Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1. Химические факторы коммуникации 6
1.1.1. Межклеточные взаимодействия опосредованные химическими факторами 7
1.1.2. Споруляция и компетентность (в. subtilis) 9
1.1.3. А-фактор в регуляции стрептомицетов.
1.1.4. Деление клеток. 12
1.1.5. Белки семейства rpf- стимуляторы роста бактерий 13
1.2. Межклеточные взаимодействия опосредованные физическими факторами (межклеточные контакты) 15
1.2.1.Биоплёнки 17
1.2.2. Бактериальные колонии. 21
1.3. Апоптоз в микробных сообществах 29
1.4. Клеточная стенка и её роль в коммуникации бактерий 32
1.5. Агрегация бактерий в жидких средах 40
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Выращивание бактериальных культур 46
2.2. Общее число клеток (очк) 46
2.3. Микроскопические исследования 46
2.4. Распределение клеток 47
2.5. Разрушение бактериальных агрегатов исследуемых культур 47
2.6. Получение супернатантов для стимуляции роста бактерий 48
2.7. Электрофорез белков в пааг по лэммли 48
2.8. Иммуноблоттингрекомбинантных белков 49
2.9. Иммуноферментный анализ 50
2.10. Получение белка rpf и его модифицированных форм 51
2.11.Секвенирование белков 52
2.12. Масспектрометрия 52
2.13. Приготовление грубого препарата клеточных стенок м. luteus 52
2.14. Измерение литической активности белка rpf в отношении грубого препарата клеточных стенок м. luteus 52
2.15. Определение мурамидазной активности белков rpf и его модификаций 53
2.16. Гель-фильтрация сн со стимулирующей активностью 53
2.17. Тестирование фракций супернатанта м. luteus на активность стимулирующую рост клеток 54
2.18. Ультрафильтрация сн со стимулирующей активностью 54
Глава 3. Результаты 57
3.1. Ингибирующее влияние интенсивного перемешивания на рост культур rhodococcus rhodochrous и micrococcus luteus в жидких обеднённых средах 57
3.2. Клеточная агрегация на ранних стадиях развития бактериальных культур r. rhodochrous и м. luteus и её механизмы 65
3.3 Роль белка rpf в дезагрегации клеточных ассоциатов м. luteus 82
Глава 4. Обсуждение 99
Выводы 108
Список литературы 109
- Межклеточные взаимодействия опосредованные физическими факторами (межклеточные контакты)
- Клеточная стенка и её роль в коммуникации бактерий
- Ультрафильтрация сн со стимулирующей активностью
- Ингибирующее влияние интенсивного перемешивания на рост культур rhodococcus rhodochrous и micrococcus luteus в жидких обеднённых средах
Введение к работе
Впервые важность межклеточных взаимодействий в биологии была продемонстрирована в середине прошлого века при изучении развития многоклеточных организмов (Евгеньева, 1975; Hausman and Moscona, 1975; Balsamo and Lilien, 1975). С тех пор роль клеточной коммуникации у высших эукариотических организмов хорошо исследована. Найдены специфические химические сигналы взаимодействия, исследованы различные типы контактов между клетками (Frazier et al., 1972; Lim and Mitsunobu, 1974; Savage et al., 1972). Что касается низших организмов, то долгое время исследования в этой области почти не проводились, так как считалось, что такие простейшие организмы как одноклеточные существуют в популяции независимо друг от друга. Особенно это относилось к прокариотическим организмам, которых считали неспособными для специфических межклеточных взаимодействий. Однако со временем стали появляться многочисленные данные о том, что одноклеточные эукариоты также имеют специфический язык межклеточного общения (Tanabe et al., 1990; Christensen et al., 1998), а некоторые из них, например, вольвокс образуют сложные колонии, состоящие из большого количества клеточных субпопуляций, которые могут выполнять различные функции.
