Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 CLASS Литературный обзо CLASS р :...5
1. Социальное поведение бактерий и бактериальные факторы роста 5
2. Факторы роста при стрессах у бактерий 12
2.1. Стрессу бактерий и реакция на него 12
2.2. «Некультивируемые» клетки бактерий . 13
2.3. Выход бактерий из НК состояния 17
2.4. Белки семейства Rpf-факторы роста и оживления «некультивируемых» форм..Л8
3. Ферменты клеточной стенки бактерий, участвующие в реактивации покоящихся форм 22
3.1 Спора и ее оболочка 22
3.2 Специфические литические ферменты прорастания спор 24
4. Реактивация микобактерий, латентная форма туберкулеза и проблема эффективной вакцинации против него 26
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 38
3.1. Биохимические свойства белков семейства Rpf...,; 38
3.1.1. Оптимизация условий экспрессии и выделения рскомбинантных белков семейства Rpf. 38
3.1.2. Изучение свойств Rpf Micrococcus luteus . .44
3.2. Изучение синтеза Rpf и его гомологов М. tuberculosis в растущей культуре 56
3.2.1. Синтез Rpf в растущей культуре М luteus.. 56
3.2.2. Изучение экспрессии генов гомологов Rpf в культуре Л/, tuberculosis 62
ЗнЗ Действие Rpf на клеточную степку М. luteus 64
3.4 Иммунологические свойства белков семейства Rpf. t 73
Заключение 78
Выводы 81
Литература 82
- «Некультивируемые» клетки бактерий
- Ферменты клеточной стенки бактерий, участвующие в реактивации покоящихся форм
- Оптимизация условий экспрессии и выделения рскомбинантных белков семейства Rpf.
- Изучение экспрессии генов гомологов Rpf в культуре Л/, tuberculosis
Введение к работе
Принято считать, что для культивирования бактерий достаточно обеспечить их нормальной средой роста с необходимым набором питательных веществ, витаминов, микроэлементов, оптимальными физическими условиями. Многие микробиологические методы (высев на плотные среды, метод конечных разведений и т.д.) основаны па постулате, что каждая жизнеспособная клетка в бактериальной культуре обязательно образует популяцию дочерних клеток (колонию или жидкую культуру) в приемлемой для роста среде, и это не требует добавления каких-то специфических факторов, стимулирующих ее деление.
Однако экспериментальная практика показывает, что бактериальная популяция далеко не однородна, часто в ее состав входят клетки, существенно различающиеся как по морфологии, так и физиологически и биохимически (Kell et al., 1991, Koch et al.,-1987, Davey & Kell, 1996). Таким же вариациям подвержена способность к делению.
Хорошо известно, что адаптация бактерий к неблагоприятным условиям, в ряде случаев приводит к образоваїгию специализированных покоящихся форм, таких как споры или цисты. Однако, как стало ясно в последнее время, некоторые неспорулирующие бактерии так же могут образовывать подобные покоящиеся (дормантньте) формы. Это состояние характеризуется резким снижением метаболической активности и полным отсутствием деления. Такие покоящиеся клетки, как правило, характеризуются измененной формой, утолщенной клеточной стенкой и некульти в иру ем остью на твердых и (или) жидких питательных средах. Такие формы в лабораторных условиях требуют специальной процедуры - оживления для восстановления способности к делению. Б природе, при возникновении благоприятных условий, восстановление способности к делению может происходить спонтанно.
Дормантные формы микроорганизмов часто являются причиной реактивации инфекционных заболеваний, таких как туберкулез и некоторые другие тяжелые инфекции. Полагают, что из-за малой метаболической активности покоящаяся форма клеток Mycobacterium tuberculosis устойчива
4 к антибиотикам и может являться резервуаром для хронической туберкулезной инфекций в
организме.
