G. et al., 2004].
В результате модификации чувствительной мишени антибиотики утрачивают возможность связываться с определенными структурами внутри бактериальных клеток и, как следствие, теряют эффективность [Ковалев В.Ф. и др., 1988; Страчунский А.Л. и др., 2002: Chopra I., Roberts М. 2001].
Например, резистентность Pseudomonas aeruginosa к ципрофлоксацину обусловлена модификацией мишеней действия фторхинолонов (ДНК-гиразы и топоизомеразы IV) за счет мутаций в генах gyrA и рагС или двумя мутациями в гене gyrA [Roca J., 1995; Drlica К., Zhao X., 1997; Nakano M. et al., 1997; Jalal S., Wretlind В., 1998]. Широко известным примером подобного вида устойчивости может быть резистентность пневмококков к пенициллину [Страчунский А.Л. и др., 2002], энтерококков к гликопептидам [Arthur М., Courvalin Р., 1993] и ряда других бактерий к аминогликозидам [Recht M.I., PuglisiJ.D., 2001].
По данным А.В.Веселова, Р.С.Козлова (2006) модификация мишени действия макролидов включает:
- метилирование рибосом, обусловленное наличием у бактерий особых erm-генов, ответственных за синтез белков-метилаз, вызывающих диметилирование аденина 508-субъединицы рибосомы;
- мутации в рРНК;
- мутации в рибосомальных белках L4, L16 и L22.
Подобные механизмы резистентности имеются в отношении линкозамидных и стрептограминовых антибиотиков, поэтому они объединены с макролидами в так называемую «МЛС-группу» [Acar J.F., Goldstein F.W., 1997].
Мишенями действия бета-лактамов являются ферменты -пенициллинсвязывающие белки, участвующие в синтезе клеточной стенки бактерий ГФранклин Т., Сноу Дж., 1984; Ковалев В.Ф. и др., 1988]. В результате их модификации уменьшается сродство к бета-лактамам, что проявляется повышением минимальной подавляющей концентрации этих препаратов и снижением клинической эффективности. Так, устойчивость стафилококков (золотистого и коагулазонегативных) обусловлена появлением дополнительного пенициллинсвязывающего белка - ПСБ2& Маркером его наличия является отсутствие чувствительности к метициллину или оксациллину [Hiramatsu К. et al., 2001].
Широко распространенным видом резистентности является ферментативная инактивация антибиотиков. Такой механизм описан у ряда бактерий семейства Enterobacteriaceae в отношении аминогликозидов, когда оіш инактивируготся в результате адепилировапия, ацетилировапия или фосфорилирования [Сидоренко СВ., 1998; Shaw K.J. et al., 1993; Coleman К., 1994]. Еще один подобный способ зашиты бактерий от действия тетрациклина основан на «освобождении» рибосомы от него с помощью защищающих белков Тет (О) и Тет (М), находящихся в цитоплазме [Егоров A.M., Сазыкин Ю.О., 2004; Doyle D. et al., 1991]. Они кодируются геном otrA, распространяющимся в популяциях различных микробов с помощью трансферабельной R-плазмиды.
Бактериальные ферменты, разрушающие бета-лактамные антибиотики, получили название бета-лактамаз. Их делят на 4 молекулярных класса (А, В, С, D), в пределах которых ферменты характеризуются общностью свойств и выраженной гомологией [Митрохин С.Д. и др., 2005; Schito G.C., 2002]. Авторы полагают, что бета-лактамазы классов А, С и D эволюционировали из бактериальных пенициллинсвязываюших белков в почвенных экосистемах в результате селективного прессинга бета-лактамных антибиотиков, продуцируемых некоторыми микроорганизмами.
Анализ лекарственной устойчивости факультативных микробов микробиотопа кишечника
Оценка характера циркуляции устойчивых к антимикробным средствам бактерий и грибов кишечного микробиотопа в популяции лиц с патологией желудочно-кишечного тракта проводилась путем установления долей полностью резистентных микробов, а также обладающих промежуточной устойчивостью. Для этого определяли антибиограммы факультативных микроорганизмов, выделенных из кишечника 138 больных с СРТК, хроническим гастритом, панкреатитом, холециститом, энтероколитом, имевших клинические и микробиологические проявления дисбиоза.