Одним из первых исследователей, изучавший межклеточную коммуникацию у прокариотических организмов, был академик И.Д. Иерусалимский. В работах Иерусалимского микробная колония рассматривается как надорганизменная система, для которой характерна фенотипическая гетерогенность и пространственная обособленность в естественной среде обитания (Иерусалимский, 1952). К нашему времени скопилось достаточно много фактов, свидетельствующих о сложных межклеточных взаимодействиях в прокариотических популяциях. Эти факты подчас опровергают основные постулаты Роберта Коха, в том числе о том, что любая прокариотическая клетка может дать популяцию при росте в оптимальных условиях, т. е. бактериальные культуры рассматривались как совокупность клеток, которые могут развиваться и делиться совершенно независимо друг от друга. На сегодняшний день описан целый ряд сигнальных молекул у бактерий и показаны процессы, в которых эти молекулы принимают
участие. Было показано, что некоторые процессы в бактериальных популяциях зависят от концентрации клеток и при достижении определённой клеточной плотности скорость этих процессов значительно увеличивается. Это явление, названное «quorum sensing», регулирует многие важные процессы у бактерий, в том числе и у патогенных возбудителей опасных заболеваний. Однако, уделяя так много внимания химическим факторам коммуникации, исследователи очень мало внимания обращают на физические взаимодействия в бактериальных популяциях. Известно, что некоторые виды бактерий (стрептомицеты, цианобактерии) способны образовывать сложные многоклеточные структуры при росте в естественной среде обитания и в лабораторных условиях. Другие виды, например микобактерии и нокардии, также часто образуют различные клеточные скопления. Показано, что многие виды бактерий, ранее считавшиеся исключительно свободноживущими, при определённых условиях образуют биоплёнки - специфические многоклеточные структуры. Биоплёнки на сегодняшний день являются наиболее исследованными бактериальными ассоциатами, так как имеют большое значение в медицине и в экологии.
Однако, несмотря на такой прогресс в исследовании биоплёнок и бактериальных колоний, исследователи практически не изучали другое, более часто встречающееся явление в микробиологии, - частичную, а иногда довольно значительную агрегацию клеток при росте бактериальных культур в жидких средах. Как правило, такая агрегация более характерна в стрессовых условиях роста. Но до сих пор нет ответа на вопрос, в чём биологический смысл такой агрегации и является ли она необходимой для развития клеточных популяций или это просто следствие взаимодействия клеток не как живых организмов, а как взвешенных коллоидных частиц? Ответы на этот и многие другие вопросы, связанные с бактериальной агрегацией остаются на сегодняшний день мало изученными. Цель настоящей работы состоит в том, чтобы выяснить какое значение для развития популяции на жидких средах имеет агрегация клеток на примере двух представителей ГЦ-богатых бактерий, для которых рост с образованием агрегатов является обычным явлением. И если имеет, то, при каких условиях, и какие механизмы могут быть ответственны за это явление.
Межклеточные взаимодействия опосредованные физическими факторами (межклеточные контакты)
Бактериальные клетки постоянно контактируют между собой при росте в жидких средах посредством физических контактов, а при росте на твёрдых средах клетки находятся в тесном соприкосновении друг с другом. Для некоторых видов клеточная агрегация имеет большое значение при морфогенезе и дифференцировке, как это описано у миксобактерий. Например, Myxococcus xanthus, при ухудшении условий окружающей среды образует многоклеточное плодовое тело, содержащее споры (Sager and Kaiser, 1993; Kaiser and Losick, 1993). Клетки при этом образуют специальные пили, которые помогают им связаться друг с другом. Пили удлиняются, связываясь с компонентами внеклеточного матрикса и постепенно клетки объединяются в плодовое тело (Wu and Kaiser, 1995). Такая форма агрегации называется S-агрегация. Обнаружено, что процесс такой дифференцировки контролируется химическими сигналами, секретируемыми на разных этапах развития культуры. Эти сигналы представляют собой смесь аминокислот («А»-фактор), гидрофобный белок массой 17 кДа («С»-фактор) и пока не расшифрованный Е-фактор. А-фактор синтезируется при значительной плотности бактерий в культуре в ответ на голодание, Е и С-факторы синтезируются на более поздних стадиях развития плодового тела и образования спор. Фактор С, будучи мембраносвязанным белком, осуществляет взаимодействие клеток на близком расстоянии, когда клетки уже собраны в агрегированном