Механизмы, позволяющие бактериям переходить в дормантное состояние и выходить из него, пока недостаточно хорошо изучены. При исследовании условий оживления покоящейся культуры Micrococcus luteus было установлено, что компоненты культуралыюй жидкости активно растущей культуры этого микроорганизма способны стимулировать пробуждение покоящихся клеток. Фракционирование и дальнейшая очистка культуральной жидкости выявили, что "оживляющей" покоящиеся клетки активностью обладает секретируемый М. luteus в среду белок, названный Rpf (от английского - resuscitation promoting factor). Гены, гомологичные rpf обнаружены во многих грам-положительных микроорганизмах, объединяемых в группу Г-Ц богатых бактерий. Согласно базам данных гомологичные гены представлены в таких бактериях, как Mycobacterium tuberculosis (пять генов) и Mycobacterium leprae (два гена), а также в некоторых других микроорганизмах, а именно Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis (БЦЖ), Corynobacterium gtutamicum, нескольких видах Streptornyces, и прочих. Предполагается, что вес белки семейства Rpf в своем составе имеют домен с высокой степенью гомологии, а также вариабельный домен (Рис. 1),
Можно предположить, что белки, кодируемые генами гомологичными rpf у других микроорганизмов, могут иметь схожую с Rpf биологическую активность и обладать пробуждающими свойствами. В связи с этим большую практическую важность приобретает изучение гомологов Rpf из М. tuberculosis, поскольку латентные микобактерии обнаруживаются у 30 % населения Земли и именно они являются причиной реактивационного туберкулеза. Белки семейства Rpf из М. tuberculosis (Rv2450c - Rpf tl, Rv2389c - Rpf t2, Rvl884c ~ Rpf t3, Rv0867 -Rpf t4, Rvl009 - Rpf 15) могут оказаться перспективными кандидатами для включения в состав комплексной субъедшшчной вакцины, которая наряду с обычным туберкулезом могла бы быть протективной в случае реактивации этой тяжелой инфекции.
На момент начала данной работы сведения о том, к какому классу белков (сигнальных, структурных или ферментов) относятся белки Rpf, отсутствовали, также как и какие-либо сведения
5 об их структуре, Поэтому чрезвычайно важным представляется изучение белков семейства Rpf, их
структуры и свойств: биохимических и иммунологических, так как это поможет разобраться в
механизмах образования покоящихся форм, что представляет интерес, как для фундаментальной
микробиологии, так и для прикладной науки, в связи с изучением механизмов ряда
инфекционных заболеваний..
«Некультивируемые» клетки бактерий
Термин «некультивируемостъ» широко обсуждался в литературе (Barer and Harwood, 1999; Kell et aL, 1998), в частности, было предложено определение «жизнеспособные, но не х-ультивируемые» (viable but not culturable (VBNC)) (Roszak and Colwell, 1987), Однако термин «жизнеспособные, но некультивируемые» бактерии весьма противоречив, поскольку под жизнеспособностью клеток в микробиологии понимают именно культи вируєм ость (т.е. способность к размножению в жидкой или на плотной средах) (Postgate, 1967). Такие клетки должны скорее называться потенциально способными к размножению в каких-то конкретных условиях (Kell et al.,1998; Barer, 1997), это мы и имеем в виду под термином некультивируемые (НК). Подобную дефиницию можно дать многим микроорганизмам, поэтому следует определить основные признаки присущие НК-клеткам. Одним из основных критериев можно считать целостность клеточной мембраны: при серьезном повреждении клеточной стенки и мембраны клетку нельзя считать жизнеспособной, следовательно, она не может размножаться ни при каких условиях. Обычно НК клетки имеют уменьшенные размеры, коккоидную форму и утолщенную клеточную стенку (Oliver et al., 1991; Signoretto et ah, 2002; Signoretto et al., 2000; Turpin et ah, 1993). Скорее всего, подобные изменения морфологии помогают клетке переживать стрессовые условия. / Другим важным признаком характерным для НК клеток является изменение метаболизма и уменьшение дыхательной активности. Было показано, что НК клетки Micrococcus luteus имеют недетектируемый уровень дыхательной активности (Kaprelyants and Kell, 1993). В других случаяхх\ (Romalde et al., 1994; Magarinos et al., 3994). В то же время, в других случаях дыхательная активность часто считается признаком жизнеспособности клеток (Boucher et al., 1994; Garcia-Lara et al., 1993; Ramaiah et al., 2002). Также хорошим критерием, позволяющим оценить метаболическую активность клетки, является измерение мембранного потенциала (Kaprelyants and Kell, 1992).
Хотя НК формы микроорганизмов не могут быть культивируемы обычным образом, их нельзя относить просто к поврежденным клеткам, которые способны расти в обычных условиях, но при отсутствии таких селективных агентов как детергенты (Ray and Speck» 1973). В целом, некультивирусмая форма бактерии должна отвечать следующим критериям: целостность КЛСТКЙ, затухание метаболизма, способность к оживлению.