Результаты проведенных исследований лекарственной устойчивости золотистого стафилококка, факультативных эшерихий, клебсиелл, энтеробактеров приведены в таблице 12.
Согласно полученным данным, к ампициллину были резистентны большинство исследованных штаммов бактерий: 83 % у стафилококка и от 90 до 100 % у факультативных энтеробактерий. Выраженная распространенность устойчивости к доксициклину и эритромицину наблюдалась у лактозонегативных эшерихий, клебсиелл и энтеробактеров (соответственно 88-100, 89-100 и 40-97%).
Обращают на себя внимание существенные отличия в устойчивости к гентамицину, ципрофлоксацину и фурагину у различных родов факультативных энтеробактерий:
- доля лактозонегативных эшерихий, резистентных к гентамицину, достоверно превышала таковую у клебсиелл и энтеробактеров соответственно в 4,6 и 3,7 раза (р 0,05);
- доля энтеробактеров, резистентных к ципрофлоксацину, достоверно превышала таковую у клебсиелл и лактозонегативных эшерихий соответственно в 3,5 и 1,9 раза (р 0,05); - доля клебсиелл, резистентных к фурагину, достоверно превышала таковую у энтеробактеров и лактозонегативных эшерихий соответственно в 1,5 и 1,6 раза (р 0,05).
Причины таких отличий, возможно, кроются в условиях паразитирования вышеуказанных бактерий в кишечнике, что подробно будет рассматриваться в последующих разделах настоящей работы.
Приведенные в таблице 12 данные указывают на широкую распространенность лекарственной устойчивости среди стафилококков и факультативных энтеробактерий, выделенных из кишечника. Следует отметить, что у этих микроорганизмов достаточно высока доля штаммов (20-38 %), резистентных к цефалоспоринам (по суммарной доле устойчивых и с промежуточной устойчивостью). Кроме того, от 27 до 52 % исследованных штаммов энтеробактерий и 48 % стафилококков частично или полностью утратили чувствительность к фторхинолонам (ципрофлоксацину), хотя эта группа антимикробных средств стала широко применяться в Самаре всего 4-5 лет назад.
Кроме бактерий нами изучены грибы рода Candida на предмет распространенности устойчивости к антимикробным препаратам. Это вызывало интерес по причине «традиционного» частого назначения врачами общей практики и участковыми педиатрами Самары антимикотиков (нистатина, клотримазола, флуконазола) для профилактики кандидоза при проведении антимикробной химиотерапии в амбулаторных условиях. Результаты исследования 21 штамма Candida albicans приведены на рисунке 3.
Как видно из представленных на рисунке 3 данных, у кишечных штаммов грибов рода Candida наибольшую распространенность получила устойчивость к флуконазолу, нистатину и клотримазолу (от 29 до 48 %). Нами уже указывалось выше, что именно эти лекарственные средства являются самыми популярными у практикующих врачей в г. Самара: первый, возможно, по причине широкой его рекламы, другие - по «традиционной» приверженности к нему врачей среднего и старшего поколения.
Высокая доля штаммов грибов, устойчивых к амфотерицину В (24 %), который не используется в амбулаторно-поликлинической практике в г. Самара, требует, по-нашему мнению, очень осторожной оценки, так как в литературе имеются лишь единичные публикации о наличии резистентности к этому препарату (Кудрина М.И. с соавт., 2005).
Итраконазол и кетоконазол в гастроэнтерологической практике применяются крайне редко, однако устойчивость к ним встречалась у 14-24 % выделенных нами штаммов грибов.
На следующем этапе исследований проводилась оценка распространенности множественной лекарственной устойчивости в популяциях факультативных бактерий кишечника. Данное понятие трактуется различными авторами неоднозначно, а в нормативной документации Министерства здравоохранения и социального развития РФ количественные критерии не указаны. В связи с этим нами при проведении группировки учтена точка зрения M.D.Obritsch et al. (2004), согласно которой к штаммам с множественной лекарственной устойчивостью отнесены резистентные к трем и более разным группам антимикробных средств.
