Введение к работе
Актуальность проблеми.
Цитохром Р-450-содержащая монооксигеназная система микросом печени является ключевой ферментной системой, отвечающей за окисление низкомолекулярных чуяеродных соединений, с последующим удалением их метаболитов из организма экскреторными органами [Archakov АЛ. & Bachraanova G.I., 1990; Parke et al., 1991]. В связи с важностьп реакций гидроксилирования, протекавдих с участием цитохрома Р-450, исследователями уделяется большое внимание искусственным системам, позволяющим моделировать реакции іяікрссомального окисления. Обычно в этих системах в качестве косубстрата пріменяется нэ hadph, а гадроперикись кумила (ГПК) или перекись водорода (I^Og), что позволяет использовать содержащийся в них активный кислород для непосредственного окисления низкомолвкулярных субстратов [Метелица Д.И., 1982; Карузина И.И. я соавт., 1983; Archakov A.I. & Baohmanova __ G.I., 1990].
Наряду с хорошо изученной детоксицируодей функцией мояооксигеназной системы, было установлено,- что в процессе окисления возмояно образование високотоксичних промежуточных метаболитов, способных ковалентно связываться с биомакромолекулами (нуклеиновыми кислотами, белками, а также с фосфолшвадшм бислоем мембран) [Арчаков А.И. и соавт, 1980; Ковалев И.Е., Полевая O.D., 1985; Glllete, 1974, Lutz, 1979; Catkins,1990; Johnson,1992; Uurrau et al,1992]. Особенно хорошо этот процесс изучен на примере полициклических ароматических углеводородов, в частности 3,4-бензпирена [Nebert et al., 1982].
Ковалентная модификация реакционноспособдами метаболитами низкоколекулярннх соединений бпомакромолекул . может приводить к мутагенезу, канцерогенезу, некрозу тканей и' развитии других патологических состояний ІАаев et al., 1975; Nebert & Jensen, 1979; Шіет * МШег,198г; Cuengerioh et al., 1990; Miles & Wolf, 1991; Eberhart et al.,1992). Так например, в случае ковалентной модифікацій! метаболитами низкомолвкулярных соединений водорастворимых белков образуется конгюгированный антиген, который, попадая в кровь, индуцирует, согласно теории Лапдитейнера [Land3telner, 1936], синтез антител, специфичных к
низкомолекулярной детерминанте. Протекание подобной реакции в организме экспериментальных кивотшх било продемонстрировано в работе Арчакова А.И. и соавт. [1980]. Как следствие зтої-о процесса возможно возникновение аллергичесісих заболеваний.
Вместе с тем, необходимо отметить, что в процессе такой модификации таюке возможно изменение иммунологических свойств высокомолекулярного соединения, что вызовет индукцию синтеза антител, специфичных к модифицированному макроносителю. Цель и задачи исследования.
Целью данной работа явилось получение конъюгатов продуктов окисления 3,4-Оензпирена с Оелками, катализируемое цитохромом Р-450, с последующим анализом иммуногенности образующихся конъюгированных антигенов.
Эта цель предусматривает решение следующих задач:
-
Сравнение скоростей окисления 3,4-Сензпирена (БП) микросомамм контрольных и индуцированных животных в полной и шунтировании* системах.
-
Сравнение скоростей окисления 3,4-0ензпиренв в микросомах и монооксигеназных растворимых реконструированных системах (РРС) при использовании в качестве косубсгратов NADPH, ГПК и Н202.
-
Наховдениа условий наиболее интенсивного . ковалентного связывания метаболитов 3,4-бензпирена с кроличьим сывороточным альбумином (КСА).
-
Синтез конъюгатов метаболитов БП с КСА и БП с микросомольной фракцией печени кролика (МКК ), катализируемые цитохромом Р-450, в присутствии косубстрата,' при котороь наблюдается наиболее интенсивное связывание мотаболитої 3,4-бенэпирена с КСА.
-
Определение иммуногенности конъюгатов матаболитої 3,4-Оензпирена с КСА или микросомами кролика по появлению і циркулирущей крови как антител к 3,4-бензпирену, так і лимфоцитов, несущих на своей поверхности рецепторы, связывании» БП.
-
Выявление антител к высокомолекулярному носителю (КСА ковалентно модифицированному метаболитами БП.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В результате проведенных экспериментов по изучени
скорости окисления Бїї. шкросомаш различных уипов индукций и в РРС, а также исходя из дашгых по измерению ковалентного связиваїшя метаболитов БП с КСА, показано, что БП относится к группо субстратов, механизм окяслотая которых различен в пунтиропанных системах и в полном монооксигеназной цикле. Показано,' что максимальное количество метаболитов БП, связывающихся с альбумином, наблюдается при добавлении в среду инкубации микросом почепи кроликов, индуцировании: 3-метилхолантреном (ЮС), а в качестве кофактора - madph.
Выявлено, что иммунизация кроликов коваленогносвязанными конъюгатами БП-КСА и БП-МКК_ приводит к появлению антител,' специфичных к БП не только в крови хивотных, но и на лимфоцитах.
Установлено, что при иммунизации кроликов ковалентносвязан-ными конъюгатами БП-КСА или БП~МКК_, синтезированными в микросомальной монооксигеназной системе, наблюдается синтез антител, не только к низкомолекулярной детерминанте, но и к аллогенному высокомолекулярному носителю (альбумину), модифицированному продуктами окисления БП.
Основная часть работы представляет интерес в понимании функциональной роли цигохрома Р-450 печена животных и человека. Экспериментальные подходы данной работа в настоящее время применяются в ряде лабораторий, занимащихся исследованием микросомальной монооксигеназной системи пачеш и окислением ксенобиотиков, а также в иммунологических лабораториях. Результаты работы используются в учебном процессе в спецкурсах на кафедре биохимии медико-биологического факультета РГМУ.-.
Апробация диссертации. Результаты исследований были доложены на Всесоюзных конференциях "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды" (Новосибирск, 1987), "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), на 7-ой Международной конференции "Biochemistry & Biophyalos of Cytochrome P-450; Structure & Function, Bioteohnologioal & Ecolopical Aspects" (Москва, 1991), а также на совместном заседании учебно-научного комплекса кафедры биохимии МВФ 2-го МОЛГМЙ им. Н. И.Пирогова и института биологической и медицинской химии АМН СССР (26 июня 1991).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 .печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 126
страницах машинописного текста, включая 12 рисунков и 12 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, экспериментальной части с результатами исследования,, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы.