На сегодняшний день известно, что НК бактерии обнаруживаются практически везде, в природе (в почве, в воздухе, в водной среде), в лабораторных условиях, в живых организмах, в пище. Очень часто НК формы патогенных микроорганизмов, обнаруживаемые в естественных условиях, способны стать возбудителями соответствующих заболеваний при проникновении в хозяина (Chaiyanan et al., 2001; Rahman et al., 1996), что конечно не может не вызывать беспокойства.
Для изучения НК форм бактерий необходимо иметь возможность переводить культуры микроорганизмов в подобное состояние в лабораторных условиях, что является вовсе не тривиальной задачей, В большинстве случаев обычное голодание культуры не приводит к нужному результату. Подобные результаты были продемонстрированы со многими микроорганизмами, например, Vibrio anguillarum (Eguchi et al., 2000), Salmonella enteritidis (Chmielewsky and Frank, 1995), Aeromonas hydrophila (Wai et al., 2000; Mary et aL, 2002).
He существует универсальных способов перевода бактериальных культур в НК состояние, можно предположить, что подобная реакция на стресс имеет место в том случае, когда невозможен переход к более мягкой стратегии выживания при голодании. Это возможно, если условия стресса слишком тяжелы, в особенности, если они являются комбинацией нескольких неблагоприятных факторов.
Часто исследуется стационарная фаза культуры, которая вызвана голоданием по определенному параметру или веществу. В разработанной Уэйном модели дормантности для М. tuberculosis, при которой по его определению они «персестируют без деления» (Wayne and Sohaskey, 2001), подобное состояние культуры достигается из-за отсутствия кислорода (Wayne, 1976). Клетки культивируются в запечатанных пробирках, практически до краев наполненных средой, после того, как почти весь кислород заканчивается, клетки синхронно переходят в НК состояние (Wayne 1977). Как было показано (Wayne and Sramek, 1994) у них развивается анаэробный метаболизм, основанный на глиокештатном пути и липидах, как источнике углерода, при этом синтез белка тормозится (Ни et al., ] 998).
Судя по всему, через какое-то время наступает момент, когда персестирующая клетка должна либо погибнуть, либо продолжить рост. Скорее всего, в такой ситуации значительная часть популяции погибает, но за счет этого оставшиеся клетки приобретают возможность поделиться, используя питательные вещества, освободившиеся при гибели других (криптический рост). Так, в случае с М. tuberculosis, клетки, 4 месяца находившиеся в запечатанных пробирках являлись НК в 100% случаев, но потом в течение нескольких месяцев количество КОЕ увеличивалось на 5-6 порядков (Shleeva et al., 2002).
Пекультивируемость - возможно одна из основных стратегий выживания многих микроорганизмов in vivo, В организме хозяина бактерия сталкивается со множеством стрессовых факторов, от низких значений рН и окислительного стресса, до различных агентов бактерицидного действия, которыми хозяин стремится защитить себя от инфекции. Существует множество примеров того, что микроорганизмы пребывают в латентном состоянии в организме хозяина. Потенциально подобные бактерии могут представлять собой скрытый резервуар инфекции, способной к реактивации. До сих пор неясно, представляют ли собой латентные бактерии in vivo поврежденные клетки, или это обычные клетки, супрессировэнные иммунной системой хозяина.