В нашем исследовании изучалась резистентность бактерий к восьми группам препаратов: пенициллинам (ампициллин), макролидам (эритромицин), тетрациклинам (доксициклин), аминогликозидам (гентамицин), цефалоспоринам (цефазолин), фторхинолонам (ципрофлоксацин), нитрофуранам (фурагин) и левомицетину. При проведении расчетов учитывалась только полная резистентность. Промежуточный вариант устойчивости во внимание не принимался, так как в методических указаниях МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (2004) не приведено ссылки на рекомендации Европейской системы по надзору за антибиотикорезистентностью (EARSS) [Brounzwaer S.L.A.M. et al., 1999], согласно которым для интегральной характеристики лекарственной устойчивости к «нечувствительным» штаммам относят умеренно резистентные (т.е. промежуточные) и резистентные микроорганизмы. Окончательным ориентиром в этом вопросе служили рекомендации Администрации по контролю качества пищевых и лекарственных продуктов в США (FDA) не рассматривать промежуточную чувствительность как резистентность.
Кроме того, для энтеробактерий нами не учитывалась резистентность к эритромицину, так как это не было предусмотрено вышеуказанными методическими указаниями (МУК 4.2.1890-04).
Результаты исследований представлены на рисунке 4, из которых следует, что циркуляция факультативных кишечных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью в г. Самара среди лиц с патологией органов пищеварения, протекающей на фоне дисбиоза кишечника, приобрела выраженный характер. Доли полирезистентных штаммов условно-патогенных энтеробактерий составили от 35 до 53 %, золотистого стафилококка - 46 %.
Среди грибов рода Candida распространенность множественной лекарственной устойчивости носила менее выраженный характер, чем у рассмотренных выше бактерий: к полирезистентным (т.е. устойчивым к трем и более группам антимикотических препаратов) относились только 14 % исследованных штаммов. Вместе с тем, доля штаммов грибов, устойчивых одновременно к двум и более группам препаратов, была высокой и составила 48 %.
Эпидермальный стафилококк
Для оценки распространенности лекарственной устойчивости в популяциях эпидермального стафилококка использовали 228 штаммов, которые доминировали в общей структуре коагулазонегативных стафилококков, выделенных от больных в период с 2004 по 2006 год (доля составила 86 %). Следует отметить, что из штаммов, выделенных со слизистой оболочки глоточных миндалин, для исследования использовались только те, которые составляли не менее 80-90 % в структуре обнаруженных микробных ассоциаций. Кроме того, при оценке антибиограмм штаммов из раневого отделяемого учитывались только случаи, когда стафилококк выделялся в чистой культуре (без присутствия других аэробных и анаэробных бактерий).
Перечень локализаций стафилококка, исследуемых биоматериалов и видов патологии приведен в таблице 34.
Результаты сравнительного анализа распространенности лекарственной резистентности среди штаммов золотистого и эпидермального стафилококков, выделенных из влагалища при вульвовагинитах и бактериальном вагинозе, приведены на рисунке 15.
Согласно рисунку 15, ряд опубликованных в периодической медицинской литературе суждений (как правило, не микробиологов) об отсутствии этиологической роли эпидермального стафилококка в развитии воспалительных заболеваний и выделении его из исследуемого биоматериала только как бактерии-контаминанта, применительно к условиям г. Самара не имеют под собой «доказательной почвы». При акушерско-гинекологической патологии распространенность резистентности ко всем исследованным антимикробным препаратам у обоих видов стафилококка - золотистого и эпидермального - была сопоставимой и статистически не отличалась. Это же касалось MRSA и MRSE-штаммов, доли которых составили соответственно 16,2 и 16,4 %.
Другая картина наблюдалась при сравнении золотистого и эпидермального стафилококков, выделенных со слизистой оболочки небных миндалин и из области хирургического вмешательства (рисунки 16 и 17).
Как следует из рисунка 16, доли штаммов эпидермального стафилококка, резистентные ко всем семи испытанным антимикробным препаратам превышали таковые у золотистого стафилококка, причем в отношении ампициллина, доксициклина, гентамицина и эритромицина отличия были статистически достоверными (р 0,05). Полностью повторял эту закономерность и анализ долей MRSA, MRSE (соответственно 8,7 и 52,8 %). Такой высокий уровень распространения MRSE при ангинах и обострении хронического тонзиллита является доказательством этиологической роли генетически измененных вирулентных штаммов эпидермального стафилококка в инфекционной патологии небных миндалин у человека.
