Введение к работе
Актуальность проблемы. Бурно развивающиеся в последние годы технологии флуоресцентной микроскопии позволили визуализировать многие биологические процессы. Одним из важнейших инструментов изучения живой клетки являются флуоресцентные маркеры, дающие возможность проводить наблюдение за целевыми структурами или процессами в режиме реального времени. Особенно широко используются генетически кодируемые метки - флуоресцентные белки семейства зеленого флуоресцентного белка GFP, а также некоторые химические флуоресцентные красители.
Белки семейства GFP широко известны благодаря уникальному механизму формирования хромофорной группы. В отличие от обычных ферментов, производящих какую-либо одну реакцию множество раз, флуоресцентные белки в ходе своего созревания один раз проводят 2-3 совершенно разные реакции, приводящих к синтезу хромофора внутри молекулы белка за счет модификаций собственных аминокислотных остатков. Исследования последних лет показали большое разнообразие спектральных характеристик и структур хромофоров в GFP-подобных белках.
Синтез модельных хромофоров флуоресцентных белков тесно связан с проблемой определения химического строения нативных хромофоров. В настоящее время рентгеноструктурный анализ стал основным методом исследования структуры хромофоров в различных флуоресцентных белках. В то же время, кристаллографическое определение структуры не всегда допускает однозначную интерпретацию и малоинформативно при изучении химии и фотохимии хромофоров. Несмотря на то, что ковалентная структура большинства известных белковых хромофоров считается надежно установленной, детали стереохимии, кислотно-основных взаимодействий, а также реакционной способности возбужденного состояния остаются недостаточно изученными. Именно поэтому синтез и изучение низкомолекулярных модельных соединений остаются важными задачами, особенно ввиду возрастающего разнообразия известных структур хромофоров.
Таким образом, синтез модельных соединений позволяет установить строение хромофоров в белках, изучить спектральные характеристики их и их аналогов, моделировать влияние белкового окружения. В перспективе модельные соединения могут быть использованы при изучении механизмов созревания и функционирования хромофоров, а также с целью создания новых флуоресцентных красителей с уникальными свойствами.
Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение взаимосвязи структура -спектральные свойства в ряду хромофоров флуоресцентных и окрашенных белков -гомологов GFP, а также исследование структур хромофоров двух белков: пурпурного хромобелка asFP595 (Ammonia sulcata) и желтого флуоресцентного белка zFP538 (Zoanthus sp.). В рамках сформулированной цели были поставлены задачи:
Разработать метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов, имеющих ацильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода синтезировать хромофор окрашенного белка asFP595, изучить его спектрохимическое поведение в различных условиях.
Разработать новый метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов, имеющих функционализированный этенильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода синтезировать хромофор флуоресцентного фотопереключаемого белка Kaede (красная форма). Синтезировать структурные аналоги хромофора Kaede, соответствующие замене гистидина и/или тирозина в хромофоре на другие аминокислоты. Изучить сольватохромные и кислотно-основные свойства в данном ряду хромофоров. Изучить ауксохромные свойства заместителей в хромофоре Kaede.
Синтезировать хромофор желтого флуоресцентного белка zFP538. Выяснить структурную основу его сложного рН-зависимого спектрального поведения.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые разработаны методы синтеза хромофоров флуоресцентных и хромобелков - гомологов GFP, поглощающих и флуоресцирующих в красной области видимого спектра. Указанные хромофоры представляют собой 5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-оны, несущие заместители с различными функциональными группами в положении 2 имидазола. Впервые синтезированы хромофоры пурпурного хромобелка asFP595, красного фотоконвертируемого флуоресцентного белка Kaede и желтого флуоресцентного белка zFP538. Синтетические хромофоры позволили провести детальный анализ ауксохромных свойств заместителей в данном ряду окрашенных соединений, а также их сольватохромных и кислотно-основных свойств. На основе полученных данных был предложен ряд перспективных направлений для направленного изменения свойств флуоресцентных и окрашенных белков. Выявлена химическая природа сложного спектрального поведения хромопептидов из белка zFP538, приведшего к неправильному определению их структуры. Уточнена структура хромофора zFP538. Обнаружена необычная перегруппировка 2-ацил-5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов в уникальные производные 2,6-дикетопиперазина, встречающиеся в природе среди метаболитов грибов. Полученные в настоящей работе флуорогены (красители, практически нефлуоресцентные в свободном состоянии в растворе, но приобретающие яркую флуоресценцию после прочного связывания с целевой молекулой, например, белком или ионом металла) и их аналоги могут найти применение для различных флуоресцентных методов детекции.
Апробация полученных данных и публикации. Основные материалы диссертации были доложены на международном симпозиуме Advances in Science for Drag Discovery (Москва, 2005) а также на IX чтениях памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009). По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 109 страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 141 ссылку. Диссертация содержит 14 рисунков, 25 схем и 7 таблиц.