Ферменты клеточной стенки бактерий, участвующие в реактивации покоящихся форм
Как уже отмечалось выше, при образовании покоящихся форм бактерий их клеточная степка претерпевает значительные изменения, такие как утолщение и изменение пептидогликанового слоя. Подобные перемены обусловлены двумя причинами: прежде всего дормантная клетка должна быть защищена от неблагоприятных воздействий, с другой стороны, при наступлении подходящих условий клетка должна быть способной вновь вернуться к активной жизнедеятельности. Изменения, происходящие с клеточной стенкой во время перехода в дормантиое состояние и обратно, и ферменты участвующие в них, лучше всего изучены па примере эндоспор, которые можно считать ттаиболее выраженной формой покоящегося состояния, поэтому мы рассмотрим их именно на этом примере. Вполне возможно, что подобные процессы в большей или меньшей степени характерны и для неспорулирующих бактерий, способных образовывать покоящиеся формы. Однако, эта область остается совершенно неизученной. Наиболее хорошо изучена спора Bacillus subtilis, которую можно охарактеризовать как более или менее обезвоженный протопласт, помещенный в слоистую оболочку (Gerhardt & Marquis, Ї989). Обезвожснность протопласта объясняет устойчивость споры к повышенным температурам. Оболочка споры сильно утолщена и обеспечивает практически непроницаемый барьер для химических и эпзиматических атак (Warth, 1978). В то же время, оболочка споры не обеспечивает состояния покоя и устойчивости к высоким температурам, так как споры, лишенные ее не теряют этих характеристик (Warth, 1978). \у Между внешней оболочкой споры и протопластом существует толстый слой пептидогликанов, который в свою очередь можно подразделить на два подслоя: так называемый кортекс (более толстый слой, расположенный ближе к поверхности), и тонкий слой, называемый базовой клеточной стенкой. Слой базовой клеточной стенки по химической структуре мало отличается от обычной клеточной стенки активной бактерии и при прорастании споры практически не претерпевает никаких изменений (Tipper & Gauthier, 1972; Popham et al., 1996; Atrih et al., 1996,98). Таким образом, базовая клеточная стенка сохраняет целостность клетки при прорастании и является подложкой для нарастания обычной клеточной стенки при выходе из . состояния споры (Atrih et al., 1996,98). Кортекс, состоящий из тех же аминосахаров и аминокислот, что и стенка вегетирующей клетки, имеет совершенно особую структуру, похожую у многих видов бактерий (Tipper & Gauthier, 1972; Warth & Stominger, 1972). Клеточная стенка Б. subtiJis в обычном состоянии представляет собой пептидогликан, состоящий из остатков N-ацетил глюкозамина и N-ацетил мурамовой кислоты, соединенных [Ы-4 связями, дополненных поперечными сшивками, состоящими из три и тетрапептидон, а так же боковыми цепями в виде трипептвдов (Warth & Stominger, 1971). Недавний анализ пептидогликанов кортекса стенки спор этого микроорганизма показал их существенные структурные отличия от пептидогликанов нормальной стенки (Popham et al., 1996; Atrih et al., 1996,98). Было выявлено, что порядка 25 % остатков мурамовой кислоты имеют боковые цепи в виде тетрапептидов, а еще 23 % в виде L-аланина. Однако самым удивительным оказалось то, что почти 50 % остатков мурамовой кислоты представлны в виде 5-лактама, что делает такой пептидогликан невосприимчивым к воздействию таких мурамидаз, как лизоцим, целлозил и некоторых других. При этом количество поперечных СШИБОК в пептидогликане кортекса в 10 раз ниже, чем в обычной клеточной стенке: примерно 3 % против 30 %. Наличие 5-лактама в структуре пептидогликана кортекса является ее наиболее характерным отличием от таковой активно растущих клеток, но при этом сам 5-лактам не задействован в поддержании устойчивости споры к неблагоприятным внешним воздействиям. Споры мутанта cwID В. suhtilis, не имеющие S-лактама были устойчивы в обычных условиях, но теряли способность к прорастанию (Sekiguchiet а!., 1995; Pophametal., 1996; Atrihet al., 1996,98). Говоря о кортексе как о структуре призванной защищать спору от неблагоприятных внешних воздействий, нельзя забывать о том, что полимер кортекса должен гидролизоваться при прорастании споры, чтобы позволить проникновение воды к протопласту и дать возможность клетке перейти в новое качество (Johnstone & ЕНаг, 19S2; Foster & Johnstone, 1990). Был обнаружен целый ряд ферментов, специфически вовлеченных в гидролиз кортекса споры во время прорастания (Hsieh & Vary, 1975; Foster & Johnstone, 1987; Makino et al.» 1994; Moriyama et al,, 1996; Chen et ah, 1997). 