Данные, приведенные на рисунке 17, показывают, что, как и в случаях других локализаций, доли штаммов эпидермального стафилококка, резистентных к антимикробным препаратам, превышали таковые у золотистого стафилококка. Однако статистически достоверными эти различия были только в отношении доксициклина (р 0,05). Доля MRSE (35,8 %) достоверно превышала таковую MRSA (11,9 %) в 3 раза (р 0,05).
Необходимо отметить, что частота встречаемости MR.SE, резистентных ко всем семи испытанным антимикробным препаратам, выделенных из влагалища, составила 35,3 %, из небных миндалин - 50,0 %, из области хирургического вмешательства - 10,3 %. Однако среди них встречались также штаммы, резистентные всего к трем химическим классам антимикробных препаратов. Их доли в вышеуказанных локализациях составили соответственно 0,0 %, 16,7 % и 17,2 %.
На следующем этапе исследований проводилось сравнение распространенности лекарственной устойчивости в популяциях эпидермального стафилококка, выделенных из влагалища, небных миндалин и области хирургического вмешательства. Данные анализа представлены в таблице 35.
Из них следует, что отсутствие отличий в частоте циркуляции резистентных к антимикробным препаратам штаммов эпидермального стафилококка в различных экологических нишах тела человека касались только ципрофлоксацина и эритромицина. По всем остальным антибиотикам установлено достоверное превышение долей полностью устойчивых клинических изолятов, выделенных из влагалища и небных миндалин, причем последняя из указанных локализаций была доминирующей в резервации лекарственно-устойчивых штаммов эпидермального стафилококка.
Для сравнительной оценки характера распространенности лекарственной устойчивости и долей полирезистентных штаммов в популяциях эпидермального стафилококка, приуроченных к различным локализациям, проведено их графическое распределение по частоте встречаемости устойчивости к двум и более антимикробным препаратам, трем и более, четырем и более и т.д. Как и в случае с золотистым стафилококком, учету подлежала только полная резистентность (без включения в расчеты промежуточной) к следующим группам антимикробных препаратов: пенициллинам (ампициллин), макролидам (эритромицин), тетрациклинам (доксициклин), аминогликозидам (гентамицин), цефалоспоринам (цефазолин), фторхинолонам (ципрофлоксацин) и левомицетину. Результаты такой группировки приведены на рисунке 18.
Как видно из рисунка 18, распространенность множественной лекарственной устойчивости в популяциях эпидермального стафилококка, выделенных из разных органов и участков тела человека, существенно отличается. Частота встречаемости различных видов сочетанной резистентности к четырем и более антимикробным препаратам была выше всего в микробиотопах носоглотки и влагалища. Доли полирезистентных штаммов (полностью утративших чувствительность к трем и более препаратам разных химических классов из 7 исследованных) в различных локализациях были следующие: влагалище - 73 %, область хирургического вмешательства и небные миндалины - по 61 %. Это подтверждает наше предположение о самостоятельной роли эпидермального стафилококка, обладающего множественной лекарственной устойчивостью, в этиологии воспалительного процесса различной локализации.
Среди 228 исследованных штаммов этого микроба только три были резистентны к ванкомицину и еще три - к имипенему (все шесть относились к MRSE и были выделены из отделяемого ран и небных миндалин).
На заключительном этапе проведено сравнение резистентности и распространенности множественной лекарственной устойчивости в популяциях эпидермального стафилококка, выделенного из влагалища при различных видах акушерско-гинекологической патологии: бактериальном вагинозе (п = 27), бактериальном вульвовагинте (п = 76) и кандидозном вульвовагините (п = 22). Оказалось, что ни по одной из сравниваемых характеристик достоверных отличий не было. Следовательно, объединение бактерий, выделенных при различных нозологических формах заболеваний, но приуроченных к одному и тому же микробиотопу, было допустимым.
Таким образом, проведенные исследования показали, что особенности лекарственной устойчивости эпидермального стафилококка состоят в неравномерности ее распространения в популяциях, выделенных из различных органов и участков тела человека.
Данные сравнительного анализа свидетельствуют о том, что распространенность лекарственной устойчивости в популяциях эпидермального стафилококка, выделенного из влагалища, соответствует таковой у золотистого. Вместе с тем, в других локализациях (небные миндалины, область хирургического вмешательства) доли штаммов эпидермального стафилококка, резистентных к антимикробным препаратам, превышали установленные у золотистого стафилококка.