состоянии в плодовое тело, за счет связывания с определенным белком на поверхности клеток. Гены-участники в этих сложных процессах и последовательность событий, приводящих к дифференцировке, достаточно хорошо изучены (Kaiser, 1999). Недавно исследователи обнаружили, что некоторые мутантные формы Myxococcus xanthus не способны образовывать пили и агрегируют посредством гиперпродукции специфического фибриллярного матрикса, который скрепляет клетки (Velicer and Yu, 2003). Такой способ агрегации авторы назвали «А-агрегация». А-агрегация играет большую роль при росте культуры на жёстких поверхностях, а S-агрегация играет большую роль при росте на мягких поверхностях, например на полужидком агаре (Velicer and Yu, 2003). В природе также часто встречаются бактериальные агрегаты, состоящие из нескольких видов бактерий, например консорциумы метаногенов и метанотрофов (Олескин и Самуилов, 1994; Boetius et al., 2000). Выгодность таких коопераций для бактерий заключается в том, одни бактерии выделяют вещества, которые тут же попадают к другим бактериям, которые эти вещества используют как субстраты. Иногда такие консорциумы приобретают сложную организацию, в которую входит несколько десятков видов микроорганизмов, расположенных несколькими слоями. Часто в таких сообществах, называемых «бактериальные маты», присутствуют также продуценты органического вещества - цианобактерии или водоросли. Есть также сведения о том, что для бактерий, живущих в активных илах, изменения внешних условий могут индуцировать или стимулировать агрегацию клеток (Bossier and Verstraete, 1996). Консорциумы микроорганизмов играют важную роль в таких биотехнологических процессах, как очистка сточных вод. В последнее время замечена корреляция между вирулентностью и адгезивностью у условно-патогенных микроорганизмов (Li and Poole, 1999). В тоже время мутации, препятствующие адгезии клеток, сильно уменьшают вирулентность таких бактерий (Li and Poole, 1999). Исследование межклеточной агрегации имеет отношение и к такой фундаментальной проблеме биологии как возникновение многоклеточности. Спирс с соавторами провели эксперименты, моделирующие переход бактерии Pseudomonas fluorescens от единичных клеток к агрегированной форме роста (Spiers et al., 2003). В этих экспериментах клетки росли в специальных пространственно гетерогенных условиях. Оказалось, что некоторые клетки продуцируют специальный адгезивный полимер, который, воздействуя на единичные клетки, способствует объединению их в большие группы и формированию биоплёнок (Spiers et al., 2003). В этом процессе важным является достаточное количество кислорода.
В последнее десятилетие появилась информация, что бактерии могут влиять друг на друга на расстоянии посредством неких "волн" (Matsuhashi et al., 1995). Например, когда две культуры разделены пластиковым барьером, одна культура влияет на рост другой (Matsuhashi et al., 1996; 1998). Однако пока такие сообщения единичны и механизмы такого влияния не ясны. Физические контакты между бактериальными клетками не исчерпываются одной агрегацией. Было высказано предположение, что при очень больших клеточных плотностях физические контакты между клетками могут приводить к снижению скорости роста бактерий (Прокопова и др. 1973). А СВ. Конев даже высказал гипотезу, согласно которой у микроорганизмов, подобно клеткам животного происхождения, межклеточные взаимодействия могут служить важным звеном в специфическом механизме поддержания гомеостаза, действующем на популяционном уровне. Он предположил, что одной из главных причин, вызывающих переход культуры из экспоненциальной в стационарную фазу, является возрастание частоты межклеточных контактов (Конев и др., 1977). Блокирование размножения клеток при достижении критической плотности популяции наблюдалось не только на стационарной стадии развития периодической культуры, но также и в тех случаях, когда критическая концентрация клеток (106 кл/мл) создавалась искусственно. Например, этого можно было добиться, путём ресуспендирования в свежей питательной среде густого промытого осадка клеток, полученных после центрифугирования культуры, находящейся в экспоненциальной фазе роста (Конев и др., 1977). Эти данные исключили роль в этом процессе как токсических веществ, накапливаемых в процессе жизнедеятельности клеток, так и истощение питательных веществ в процессе роста. Отсюда было сделано предположение, что, межклеточные взаимодействия при больших клеточных концентрациях препятствуют делению бактерий.
Вообще бактериальная агрегация является в некотором смысле комплексным явлением, в котором принимают участие многие физические и химические процессы.