3.2 Специфические литические ферменты прорастания спор Ферменты, о которых идет речь, получили специальное название GSLE (germination specific lytic enzymes), отражающее суть их действия, В ряде работ было показано что 5-лактам -специфический компонент кортекса, является тем компонентом, который необходим для активности данной группы белков (Popham et al., 1996; Atrih et al., 1996,98). Подобные ферменты, нуждающиеся в 5-лактаме и неспособные гидролизовать пептидогликан обычных клеточных стенок были найдены у многих микроорганизмов; В. megaterium № (Foster & Johnstone, 1987), В. cereus IPO 13597 (Makino et al., 1994), Clostridium perfringins S40 (Chenet ak, 1997). Фрагменты пептидогликана, попадающие в среду при гидролизе кортекса во время прорастания спор, указывали на действие как минимум двух типов гидролитических ферментов (Atrih et al., 199S). Одни продукты указывают на N-ацетилглкжамидазу которая разрезает гликановые тяжи кортекса, другие свидетельствуют о трапегликозилазиой активности. Некоторое время назад GSLE белки из спор р азличиых микроорганизмов начали описывать на молекулярном уровне. В 19S7 году Фостер и Джоистоп выделили из прорастающих спор В. megaterium фермент с молекулярной массой 29 кДа, который вызывал у спор изменения сходные с таковыми при прорастании. Анализ, проведенный при помощи антител, полученных к этому белку, выявил его присутствие в кортексе покоящихся спор. Также в спорах других видов микроорганизмов были выявлены белки, перекрестно реагирующие с этими антителами (Foster &. Johnstone, 1988). Эксудат полностью проросших спор В. cereus IFO 13597 содержал белок с молекулярной массой 24 кДа, вызывавший потерю поглощения в препарате спор, лишенных внешней оболочки (Makino et al., 1994), Ген sIeB7 кодирующий этот белок был клонирован и секвенирован, выяснилось, что это белок, состоящий из 259 аминокислотных остатков и имеющий сигнальную последовательность из 32 аминокислот (Moriyama et al. 1996), в той же работе было показано, что этот белок скорее всего является амидазой. Прорастающие споры Clostridium perfr mgins S40 секретируют в культуральную жидкость два вида GSLE (Miyata et al. 1995; Chen et ah, 1997); Первый из них - SleC, является амидазой с молекулярной массой 31 кДа, которая пековалентно присоединена к внешней стороне кортекса (Miyata et ah, 1995). Сиквенс гена данного белка выявил на его С-конце участок гомологичный нескольким пептидогликан гидро лазам, в частности амидазе CwlL из В. subdlis (Miyata et ah» 1995)-Второй белок — SleM представляет собой мурамидазу с молекулярной массой 38 кДа, так же локализованную на внешней поверхности кортекса (Chen et ah, 1997).
При анализе полного генома В. suhtilis, по гомологням с ранее известными генами других микроорганизмов, были идентифицированы три гена, кодирующие GSLE: cwlJr ykvTr sleB, Было показано, что последний из них кодирует амилазу задействованную при пробуждении спор (Moriyama et ah, 1996). При направленной инактивации cwlJ или sleB наблюдались изменения на поздних стадиях прорастания спор В. subtilis, а мутант, нокаутированный по обоим генам, полностью терял способность к прорастанию спор (Ishikava et ah, 1998). Подобные исследования свидетельствуют о том, что для выхода из состояния споры специализированные GSLE белки совершенно необходимы и что подобный механизм характерен для различных групп микроорганизмов (Atrih & Foster, 1999).
Оптимизация условий экспрессии и выделения рскомбинантных белков семейства Rpf.
Rpf-подобпых белков затем были встроены в вектор рЕТ 19b (Novagen) по сайтам Nde I и Ват \\\, Hisag, последовательность из 10 гистидиновых остатков, позволяющая выделять белки с помощью афинной хроматографии на заряженной никелем колонке, располагалась на N-копце рекомбинаптных белков (Mukamolovact al., 1995), ry Методики стимуляции клонов и выделения белков, однако, не были отработаны применительно к каждому из них. Кроме того, опробованная ранее в лаборатории процедура выделения Rpf на конечном этапе очистки предполагала использование достаточію трудоемкую , W процедуру FPL С-хроматографии на мопо-Q колонке (Mukamolova et al.f 1995), Поэтому, первостепенной задачей данной работы была оптимизация методов стимуляции экспрессируюпшх клонов и выделения рекомбипаптных белков Rpf, Rpf tl, Rpf t2, Rpf t3, Rpf t4, Rpf t5. A В качестве основы для выделения рекомбипантных белков были использованы рекомендации фирмы Novagen, разработавшей векторы серии рЕТ и сответствующую систему экспрессии. По сравнению с базовой процедурой концентрацию IPTG была увеличена до 0,6 мМД ампициллина до 200 мг/мл, а также подобрано время экспрессии (см. методы). Кроме того, проводили отбор индивидуальных клонов клеток с максимальным уровнем экспрессии среди э ксп рсс сирую щи х клонов. С помощью этого подхода нам удалось подобрать высокоэкспрессирующие клоны Rpf, Rpf