Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 8
1.1. Глюкоамилаза и ее свойства 8
1.2. Стабилизация и иммобилизация глюкоамилазы . 14
Глава 2. Методика проведения исследований 50
2.1. Материалы исследований . 50
2.2. Методы исследований 52
Глава 3. Результаты и их обсуждение 63
3.1. Исследование каталитической активности и стабильности препаратов глюкоамилазы в зависимости от способа иммобилизации и вида носителя 63
3.2. Обоснование использования госсипола в качестве сшивающего агента для ковалентной иммобилизации глюкоамилазы 73
3.3. Гидролиз иммобилизованными глюкоамилазами концентрированных растворов крахмала в периодических условиях 102
3.4. Непрерывный гидролиз крахмала 106
3.5. Практическое значение полученных результатов и их использование 118
Выводы 121
Литература 123
Приложения 148
- Стабилизация и иммобилизация глюкоамилазы
- Методы исследований
- Исследование каталитической активности и стабильности препаратов глюкоамилазы в зависимости от способа иммобилизации и вида носителя
- Гидролиз иммобилизованными глюкоамилазами концентрированных растворов крахмала в периодических условиях
Введение к работе
В Продовольственной Программе СССР, принятой майским Д982 г./ Пленумом ЦК КПСС, в числе мероприятий, направленных на увеличение продовольственных ресурсов страны, названо развитие производства сахаристых веществ из крахмалсодеркащего сырья и из других видов сырьевых ресурсов, а также расширение производства полноценных заменителей сахара. Для осуществления этих задач необходима разработка биотехнологических процессов производства продукции, используемой в медицине, сельском хозяйстве и промышленности. К таким процессам относится получение глюкозы из крахмалсодеркащего сырья с помощью амилолитиче-ских ферментов. Минимальная потребность в глюкозе в СССР по данным ВНИИ крахмалопродуктов к 1990 году составит около 250 тысяч тонн в год. В связи с этим проблема получения и рационального использования ферментных препаратов амилолитического действия для совершенствования технологических процессов в пищевой промышленности имеет первостепенное значение. В ферментативном гидролизе крахмалсодержащего сырья центральное место занимает использование фермента глюкоамилазы, которая позволяет получать гидролизаты с содержанием глюкозы 96-99%. Потребность народного хозяйства только в очищенных препаратах глюкоамилазы, согласно оценке Минпищепрома СССР, на 1990 год оценивается около 3000 тонн.
Значительное сокращение расхода этого фермента, а также создание новых биотехнологических процессов с применением достижений биоинженерии возможно при использовании иммобилизованных форм глюкоамилазы.
Имеется достаточно большая литература по различным методам иммобилизации глюкоамилазы. Однако критический анализ достигнутого уровня в этом вопросе свидетельствует о том, что разработка эффективных способов иммобилизации глюкоамилазы остается еще нерешенной проблемой современной биотехнологии. Указанные обстоятельства обуславливают актуальность темы настоящей работы, которая посвящена изысканию возможностей повышения эффективности процесса иммобилизации глюкоамилазы.
Цель настоящей работы состояла в следующем:
I. Сопоставление ряда способов иммобилизации глюкоамилаз различного происхождения и определение наиболее эффективного метода иммобилизации.
2» Детальное изучение наиболее эффективного метода иммобилизации, которым, согласно предварительным исследованиям, оказалось ковалентное связывание, с целью получения нерастворимых форм фермента.
3. Исследование гидролиза крахмала в периодических и непрерывных условиях при использовании иммобилизованной глюкоамилазы для получения осахаренных гидролизатов.