К одной из наиболее изученных в настоящее время форм бактериальных ассоциатов относятся биоплёнки - клеточные скопления, прикреплённые к различным поверхностям биотического и абиотического происхождения (O Toole et al., 2000). Сначала бактерии прикрепляются к поверхности, затем они подвергаются серии изменений, в процессе которых происходит адаптация клеток к жизни на поверхности. В процессе этой адаптации происходит усиленное выделение клетками экзополисахаридов, образующих защитный матрикс биоплёнки (O Toole et al., 2000). Вдобавок к этому сформировавшиеся биоплёнки могут образовывать сложные трёхмерные структуры. Свойства клеток, растущих в виде биоплёнки, сильно изменяются по сравнению с их ростом в свободном виде, они становятся более устойчивы к различным неблагоприятным условиям окружающей среды (Leriche et al., 2003). В некоторых экспериментах показывали, что при образовании биоплёнок клетки становятся устойчивы к раствору хлора при его добавлении к растущей культуре. При этом культура образовывала большое количество белка, который секретировался наружу клетки и образовывал защитный слой на поверхности биоплёнки (Leriche et al., 2003).
Клеточная стенка и её роль в коммуникации бактерий
Одним из важных компонентов взаимодействия бактерий друг с другом является клеточная стенка. С одной стороны она отделяет и защищает клетку от окружающей среды, а с другой стороны с её помощью клетка взаимодействует с другими клетками, транспортирует нужные ей вещества и присоединяется к различным поверхностям (Seltman and Hoist, 2002).
Главным компонентом клеточной стенки у бактерий является пептидогликан, слой которого у грамположительных бактерий может достигать 80 нм. Это вещество является полимером, состоящим из двух чередующихся мономеров N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты. Они соединены р-(1-4)-гликозидной связью. Из этих двух мономеров состоят длинные цепи, похожие на полисахарид хитин, которые скреплены поперечно друг с другом с помощью пептидных мостиков, состоящих из пяти аминокислотных остатков. У разных бактерий массовая доля пептидогликана может достигать 5 - 90% от массы клетки (Seltman and Hoist, 2002). Цепи пептидогликана в отличие от хитина довольно короткие, благодаря чему он более эластичен. При сшивании полисахаридных цепей пептидными мостиками образуется как бы пептидогликановый мешок, который полностью покрывает клетку. Пептидная часть муреина более вариабельна, чем полисахаридная, которая у всех видов бактерий практически одинаковая. У одного и того же вида бактерий пептидная часть может различаться при разных условиях культивирования. Биосинтез пептидогликана - сложный процесс. Начальные его стадии начинаются в цитоплазме, где образуется UDP-N-ацетилмурамил пентапептид. Затем на границе цитоплазмы и плазматической мембраны происходит формирование дисахарид-пентапептида. Потом этот блок встраивается в пептидогликановую цепь в клеточной стенке. На последнем этапе строительства клеточной стенки важную роль играют реакции транспептидации и трансгликозилирования. Ферменты, принимающие участие в этих реакциях играют важную роль в преобразовании (реорганизации) клеточной стенки, который, возможно, происходит при объединении клеток в ассоциаты и образовании биоплёнок. Большую роль в образовании и разрушении пептидогликановых цепей играют реакции связанные с расщеплением гликозидных связей, которое может происходить по трём типам: 1) гидролиз, 2) трансэлиминирование, 3) трансгликозилирование. Первый тип реакций идёт с присоединением воды и универсален для всех Сахаров, второй тип имеет место в случае кислых полисахаридов, где гликозидная связь соседствует с карбоксильной группой. Третий тип реакции происходит при участии различных гликозидаз, которые участвуют в деградации полисахаридов, имеющих сложное строение и способных отщеплять моно, ди-, три- и многосахаридные остатки. Известен широкий спектр гликозидаз способных расщеплять 1,4-8-гликозидные связи, в которых принимает участие N-ацетилглюкозамин. К таким ферментам относится хитиназа, лизоцим, эндо-N-ацетилмурамидазы, эндо-М-ацетил-О-глюкозаминидазы и т.д. Различия у субстратов, на которые действуют эти ферменты, проявляются в таких структурных деталях, как заместители на углеводных остатках (например, мурамидаза и глюкозаминидаза), пептидных сшивках и липопротеиновых компонентах клеточной стенки. Эти субстраты также могут различаться по вторичной структуре. Реакции трансгликозилирования наиболее известны в синтезе олиго- и полисахаридов. Гидролитические ферменты способны катализировать реакции синтеза, используя в качестве реакций трансгликозилирования те же соединения, что и при гидролизе. К настоящему времени есть уже много примеров тому, что трансгликозилазной активностью обладают другие гидролазы, расщепляющие бета 1-4 связи пептидогликана (Максимов, 1986). Трансгликозилазные реакции бывают внутримолекулярные и межмолекулярные. Внутримолекулярные реакции характерны для полисахаридов, а межмолекулярные для олигосахаридов.
