Введение к работе
Актуальность проблемы.1
Интенсивное развитие нанотехнологий, разработка новых методов получения наночастиц различной химической природы обусловливают интерес к их применению в качестве реагентов для in vivo и in vitro биохимических исследований. Научная активность, связанная с различными аспектами применения на-ночастиц в биологии, непрерывно растет. По данным «Web of Science», количество статей по этой проблематике на протяжении последнего десятилетия выросло в 20 раз, что подтверждает востребованность проводимых исследований.
Большая удельная поверхность наночастиц позволяет получать на их основе конъюгаты с высоким содержанием биомолекул, проводить быстрые взаимодействия в растворе с последующим отделением образовавшихся комплексов от непрореагировавших соединений. Особый интерес представляют нано-частицы как реагенты для биохимических методов анализа, что обусловлено возможностью их высокочувствительного детектирования на основании оптических, электрических, магнитных или иных свойств, а также зависимостью свойств наночастиц от размеров, позволяющей проводить одновременное выявление нескольких соединений. Применение наночастиц в качестве носителей и маркеров обеспечивает простоту детекции, достижение низких пределов обнаружения и ускорение специфических взаимодействий, лимитирующих продолжительность анализа.
Несмотря на большое число получаемых и характеризуемых препаратов наночастиц, лишь немногие из них используются в биохимических методах анализа. При этом выбор наночастиц продолжает оставаться в значительной степени эмпирическим. Остается неясным, какие (по размерам и поверхностным свойствам) препараты наночастиц оптимальны для использования в анализе, какой состав конъюгатов наночастица – биорецепторная молекула обеспечивает минимальный предел обнаружения, при каких способах получения данных
Используемые сокращения и обозначения: АТ – антитела; БСА – бычий сывороточный альбумин; ДРС – динамическое рассеяние света; ИФА – иммуноферментный анализ; ИХА – иммунохроматографический анализ; КвТ – квантовые точки; КвТNNN – квантовые точки с пиком эмиссии при длине волны NNN нм; КЗ – коллоидное золото; ОВА – овальбумин; ОФЛ – офлоксацин; ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия; СИТ – соевый ингибитор трипсина; СТМ – стрептомицин; ХФ – хлорамфени-кол; EDC – гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N’-этил-карбодиимид (N-(3-dimethylamino-propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride); IgE – иммуноглобулин Е; IgG – иммуноглобулин G; sulfo-NHS – сульфо-N-гидроксисукцинимид натрия (sulfo-N-hydroxysuccinimide); кв – квантовый выход флуоресценции.
конъюгатов функциональные свойства их компонентов сохраняются в максимальной степени, как влияет выбор наночастиц-маркеров на режим формирования детектируемых комплексов. Решение этих вопросов существенно повысит эффективность применения наночастиц в биохимических исследованиях.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что нанодисперсные частицы являются перспективными реагентами для исследования биохимических взаимодействий и создания новых биоаналитических систем, а изучение свойств конъюгатов наночастиц с биомолекулами представляет собой крайне актуальную задачу.
Цель диссертационной работы заключалась в изучении свойств комплексов антител с нанодисперсными маркерами разной природы и применении полученных реагентов для разработки новых иммунохроматографических тест-систем.
Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач, определяющих структуру исследования:
-
охарактеризовать размерные и оптические свойства конъюгатов антител с наномаркерами разной природы,
-
определить и сопоставить кинетические и равновесные константы взаимодействия с антигеном конъюгата антитело–флуоресцентный маркер (квантовая точка) и немодифицированных антител,
-
изучить закономерности взаимодействия иммунореагентов, меченных нанодисперсными маркерами, в иммунохроматографических тест-системах с фото- и флуориметрической детекцией и провести сравнительную оценку этих тест-систем,
-
разработать иммунохроматографические тест-системы с одним и несколькими флуоресцентными нанодисперсными маркерами и определить их аналитические параметры,
-
охарактеризовать возможности повышения информативности иммуно-хроматографии посредством проведения мультиплексного анализа с двумерно упорядоченным массивом зон связывания разной специфичности.