Научная новизна и практическая ценность полученных данных заключается в том, что впервые было проведено сравнительное изучение каталитической активности и стабильности глюкоамилаз, иммобилизованных различными способами /адсорбция, ковалентное связывание/. Показано, что наибольшая стабильность иммобилизованных глюкоамилаз достигается при использовании метода ковалентного связывания. Эффективность процесса связывания и свойства иммобилизованной глюкоамилазы зависят от природы нерастворимого носителя и степени очистки препаратов глюкоамилазы. Особо
ванным является подбор сшивающего агента, обеспечивающего связь между ферментом и носителем. Доказано, что активность и стабильность иммобилизованных глюкоамилаз, полученных с различными сшивающими агентами, растет в ряду: 2,4-толуилендиизоцианат-цианурхлорид-глутаровый диальдегид-госсипол. При использовании госсипола значительно повышается также температурный оптимум действия глюкоамилазы. Следовательно, госсипол, будучи сшивающим агентом, широко доступным при промышленном использовании, обеспечивает наибольшую стабильность и активность иммобилизованных глюкоамилаз. Проведено сравнительное исследование каталитических свойств, стабильности и кинетических характеристик растворимых и иммобилизованных форм глюкоамилаз.
Исследован гидролиз концентрированных растворов крахмала в периодическом и непрерывном режимах иммобилизованной глюкоами-лазой и выявлена высокая эффективность и экономическая целесообразность указанных процессов. Показана возможность использования иммобилизованной глюкоамилазы для получения осахаренных гид,-ролизатов из суспензии крахмала - отхода хлебопекарного производства и разработаны пути применения этих гидролизатов в производстве хлебобулочных изделий.
Основные положения диссертационной работы доложены на III и ІУ Всесоюзных научных симпозиумах "Получение и применение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине" /Ленинград, 1980, Киев, 1983/, IX конференции молодых ученых "Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ" /Рига, 1981/, ІУ Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов /Рига, 1980/, Всесо-
юзной конференции "Биоконверсия растительного сырья" /Рига, 1982/, на конференциях КТИПП /1977-1982 гг./.
По результатам исследований опубликовано 13 работ.
Стабилизация и иммобилизация глюкоамилазы
Глюкоамилаза занимает особое место среди амилолитических ферментов, находящих самое широкое применение в различных отраслях промышленности. В хлебопекарной промышленности глюкоамилаза применяется для улучшения качества хлебобулочных изделий: наряду с увеличением объема, сжимаемости и пористости мякиша, улучшением вкуса, ферментный препарат способствует сокращению продолжительности брожения теста.
Особенно эффективно используется глюкоамилаза в крахмало-паточной промышленности для осахаривания высококонцентрированных крахмальных растворов для получения кристаллической глюкозы, глюкозных сиропов и паток. Ферментный метод получения сахаристых веществ из крахмала во многих странах вытесняет кислотный способ, поскольку глюкоамилаза дает возможность осахари-вать крахмальные суспензии более высоких концентраций, чем при кислотном способе, без образования продуктов реверсии и разложения глюкозы, позволяет увеличить выход и качество глюкозы. Полученные глюкозные сиропы и патоки с различной степенью осахаривания могут использоваться в пищевой промышленности в виде добавки к пищевым продуктам для придания им сладости, улучшения качества изделий, что позволяет сократить расходы сахара.
Кроме того, глюкоамилаза используется в медицине при лечении ряда наследственных заболеваний, вызванных непереносимостью крахмала и мальтозы.
В связи с широким применением глюкоамилазы в различных областях производства потребность народного хозяйства в этом ферменте увеличивается с каждым годом. Впервые глюкоамилаза была обнаружена Корман и Зенглукке [іІ2] в плесневых грибах при получении этилового спирта. Выделена глюкоамилаза В 1951 ГОДУ ИЗ гриба Rhizopus delemar /l94j и из гриба Asp. niger [l48J
Глюкоамилаза /3.2.1.3., экзо-1-4-с-глюкозидаза/ - фермент экзогенного типа, обладает широкой специфичностью к глюкозид-ным связям, гидролизуя о6-1,4- и 0 -1,6-глюкозидные связи крахмала, гликогена и других олигосахаридов с нередуцирующего конца молекулы с образованием глюкозы воі-и й-мутамерной форме [l63,2I3j. Пазур и Окада [l9l] указывают на способность глюко-амилазы гидролизовать также -1,3-глюкозидные связи.