tl и Rpf t5. Введенный модификации позволили повысить уровень экспрессии этих белков примерно до 20% от тотального клеточного белка Е. coti. Экспрессия двух белков - Rpf t2 и Rpf t3f однако, оставалась чрезвычайно низкой (0.1-0,05 мг/л культуры). Предположительно, такой уровень экспрессии объяснялся токсичностью белков для кишечной палочки. По-видимому, указанное явление привело к отбору слабо экспрессирующих клеток в культуре штамма-продуцента. Для повышения экспрессии белков Rpf t23, использовали "свежетрансформированные" клетки, содержащие плазмиду со встроенным геном рекомбинантных белков, и уже среди них проводили селекцию клон о в-суперпродуцентов. Предполагалось, что свежие "наивные" клетки Е.соїі не успеют выработать механизмы защиты для инактивации белков Rpf и , таким образом, смогут иметь более высокий уровень экспресии проблемных белков. Для этого из штам мов-продуцентов Rpf t23 была выделена плазмидная ДНК которой были трансформированы компетентные клетки HMS174(DE)3 с последующим высевом на чашки с агаром с добавлением ампициллина (10 мкг/мл) для селекции на наличие плазмиды. Некоторые из полученных клонов были отобраны и охарактеризованы методами SDS -электрофореза (лизата клеток) с последующим иммуноблоттингом. Надо отметить, что "свежие" трансформанты, как и ожидалось, имели в несколько раз более высокий уровень экспрессии, чем исходные клетки-продуценты. Среди новых трансформантов были отобраны клоны, продуцировавший наибольшее количество белков Rpf t2- t3, В результате такой процедуры удалось повысить уровень экспрессии до 1,5-2,0 мг/литр культуры. Таким образом, нам удалось довести уровень экспрессии рекомбинантных белков из соответствующих штаммов-продуцентов до следующих значений: Rpf— 12-15 мг из литра стимулированной IPTG культуры Rpf ti -15-17 мг/литр культуры Rpft2,Rpft3 - 1,5- 2,0 мг/литр культуры Rpf 14-2-3 мг/литр культуры Rpf t5 - 8-10 мг/литр культуры 80[:Да
Рис, 4. 30 шсктрофорсгратед, характеризующая выделяемые нами рскомбнтштзые бе.ікн есмеїїстта Rpf, 1- маркеры молекулярное массы. 2 -Rpl 15, 3 -Rpft4,4- Rpt3. 5- Rpf42, 6 -RpftU7-Rpf,
Все выделяемые белки были охарактеризованы при помощи SDS-эл-ектрофореза в ПААГ ц иммурюблотгаига; для последнего нс-ігользошлись иоликпо1шлг ныь антитела, полученные против Rpf, Степень очистки препаратов рекомбянантны бегжпй превышала 95% (опешналаеь сканированием SDS-r CKi oiliopcrpaMM). ЗЛ.2. Изучение свойств Rpf Micrococcus luteus
Так как белок Rpf был открыт в нашей лаборатории незадолго до начала работы над данной диссертацией, сведений о его физико-химических свойствах практически не было. Для того, чтобы установить в каком состоянии (мономолекулярном, полимерном) пребывает выделенный рекомбинантный белок и сильно ли он отличается от нативного белка М. luteus из супериатанта бактериальной культуры соответствующие препараты белков были подвергнуты HPLC гель-фильтрации на колонках BioSep 2000 и TSK 2000,
Рекомбинантный Rpf В случае рекомбинантного белка, основная его масса была представлена в виде мономера (Рис. 5А), по при хранении как при + 4С, так и при - 20С, в течение, короткого времени наблюдалось возникновение крупных агрегатов, часть из которых представлена формами с молекулярной массой 140 и более кДа, а часть агрегатом с массой 85 кДа (Рис. 5В), Л
Изучение экспрессии генов гомологов Rpf в культуре Л/, tuberculosis
В целом, этот этап работы позволил установить, что накопление Rpf у М. lutem в среде происходит на протяжении всего активного роста культуры, начиная с самых ранних его стадий. Однако в стационарной фазе синтез Rpf полностью прекращается и белок исчезает из среды. В свою очередь это может означать, что белок Rpf каким-то образом связан с делением клеток и, возможно, принимает непосредственное участие в этом процессе. В то же время, было установлено наличие мРНК всех пяти гомологов Rpf в клетках растущей культуры М. tuberculosis, что может свидетельствовать об экспрессии этих белков в культуре. 3.3 Действие Rpf на клеточную стенку Л/, tuteus
При изучении воздействия Rpf на культуру М. luteus наблюдается одно любопытное явление. При выращивании на бедных средах, таких как лактатная, бактерии микрококка склонны образовывать крупные агрегаты, что, скорее всего, является ответом на недостаток питательных веществ. Нами было отмечено, что при добавлении Rpf к культуре, пребывающей в подобном сильно агрегированном состоянии, происходила частичная дезагрегация клеток и размеры агрегатов в целом уменьшались. Так если до воздействия белка агрегаты могли насчитывать сотни клеток, то после добавления Rpf основная часть агрегатов состояла уже максимум из двух трех десятков клеток, и количество единичных бактерий возрастало.