Литические ферменты, участвующие в синтезе и деградации клеточной стенки важны не только в обычных условиях роста бактерий. Большую роль они играют при выходе некоторых видов бактерий из покоящегося состояния. Хорошо изученным объектом является в этом отношении спора Bacillus subtilis. Из литературы хорошо известно, что бациллы образуют специальные образования, представляющие собой сильно обезвоженный клеточный материал, содержащий геном и окружённый сложной стенкой (Шлегель, 1985). Спорообразование - один из сложнейших процессов дифференцировки бактериальной клетки. Оно начинается с особого неравного деления клетки (Шлегель, 1987). В результате впячивания плазматической мембраны часть протопласта отшнуровывается от материнской клетки. Образования клеточной стенки между обоими протопластами не происходит в этом случае, как при обычном делении. Вместо этого протопласт споры как бы окружается (обрастает) плазматической мембраной материнской клетки. В результате вокруг протопласта будущей споры оказываются две плазматические мембраны, и каждая из них участвует в образовании стенки споры. Эта стенка представляет собой очень толстый слой пептидогликана, снаружи от него находится тонкий слой, состоящий из полипептидов - экзоспорий (Шлегель, 1987). На долю стенки приходится примерно половина сухой массы всей споры. Обезвоженность протопласта позволяет споре выдерживать высокие температуры, а толстая стенка препятствует проникновению чужеродных веществ, в том числе и ферментов. Слой пептидогликана, расположенный между спорой и экзоспорием делится на тонкий слой базовой клеточной стенки, который не отличается от такового у вегетативных клеток и кортекса, более толстого слоя, расположенного ближе к поверхности (Atrih et al., 1996; 1998). Тонкий слой базовой клеточной стенки практически не претерпевает никаких изменений в процессе прорастания споры (Popham et al., 1996). Что касается кортекса, то он также состоит из ацетилглюкозамина и ацетилмурамовой кислоты, но имеет ряд отличий по сравнению со стенкой вегетативных клеток: 25% молекул мурамовой кислоты имеют боковые цепи в виде тетрапептидов, а 23% молекул мурамовой кислоты имеют боковые цепи в виде L-аланина. Важным фактом является наличие 8-лактамного строения у половины остатков мурамовой кислоты (углеродный атом кислотного остатка соединяется с шестым углеродным атомом), что имеет большое значение для устойчивости кортекса к различным литическим ферментам. Однако полимер кортекса должен гидролизоваться при прорастании споры, для того чтобы клетка могла начать развиваться и делиться (Johnstone et al., 1982; Foster and Johnstone, 1990). Недавно был обнаружен целый ряд ферментов, участвующих в гидролизе кортекса (Hsieh and Vary, 1975; Foster and Johnstone, 1987; Makino et al., 1994; Moriyama et al., 1996) и получивших название GSLE (от английского germination specific lytic enzymes). Было показано, что 5-лактамные структуры важны не только для защиты от обычных литических ферментов типа лизоцима, но также необходимы для активности GSLE ферментов (Popham et al., 1996; Atrih et al., 1996, 1998). Ферменты, гидролизующие 5-лактамные структуры и неспособные гидролизовать пептидогликан обычных клеточных стенок были найдены у многих микроорганизмов: В. megaterium KM (Foster and Johnstone, 1987), В. cereus IFO 13597 (Makino et al., 1994), Clostridium perfringins S40 (Chen et al., 1997). Прорастающие споры Clostridium perfringins S40 испускают в культуральную жидкость два вида GSLE (Miyata et al., 1995; Chen et al., 1997). Первый из них - SleC, является амидазой с молекулярной массой 31 кДа, которая нековалентно присоединена к внешней стороне кортекса (Miyata et al., 1995). Анализ структуры гена данного белка выявил на его С-конце участок гомологичный нескольким гидролазам, расщепляющим пептидогликан, в частности амидазе CwlL из В. subtilis (Miyata et al., 1995). Второй белок - SleM представляет собой мурамидазу с молекулярной массой 38 кДа, так же локализованную на внешней поверхности кортекса (Chen et al., 1997). В Bacillus subtilis были обнаружены три GSLE белка, один из которых являлся амидазой. Мутанты по генам, кодирующим эти белки, были неспособны к прорастанию спор (Ishikawa et al., 1998). Подобные исследования свидетельствуют о том, что для выхода из состояния споры специализированные GSLE белки совершенно необходимы и что подобный механизм характерен для различных групп микроорганизмов (Atrih and Foster, 1999).