Установлено, что глюкоамилаза гидролизует субстраты по типу многоцепного механизма, согласно которому фермент каждый раз атакует новую молекулу углевода. Фермент обладает большим сродством к высокомолекулярному субстрату, и с увеличением степени полимеризации субстрата скорость расщепления его возрастает. Значительное влияние на скорость гидролиза субстратов ферментом глюкоамилазой оказывает длина цепи и присутствие в гликози-де остатков, отличных от глюкозы [9,24,188] .
Источником фермента чаще всего служат различные микроорганизмы из родов Rhizopus , Endomyces , Endomycopsis И Aspergillus, Известно множество работ по изучению биосинтеза глюкоами-лазы различными грибами из рода Aspergillus . Так, глюкоамилаза была выделена из культур Asp.niger [lI7,I48,I65j ; Asp. phoencicis [I58J;Asp. oryzae [l82; Asp. awamori [75J Чрезвычайно перспективными продуцентами глюкоамилазы считают микроорганизмы РОДОВ Rhyzopus , Endomyces и Endomycopsis. Наряду с высокоактивной глюкоамилазой они образуют минимальное количество сопутствующих ферментов [63,194). Глубинный метод культивирования был применен для получения амилолитических ферментов из культур дрожжеподобных микроорганизмов Endomycopsis species [20,118,180,20l] Амилазы этих штаммов гидролизуют крахмал полностью до глюкозы [44,18б]. Менее распространены в качестве продуцентов глюкоамилаз микроорганизмы, как Mucor rouxianu [203], Trichoderma viride 185], Baccilomyces subglobusum [202] Широко изучаются штаммы Asp.batatae 74J , Endomycopsis bispora [47], Endomycopsis species 20-9 feo] , ферменты которых могут быть использованы в промышленности для осахаривания крахмалсодержащего сырья. Свойства глюкоамилазы резко отличаются в зависимости от источника ее получения. Есть кислотоустойчивые и непереносящие рН ниже 3,5-3,0 глюкоамилазы, щелочных глюкоамилаз нет. Кислые глюкоамилазы свойственны микроскопическим грибкам, дрожжи продуцируют, как правило, слабокислые глюкоамилазы /рН оптимум 4,7-5,6/, нейтральные глюкоамилазы свойственны бактериям, некоторым грибам, животным тканям [зв] Однако, в животных тканях обнаружены и кислые глюкозообразующие амилазы [8,64j, a Asp. awamori продуцирует глюкоамилазу с оптимумом рН 6,0-6,5 Гбб] А-нализ литературных данных о некоторых свойствах глюкоамилаз различного происхождения показал, что характерным для многих глюкоамилаз является наличие оптимума действия в кислой зоне рН в интервале температур 45-60. Большинство ферментов обладает рН стабильностью и достаточно термолабильны. Значения кинетической константы Михаэлиса различны в зависимости от источника фермента и, как правило, возрастают с уменьшением длины полимерного субстрата [9,170,17Г,205]. Молекулярная масса глю-коамилаз колеблется в пределах от 48000 до 210000, причем грибные глюкоамилазы имеют молекулярную массу более высокую, чем дрожжевые [2Ї] Большинство глюкоамилаз микробного и животного происхождения относятся к гликопротеидам и содержат до 13% углеводов в составе молекулы. Состав углеводной части ферментов зависит от продуцента. В составе молекул глюкоамилаз обнаружены глюкоза, манноза, фруктоза, галактоза, дезоксирибоза, олигосахара и амины углеводов.
Методы исследований
С помощью 2-амино-4,6 дихлор-з-триазина глюкоамилаза из Asp. awamori была связана с ДЭАЭ-целлюлозой [l62,228j. При 55 иммобилизованная глюкоамилаза в течение 100 часов не теряла своей активности в процессе гидролиза глюкозного сиропа с содержанием сухих веществ 53,7%. Однако из-за недостаточной прочности носителя /сжимаемости/ избыточное давление в колонке возросло с 0,04 мРа в начале до 0,12 мРа - в. конце эксперимента.