Оценка условий колонизации микробиотопа влагалища лекарственно-устойчивыми бактериями
На первом этапе исследований определяли особенности состояния микробной экологии во влагалище у больных с наличием полирезистентного штамма бактерий. К оцениваемым параметрам относили:
- частоту отсутствия лактобактерий;
- частоту встречаемости ассоциаций полирезистентного микроба с анаэробами микробиотопа кишечника;
- частоту встречаемости ассоциаций полирезистентного микроба с аэробами, относящимися к факультативным представителям микробиотопа влагалища (стафилококками, коринебактериями, энтерококками, лактозонегативными эшерихиями);
- среднее количество видов факультативных бактерий и их концентрацию в вагинальном секрете.
В качестве методического подхода к решению данной задачи использовали аналитические поперечные эпидемиологические исследования типа «случай - контроль». Для их реализации больных объединили в 2 группы:
1. С наличием полирезистентного штамма («случай»).
2. С наличием микроба того же вида, но не относящегося к полирезистентным («контроль»).
Как и в предыдущих главах настоящей работы, к полирезистентным штаммам относили лактозонегативных эшерихий, энтерококков и коринебактерий, которые обладали полной устойчивостью (без учета промежуточной) к трем и более группам антимикробных препаратов, а среди стафилококков - только MRS А и MRSE.
Правомочность объединения больных с различными видами патологии (бактериальным и кандидозным вульвовагинитом, бактериальным вагинозом) в одну группу обусловлена тем, что в ранее проведенных исследованиях (см. раздел 5.2) нами не установлено отличий в частоте встречаемости различных видов лекарственной устойчивости бактерий, выделенных из одной и той же эпидемиологической локализации. Наряду с этим, из расчетов были исключены микробы, обуславливающие специфику отдельных заболеваний: гарднерелла и грибы рода Candida.
Результаты сравнительного анализа частоты встречаемости и численных значений изученных характеристик микробиотопа влагалища при заболеваниях, ассоциированных с золотистым стафилококком, приведены в таблице 36.
Они свидетельствуют о том, что средняя концентрация MRSA в вагинальном секрете достоверно превышала таковую MSSA почти в 10 раз (р 0,05). Кроме того, при акушерско-гинекологических заболеваниях, ассоциированных с MRSA, средняя концентрация факультативных бактерий также была достоверно выше, чем при колонизации влагалища MSSA.
Присутствие MRSA в 1,7 раза достоверно чаще, чем в случаях с MSSA, сопровождалось значительным снижением содержания лактобактерий (вплоть до их полной элиминации). Это явление было либо условием, либо следствием колонизации слизистой оболочки влагалища MRSA. Для микробиотопов, «заселенных» такими штаммами, было характерным отсутствие кишечных анаэробов и достоверно меньшее количество видов факультативных бактерий, входящих в состав микробных ассоциаций. Это свидетельствовало в пользу самостоятельной (ведущей) роли MRSA в развитии патологического процесса в нижних отделах репродуктивной системы.
Аналогичные исследования были проведены в отношении эпидермального стафилококка. Их результаты, приведенные в таблице 37, не позволили выявить различий в большинстве рассматриваемых характеристик микробиотопа влагалища при его колонизации MRSE и MSSE.
Однако, как и в случае с золотистым стафилококком, присутствие MRSE в 1,5 раза достоверно чаще, чем при MSSE, сопровождалось отсутствием лактобактерий. Предположительно, это можно рассматривать как следствие колонизации влагалища полирезистентными стафилококками.
Данные о состоянии микробной экологии во влагалище при заболеваниях, ассоциированных с энтерококками, приведены в таблице 38. Они показывают, что в случаях его колонизации полирезистентными штаммами этого микроба (как и при MRSA) достоверно реже встречаются ассоциации с другими факультативными аэробными и анаэробными бактериями (стафилококками, энтеробактериями, коринебактериями, бактероидами, пептострептококками и др.).
Это свидетельствует в пользу самостоятельной (ведущей) роли полирезистентных штаммов энтерококков в патологическом процессе. Вместе с тем, клинические изоляты этого микроба, устойчивые всего к двум (и менее) антимикробным препаратам, достоверно чаще встречались на фоне полного отсутствия лактобактерий.
Исследования, проведенные в отношении коринебактерий не позволили выявить каких-либо статистически значимых отличий в характеристиках микробиотопа влагалища, когда его колонизировали полирезистентные