Предположительно, данное явление может быть связано с некой гидролитической активностью, способствующей дезагрегации клеток за счет модификации (разрушения) неких связей в поверхностных структурах микрококка (клеточной стенке). Наличие «ферментов дезагрегации» действительно было обнаружено для ряда бактерий. Для того чтобы проверить наши предположения, мы решили выяснить оказывает ли Rpf какое-либо воздействие на клеточные стенки микрококка. Для этого измеряли во времени оптическую плотность препарата лиофилизированных клеток микрококка после добавления к ним рекомбинантного Rpf (рис. 17). 20 ;
PUCL IT Изменение оптической шіотносш препарате л иофи локированных клеток М lufeus в 20мМ трис-буфере рН 8 йод дейсшем препарата решмбинантного Rpf, а так же рекомбинантных ftpf 6елюв? подвергнутых саш"-а аггравле шому мутагхншу. Эл,ОКАН -злвдат, содержит дативный Rp выделенньай на колонке DHAE щ оупернатанта. Эл рЬТ -контрольное выделение ржомбинантного Rpf из штампа К соїк содержащего пустой вектор без гепа Rpf Myx.ES решмбшіантішй Rpf с "тмеиой шутами на -13 в RS-фрагментс на глутаминовую к-ту, MyxCys - КрГ с заменой обоих цистепжга в тжерватившш ломенс (Сук 50 на Lys, Сув 110 на Thr). Rpf р«Л - препарат рфкомб&гнантнот Rpf Концентрации ретомбинантеого Rpf - 15 мкг/мл, ДНК» конструкции для :жотре хин Rpf с замонганьши аминокислотами были любезно предоставлены ПМук&моловой, Все стадіта очистки мутанти ых форм Rpf шатветствдаали стандартному ііротоголу шшуадшя нешмшбниой формы Rpf. Из рпс, 17 Ш ДЙ0Ч то при добавлении реюмбииаятного Rpf к ярегарату лшфилшйро&атш &лєток шікрококіса происходит падение оптической плотности, в конечном итоге иритодятее к умснышкшр оптической плотности примерно до 60% от начальной. Можно предположат что данный эффект является отражением гидролитической активности, присущей Rpf. Столь медленное падение оптической плотности, скорее всего, связано со специфичностью Rpf Вероятно, он гидролизует какие-то связи, расщепление которых не приводит к глобальным изменениям в структуре крупных частиц клеточной стенки, ведущим к их полному распаду, что могло бы привести к существенному и быстрому падению оптической плотности, как это происходит под действием лизоцима. Скорее всего, действие Rpf, в отличие от лизоцима, не приводит к к тотальному гидпролизу клеточной стенки, а модифицирует структуру составляющего ., ее пептидогликана, разрушая некоторые связи и делая ее более рыхлой. Возможно, именно из-за подобного воздействия на клеточную стенку белок обладает способностью дезагрегировать клетки микрококка- явление, которое было отмечено выше.
При компьютерном анализе последовательности консервативного домена Rpf специальные программы обнаруживают сходство третичной структуры с так называемым лизоцимо-подобным фолдом, образуемым характерно расположенными в пространстве тремя альфа спиралями. (Рис, 18). Действиетельно, при моделировании возможной структуры консервативного домена наиболее веростной структурой оказалась таковая .близкая к структуре фрагмента лизоцима в районе о1 активного центр (данные любезно предоставлены д-ром А.Мурзиным- Великобритания) (Рис.18)