На ДЭАЭ-целлюлозе при использовании 2-амино-4,6-дихлор-5--триазина была связана глюкоамилаза из Asp. niger Полученные препарат содержал 120 мг белка на I г носителя, активность иммобилизованной глюкоамилазы составила 20-30% от активности растворимого фермента [l87]. рН-профиль связанного фермента значительно уже, чем у нативной глюкоамилазы?и сдвинут в кислую зону с рН 5,0 для растворимой глюкоамилазы до 4,3 для иммобилизованного фермента.
На окиси алюминия, активированной соляной кислотой, с помощью бифункционального реагента 2-амино-4,6-дихлор-5-триазина разработан способ иммобилизации глюкоамилазы [141] При этом способе сохранялось 80-100% исходной активности глюкоамилазы, однако абсолютная активность фермента не указана. Флеминг и др. [l23 обработали аминоалкилпроизводное пористого стекла тиофосгеном в хлороформе, после чего к изотиоци-анатному производному носителя была присоединена глюкоамилаза. При этом фермент сохранил 68% от исходной активности. Высокоактивные и стабильные препараты глюкоамилазы из Asp. niger получены при связывании фермента с пористыми шарика ми ДЭАЭ-целлюлозы, обработанной толуол-2,4-диизоцианатом l04j. Активность фермента при иммобилизации составляла 10-20% от исходной активности фермента, при этом на I г носителя было фиксировано 220 мг белка с активностью 2000 ед. При работе в колонке иммобилизованный фермент имел время полужизни при 60 70 часов, при 55 - 130 часов, а при 45 - 117 дней. Однако из-за сжимаемости целлюлозы наблюдалось сильное увеличение сопротивления в колонке. Иммобилизована глюкоамилаза из Asp. niger на полисти-рольных шариках, полученных эмульсионной полимеризацией стирол-дивинилбензола и затем превращенных в различные функциональные производные Гэз]. Для этого полистирол был пронитрирован и восстановлен, а полученное аминоарильное производное полистирола обработано глутаровым диальдегидом, янтарным ангидридом или 2-метокси-4,6-дихлор-триазином. Функциональные производные были получены также непосредственно обработкой полистирола ди-хлорметоксиметаном и янтарным ангидридом с последующей обработкой п -нитрофенолом. Наибольшую активность имела глюкоамилаза, иммобилизованная на аминополистироле, обработанном глутаровым альдегидом-1445 ед/г носителя, а наименьшая активность получена при обработке полистирола янтарным ангидридом и п-нитрофено-лом - 50 ед/г носителя, Кристенсон U08J иммобилизовал глюкоамилазу из Asp. niger, углеводная часть молекулы которой была предварительно окислена периидатом натрия. При такой обработке нативная окисленная глю-коамилаза сохранила 89% исходной активности. В качестве носителя использовалось гидрозидное производное КМ -целлюлозы. Полученный фермент был способен гидролизовать 1%-ный раствор крахмала лишь на 45%. Таким образом, характеризуя метод ковалентного связывания глюкоамилазы в целом, можно заключить, что ковалентное связывание, несмотря на сложность проведения процесса, является доминирующим способом получения иммобилизованных препаратов глюкоамилазы, потому что подбирая соотношение носителя и фермента, метод образования новалентных связей.можно значительно уменьшить неблагоприятное влияние матрицы на глюкоамилазу. Указанный метод характеризуется сохранением высокого уровня активности глюкоамилазы, об этом свидетельствует подавляющее большинство результатов - активность иммобилизованных препаратов глюкоамилазы составляет 45-80% от активности нативных препаратов. Значительная часть иммобилизованных таким способом препаратов глюкоамилазы обладает высокой стабильностью и пригодна для длительного использования в процессе гидролиза растворов крахмала, позволяя получать гидролизат с содержанием 40-66% редуцирующих веществ. Выбрать на основании литературных данных оптимальный способ ковалентного связывания глюкоамилазы, однако, затруднительно из-за различия в свойствах нативной глюкоамилазы, из-за раз 49 личия химических свойств и структуры носителя, из-за несоответствия единиц активности, характеризующей препарат глюкоамилазы, из-за неполноты приведенных свойств иммобилизованных препаратов. Подводя итоги вышеизложенному, следует констатировать, что проблема выбора оптимального метода иммобилизации глюкоамилазы, эффективного носителя и сшивающего агента не может считаться решенной. Все это обусловило актуальность настоящей работы, посвященной изысканию эффективного метода иммолизации глюкоамилазы, исследованию свойств иммобилизованного фермента и обоснованию его применения в промышленных условиях.