Ультрафильтрация сн со стимулирующей активностью
Исследование фракций со стимулирующей активностью, полученных с помощью гель-фильтрации, и количественную оценку компонентов проводили с использованием хромато-масс-спектрометра («SHIMADZU», Япония). Исследованию состава этого препарата предшествовала пробоподготовка, основанная на выделении компонентов препарата жидкостной экстракцией в ультразвуковом поле (УЗЭ) и термодесорбцией (ТЭ). В качестве экстрагента использовали дихлорметан. При определении среднелетучих примесей в хромато-масс-спектрометр вводили 1 мл полученного экстракта, упаренного до 200 мл. В случае термодесорбции в испаритель хроматографа помещали 5мкг остатков препарата и нагревали при 80С в течение 5 мин при скорости потока гелия, равной 100 мл/мин. Термодесорбированные соединения сорбировали в специальном картридже длиной 6 см и внутренним диаметром 3 мм, заполненном кварцевой ватой, тенаксом (2,5 см) и хромосорбом W с 15% неподвижной фазы SE-30 (2,5 см).
Разделение органических примесей, присутствующих в экстрактах, проводили на капиллярной колонке (30 м 0,25 мм 1,0 мкм). Регистрацию компонентов осуществляли с помощью масс-спектрометра («SHIMADZU», Япония) в режиме регистрации суммарного ионного тока. Основным методом обнаружения веществ, выходящих из колонки является ионизационно-пламенное детектирование. С этой целью выходной конец колонки вставляется в детектор, представляющий собой тонкое сопло с непрерывно горящим пламенем водорода. Поступающие в пламя вещества ионизируются под действием высокой температуры и обнаруживаются по появлению этих ионов. Количество ионов пропорционально количеству вещества в пламени.
Условия хромато-масс-спектрометрического анализа были следующими: температура испарителя хроматографа 270С; температура линии, соединяющей хроматограф с масс-спектрометром, 270С; температура источника ионов 200С; начальная температура колонки 40С (в течение 4 мин); температурная программа 10 град/мин до 270С; конечная температура колонки 270С (в течение 20 мин); диапазон сканирования 50-500 а.е.м.; энергия электронов составляла от 30 до 70 эВ; время сканирования 1,0 с/скан; включение катода проводили через 4 мин после ввода пробы; объем пробы 1 мл в следующих условиях: время изоляции родительских ионов 15 мс; энергия столкновений 1,3 эВ; газ-мишень - гелий; давление в ловушке при столкновениях 60 мторр; режим возбуждения резонансный; скорость сканирования 1 с/скан. Диапазон сканирования последовательно варьировали в ходе анализа в зависимости от массы молекулярного иона.
В результате проведения хроматографического анализа получают хроматограмму, то есть графическое изображение состава препарата в виде пиков. Размеры пика указывают на количество вещества в пробе. Количественные соотношения (обычно в виде процентного отношения) рассчитываются автоматически с помощью специальных калькуляторов или с помощью компьютера.
Проводилась для детекции метаболический активных клеток М. luteus растущих на минимальной среде (LMM) с помощью проточного цитометра («Skatron Ltd», Англия). Для детекции родамина 123 (маркёр мембранного потенциала) (Kaprelyants and Kell, 1992; 1993) был использован флуоресцентный фильтр со следующими характеристиками: длина волны возбуждения 470 - 495 нм, длина волны испускания 520 - 550 нм. Образцы окрашивались с помощью родамина 123 (конечная концентрация 0,3 мкМ) в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 1 часа при комнатной температуре.