Научная новизна работы.
Изучена степень сохранения функциональных свойств компонентами конъюгатов квантовые точки – антитела. Показано сохранение конъюгатами от 70 до 97% интенсивности флуоресценции. Проведена сравнительная характеристика взаимодействия с антигеном свободных и конъюгированных с квантовыми точками моноклональных антител к антибиотику хлорамфениколу. Показан рост кинетических и равновесных констант связывания антител в составе конъюгатов.
Охарактеризована взаимосвязь между пределами детекции нанодисперс-ных маркеров – коллоидного золота и квантовых точек – в гомогенных и гетерогенных системах и минимальными концентрациями аналитов, определяемыми с помощью иммунохимических тест-систем на основе этих маркеров.
Практическая значимость работы.
Показано, что использование флуоресцентного маркера, квантовых точек, обеспечивает снижение предела детекции мембранного иммуноанализа в 24 раза по сравнению с колориметрическим маркером, коллоидным золотом.
Разработаны и апробированы иммунохроматографические тест-системы на основе квантовых точек для определения содержания антибиотика хлорам-феникола в молоке и иммуноглобулина Е в сыворотке крови человека. Показана возможность количественного определения аналитов при регистрации флуоресценции с помощью портативного детектора. Проведена метрологическая характеристика разработанных тест-систем.
Предложен формат мультиплексного иммунохроматографического анализа с использованием в качестве маркеров квантовых точек с разными спектрами эмиссии. На основании данного подхода реализована тест-система для одновременного контроля содержания трех антибиотиков разных классов по исчезновению красной, желтой или зеленой аналитической линии.
Предложен формат мультиплексного иммунохроматографического анализа, основанный на формировании на мембране упорядоченного двумерного массива зон связывания с реагентами разной специфичности. На основании данного подхода разработана тест-система для одновременного контроля содержания психоактивных веществ разных классов.
Положения, выносимые на защиту.
-
Установлена высокая степень сохранения интенсивности флуоресценции квантовыми точками (ядро CdSe / оболочка ZnS) разного размера в составе конъюгатов с антителами.
-
На модели взаимодействия с хлорамфениколом количественно установлено сохранение антигенсвязывающих свойств антителами, ковалентно иммобилизованными на поверхности квантовых точек.
-
Показаны преимущества квантовых точек по сравнению с наночасти-цами коллоидного золота при использовании в иммунохроматографии в качестве маркеров для антител.
-
Разработана иммунохроматографическая тест-система, основанная на применении квантовых точек, для определения уровня иммуноглобулина Е в сыворотке крови человека.
-
Предложено использование квантовых точек с разными спектрами эмиссии для иммунохроматографического определения трех соединений по исчезновению красной, желтой или зеленой аналитической линии (тест-система «светофор»).
-
Предложен способ проведения мультиплексного иммунохроматогра-фического анализа, основанный на формировании аналитической зоны в виде двумерного массива точек с реагентами разной специфичности.
Связь работы с государственными программами. Работа выполнена
при поддержке Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы».
Личный вклад диссертанта. Диссертантом проведена основная часть
экспериментальных работ, представленных в диссертации, обработка полученных данных, подготовка материала к публикациям.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на следующих мероприятиях: научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва–Пущино, 2011); V международный симпозиум «Recent advances in food analysis» (Прага, Чехия, 2011); IV международный форум RUSNANOTECH (Москва, 2011); 2-ая международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Московская область, 2011); Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012); VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013); Второй съезд аналитиков России (Москва, 2013), I Международная научно-практическая конференция «Современная химико-токсикологическая экспертиза» (Москва, 2013), VII международный симпозиум «Hormone and veterinary drug residue analysis» (Гент, Бельгия, 2014).
Диссертационная работа представлена 28 мая 2014 г. на межлабораторном семинаре Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 9 тезисов в материалах отечественных и международных конференций.
Объем и структура работы.