Исследование каталитической активности и стабильности препаратов глюкоамилазы в зависимости от способа иммобилизации и вида носителя
Анализ литературных данных по иммобилизации и стабилизации препаратов глюкоамилаз различного происхождения свидетельствует о том, что до сих пор не удалось выявить сравнительную эффективность различных способов иммобилизации, так как результаты различных исследователей получены в несравнимых условиях В связи с этим целью первого этапа настоящей работы явилась экспериментальная оценка каталитической активности и стабильности наиболее перспективных отечественных препаратов глюкоамилазы при различных видах их химической модификации и иммобилизации. При этом использованы различные носители и различные функциональные группы для связывания глюкоамилазы.
Из кривых, представленных на рис. 1,и цифрового материала табл. I следует, что при иммобилизации глюкоамилазы /ГА-4/ стабильность фермента существенно зависит от способа связывания. Так, нативный фермент имеет время полуинактивации / Т/А /» т.е. время, за которое активность фермента уменьшается вдвое, при 70, равное 20 мин. /кривая I/. Адсорбция его на ДЭАЭ-целлюло-зе практически не сказывается на стабильности препарата /кривая 2/. В то же время адсорбция глюкоамилазы на гидрофобном сорбенте- поликефамиде позволяет несколько стабилизировать фермент, Z при 70 растет до І20 мин., т.е. в 6 раз /кривая 3/ Для стабилизации глюкоамилазы более эффективны методы ковалентной иммобилизации. Например, ьювалентное связывание фермент с частично гидролизованным полиамидом при использовании бифункционального агента - глутарового диальдегида позволяет довести tyt до 6 час, /кривая 4/, т.е. время полуинактивации растет почти в 18 раз. Еще большая стабилизация фермента достигнута при ковалентной иммобилизации на аминобазальтовых волокнах. В этом случае время полуинактивации увеличивается в 48 раз /кривая 6/. В последних двух случаях достигнутая стабильность значительно зависит и от вида сшивающего агента. Если заменить глутаровый диальдегид госсиполом, то время полуинактивации при ковалентном связывании с полиамидом увеличивается в 21 раз /кривая 5/, а при ковалентном связывании с ами-нобазальтовым волокном - в 54 раза /кривая 7/. Увеличение стабильности иммобилизованной глюкоамилазы в зависимости от вида сшивающего агента наблюдается такне при ковалентном связывании фермента на аминосилохроме С-80. При использовании глутарового диальдегида Ту глюкоамилазы при 70 составляет 5,4 часа, т.е. увеличивается в 16,2 раза, а применение госсипола позволяет увеличить время полужизни фермента до 6,9 часов, что в 27 раза превышает растворимого энзима /табл.1/. Этот вопрос будет подробней обсуждаться ниже.
Менее стабильны препараты глюкоамилазы, модифицированной водорастворимыми полимерами. С сополимером ВП-АГЭ, имеющим функционально активные эпоксигруппы, Ту повышается всего в 15 раз /кривая 8/, однако в этом случае выше результирующая активность /табл.2/.