В настоящем исследовании были использованы два вида грамположительных бактерий Rhodococcus rhodochrous и Micrococcus luteus, принадлежащих разным семействам, но входящих в одну большую группу ГЦ-богатых бактерий. Для представителей этой группы (например, микобактерий, стрептомицетов, нокардиоподобных ) хорошо известно образование клеточных ассоциатов при росте в жидких питательных средах. Кроме того, все представители этой группы содержали (в разном количестве) гены, кодирующие синтез белков семейства Rpf, роль которых в структурированности агрегатов предполагалось изучить в настоящей работе.
Культура Rhodococcus rhodochrous изменяет в процессе роста свою морфологию: на начальных и конечных фазах роста - это кокки, а в период активного роста - это палочки. Известно также, что данная культура склонна к образованию агрегатов при росте в жидких питательных средах, особенно на начальных стадиях развития культуры. Для выяснения значимости таких агрегатов, были использованы условия, препятствующие их образованию: добавка детергента в среду культивирования и интенсивное перемешивание растущей культуры. Для создания усиленного перемешивания использовали колбы с отбойниками.
В результате исследований были получены неожиданные данные: при культивировании клеток R. rhodochrous в обеднённой жидкой среде интенсивное перемешивание культуры ингибировало рост (Рис. 1). В то время как при росте на богатой среде (Broth Е) перемешивание практически не влияло на рост культуры (Рис. 2). R. rhodochrous относится к аэробным микроорганизмам, поэтому при росте в оптимальных условиях интенсивное перемешивание является необходимым фактором хорошей аэрации растущей культуры и большего выхода биомассы. В случае обедненной среды есть вероятность того, что избыток кислорода, возникающий за счёт интенсивного перемешивания может быть губителен для роста бактерий. Чтобы исключить эту возможность, мы поставили эксперимент, в котором в неподвижно стоящую колбу с обедненной средой принудительно подавали стерильный воздух. В этом случае наблюдался видимый рост культуры (Рис. 1), что исключает ингибирующее влияние повышенной оксигенации на деление клеток R. rhodochrous. Аналогичное явление мы наблюдали также при исследовании роста другой бактерии - Micrococcus luteus. Этот вид склонен к образованию клеточных ассоциатов, правда, в меньшей степени, чем R. rhodochrous. М. luteus не принадлежит семейству Nocardiaceae, однако так же, как и R. rhodochrous, входит в группу ГЦ-богатых бактерий.
Ингибирующее влияние интенсивного перемешивания на рост культур rhodococcus rhodochrous и micrococcus luteus в жидких обеднённых средах
Агрегация у бактерий является хорошо известным фактом, типичным примером которой могут являться сложные ветвящиеся структуры актиномицетов, цианобактерий и плодовые тела миксобактерий (Yarmolinsky, 1995). Кроме того, многие виды бактерий при определённых условиях развития склонны к агрегации при росте на жидких средах с образованием скоплений различной формы. В данной работе мы впервые попытались исследовать значение межклеточной коммуникации у бактерий для их роста и установить механизмы агрегациии-дезагрегации клеточных ассоциатов.
Для доказательства важности клеточной агрегации при росте бактерий в жидких средах мы использовали неоптимальные условия роста, которые часто сопровождаются проявлением межклеточных взаимодействий в бактериальных культурах (Мукамолова и др., 1999). При выращивании R. rhodochrous в качестве неоптимальных были использованы следующие условия: бедная синтетическая среда и интенсивное перемешивание в колбах с отбойниками, с целью предотвращения образования агрегатов. Полученные экспериментальные данные, указывали на то, что эти условия не только препятствуют образованию клеточных агрегатов, которое имеет место особенно на начальных стадиях развития культуры (в лаг фазе), но и приводят к полной остановке роста бактерий. Интересно, что данное явление было характерно только для роста клеток в бедных средах, в то время как на богатой среде интенсивность перемешивания не оказывала влияния на их рост. Такие же результаты мы наблюдали при исследовании роста бактерии М. luteus на минимальной среде (LMM). В этом случае существенный вклад вносила температура культивирования: при снижении температуры культура становилась менее чувствительной к перемешиванию среды. Хотя мы наблюдали остановку роста культур при интенсивном перемешивании, клетки при этом не погибали. При пересеве на твёрдые среды культуры R. rhodochrous и М. luteus давали колонии, а при уменьшении интенсивности перемешивания начинали расти и в жидкой среде.