Вместе с тем эффективность иммобилизации определяется не только достигнутым уровнем стабилизации. Весьма важно добиться сочетания повышенной стабильности фермента и максимального сохранения каталитической активности. Очевидно, более эффективным будет тот способ иммобилизации, при котором достигается указанное сочетание.
Как следует из результатов, представленных в табл.2, адсорбционная иммобилизация не только не сопровождается увеличением стабильности фермента, но и приводит к снижению его активности. При иммобилизации ГА-4, например, активность падает в 12,3 раза при использовании ДЭАЭ-целлюлозы, в 18,2 раза - при использовании КМ-целлюлозы, и в б раз - при использовании си-ликагеля АСК. При адсорбции глюкоамилазы на поликефамиде активность уменьшается незначительно /в 1,1 раза/, а стабильность, как уже отмечалось выше, растет почти в 6 раз. Следовательно, при трех первых способах адсорбционной иммобилизации невозможно добиться существенного эффекта, а методом адсорбции на поликефамиде можно пользоваться, так как этот метод прост, легко осуществим /простой контакт фермента с носителем/ и позволяет перевести фермент в нерастворимое состояние. Вместе с тем метод адсорбции на поликефамиде имеет тот недостаток, что глюкоамилаза в процессе работы десорбируется с носителя.
При ковалентном связывании глюкоамилазы с нерастворимыми носителями происходит снижение каталитической активности используемых ферментов во всех случаях, независимо от того, какой носитель применяется и какова природа сшивающего агента. В наибольшей степени активность сохраняется в случае аминосилохрома С-80 /для глшкоамилаз ГА-І, ГА-2, ГА-3/. Исследуемые носители могут быть расположены в следующем порядке по убывающим уровням активности иммобилизованного фермента: аминосилохром С-80, АЭ-целлюлоза, аминосиликагель АСК, аминосиликагель КСК, аминоокись алюминия, полиамид, ашшобазальтовое волокно.
Гидролиз иммобилизованными глюкоамилазами концентрированных растворов крахмала в периодических условиях
Иммобилизация ферментов приближает их по свойствам к химическим катализаторам и открывает широкие перспективы их промышленного использования. В этой связи результаты исследования по иммобилизации глюкоамилазы, изложенные в настоящей работе, представляют практическую ценность для интенсификации и улучшения ряда технологических процессов, связанных с гидролизом крахмала и использованием полученных гидролизатов. Расчет, проведенный в предыдущем разделе, свидетельствует о том, что производство ферментативных гидролизатов крахмала вполне осуществимо.
В последние годы на ряде хлебопекарных производств вырабатывают белковый хлеб /в диетических целях/. При его производстве отмывается клейковина, в результате чего накапливается значительное количество крахмальной суспензии, реализация которой представляет определенные трудности, поскольку добавление ее в тесто ухудшает качество изделий. Поэтому зачастую такая крахмальная суспензия практически не реализуется и является отходом производства. Вопрос гидролиза такой крахмальной суспензии при помощи фермента глюкоамилазы в целях дальнейшего ее использования в хлебопечении является важным и актуальным.
Однако, применение растворимых глюкоамилаз не всегда желательно в связи с загрязнением пищевых продуктов примесями белка фермента, что ухудшает качество хлебобулочных изделий. Представляет значительный интерес возможность использования с этой целью иммобилизованной глюкоамилазы.
Нами были проведены лабораторные эксперименты по получению осахаренных гидролизатов крахмалсодержащего отхода хлебопекарного производства с помощью глюкоаваморина Гх /ГА-І/, иммобилизованного на ами но сило хроме С-80 при помощи госсипола. Иммобилизованная ковалентним методом глюкоамилаза прочно связана с носителем химической связью, что исключает попадание ее в готовую продукцию. Кроме того, носитель очень легко отделяется от крахмальной суспензии, также не загрязняя продукции. На основании результатов этих экспериментов была показана возможность реализации такой разработки в промышленных условиях, что открывает возможности дальнейшего использования полученных гидролизатов.
С целью проверки возможности такой реализации было нерабо-тано 0,5 кг иммобилизованной на аминосилохроме С-80 глюкоамилазы - глюкоаваморина Гх , выпускаемого Артемовским спиртзаводом, с применением сшивающего агента госсипола /расход госсипола составил 10 г/. С помощью иммобилизованной таким образом глюкоамилазы на Ялтинском хлебокомбинате была получена опытная партия высокоосахаренного гидролизата из крахмальной суспензии. Указанный гидролизат был затем применен при производстве хлебобулочных изделий /приложение 4/.
Таким образом, результаты проведенных нами исследований по стабилизации и иммобилизации глюкоамилазы могут быть широко использованы на практике. При этом достигается, как следует из данных, представленных в приложениях 3 и 4, повышение качества хлеба, улучшение его органолептических свойств, удешевление производимых хлебобулочных изделий вследствие частичной замены сахара высокоосахареиным гидролизатом крахмальной суспензии, которая является отходом производства.
Необходимые для промышленных целей количества иммобилизованной глюкоамилазы могут быть получены уже в ближайшем будущем на основе носителя аминосилохрома С-80, сшивающего агента гос-сипола и промышленно освоенного препарата глюкоамилазы - глюко-аваморина Гх .
Получены иммобилизованные формы глюкоамилаз при помощи адсорбции и ковалентного связывания на производных целлюлозы, поликефамиде, аминированных силикагелях и силохроме С-80, амино-базальтовом волокне, полиамиде, растворимых сополимерах на основе к -виниллактомов. Показано, что перевод фермента в иммобилизованное состояние во всех случаях сопровождается снижением ка-талитичвокой активности. Не получено увеличения стабильности глю-коамилазы при адсорбционной иммобилизации /за исключением поли-кефамида/. При ковалентной иммобилизации глюкоамилаз на нерастворимых носителях каталитическая активность и стабильность полученного иммобилизованного фермента зависили от вида носителя, вида и степени очистки глюкоамилазы, природы сшивающзго агента. Наиболее эффективным был процесс ковалентной иммобилизации при использовании полиамида и аминосилохрома С-80.
Каталитическая активность иммобилизованной глюкоамилазы и ее стабильность к нагреванию, агрессивным средам и хранению определялись природой сшивающего агента, образующего связь между носителем и глюкоамилазой. Показано, что госсипол - природный диальдегид из хлопчатника - имеет преимущества перед другими бифункциональными сшивающими агентами /2,4-толуилендиизоциа-натом, цианурхлоридом, глутаровым диальдегидом/. Связь, образованная посредством госсипола, стабильна в более широком диапазоне рН среды, температуры и других воздействий, а полученные иммобилизованные глюкоамилазы более активны, обладают повышенной стабильностью и большим диапазоном температурного оптимума.
Проведено сравнительное изучение свойств растворимых и иммобилизованных ковалентным связыванием с использованием госсипола глюкоамилаз различных продуцентов. Показано, что после иммобилизации температурный оптимум фермента повышается, значение рН оптимумов практически не изменяются, время полуинактивации ферментов при 70 увеличивается в 10-40 раз и достигает 20 часов. Кажущиеся константы Михаэлиса иммобилизованных глюкоамилаз, определенные по мальтозе и крахмалу, выше, чем у растворимых ферментов. При этом снижение средства фермент-субстрат значительное в случае макромолекулярного субстрата - крахмала.
Исследован процесс гидролиза крахмала в периодическом и непрерывном режимах иммобилизованной глюкоамилазой. Выявлены высокая эффективность и экономическая целесообразность использования иммобилизованной глюкоамилазы для получения высокооса-харенных гидролизатов крахмала при обоих режимах. Полученные с помощью иммобилизованной глюкоамилазы ферментативные гидролиза-ты успешно использованы в хлебопечении.