Таким образом, в случае интенсивного перемешивания клетки не переходили в покоящееся состояние, не становились некультивируемыми, а их метаболическая активность не снижалась, в отличие от ситуации пребывания тех же клеток в длительной стационарной фазе (Kaprelyants et al., 1994; Волошин и др., 2005). В связи с этим возникает вопрос, каким образом клетки поддерживали своё существование, не размножаясь в жидкой среде? Возможно, в данной ситуации в культуре наблюдалось некое равновесие между делением и гибелью клеток без прироста клеточной биомассы, хотя размножение клеток происходило. Данные проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии действительно свидетельствовали о наличии значительной части клеток как нежизнеспособных или поврежденных. Гибель клеток при этом могла быть запрограмированна и реализована через систему токсин-антитоксин, характерную для многих бактерий в стрессовых условиях и являющуюся аналогом апоптоза у высших организмов (Aizenman et al., 1996) Гибель части клеток, в данной ситуации может использоваться популяцией для выживания оставшейся части клеток. Криптический рост был описан Постгейтом в 60-х годах прошлого века, как рост одной части клеток за счёт лизиса другой в фазе стационарного роста, когда питательных субстратов мало, а концентрация клеток большая (Postgate, 1967). Похожее явление наблюдалось в культурах Е. соїі в условиях стазиса, когда часть популяции по исчерпании питательных субстратов лизировалась, и продукты лизиса использовались другой частью клеток (Nistrom 2003). Интересно, что при формировании биопленки Pseudomonas aeruginosa гибель и лизис клеток в пределах микроколоний приводила к разрушению локального фрагмента пленки и выхода жизнеспособных бактерий в окружающую среду (Webb et al., 2003).
В нашем случае, на первый взгляд, ситуация противоположная: предполагаемый криптический рост (поддержание) происходит в лаг-фазе в условиях небольших концентраций клеток. Однако, некоторые питательные субстраты, необходимые для жизнедеятельности бактерий, могут изначально отсутствовать в бедной питательной среде. С другой стороны, за счет агрегации локальная концентрация клеток в ассоциатах в лаг-фазе может достигать нескольких сотен клеток на агрегат (Рис 9, 10). Учитывая, что в агрегатах довольно много повреждённых клеток, логично предположить, что они и являются источниками питательных веществ, локальная концентрация которых в агрегате может быть довольно большой. К тому же прочность агрегата свидетельствует о том, что клетки в его составе соединены довольно плотно, а его покровы (Рис 12) не дают основной массе веществ легко попадать в окружающую среду. Таким образом, в клеточных ассоциатах в лаг-фазе при росте бактерий в бедной питательной среде может происходить нечто похожее на криптический рост у стационарной культуры. Мы называем это «микрокриптический рост», который, возможно, имеет место именно в лаг-фазе в пределах клеточных агрегатов.
Отсутствие чувствительности к перемешиванию в фазе экспоненциального роста свидетельствует о том, что клеточные ассоциаты важны именно для инициации роста в лаг-фазе и при переходе от лаг-фазы к фазе экспоненциального роста. Действительно в период экспоненциального роста происходит разрушение агрегатов (Рис 15), и в этот момент интенсивное перемешивание даже способствует лучшему росту. По-видимому, важным моментом в процессе роста R. rtiodochrous и М. luteus в бедной среде является начало распада агрегатов, во время которого в супернатант выделяются продукты лизиса части клеток, бывших в агрегатах, и тесные межклеточные взаимодействия перестают быть необходимыми для дальнейшего роста. Среда с этого момента обогащается и становится оптимальной для автономного роста единичных клеток. Возможно, это происходит только когда основная масса клеточных агрегатов достигает определённого размера, и концентрация питательных веществ в среде повысится до определённого уровня. Если же интенсивное перемешивание препятствует этому, то «объемный» рост так и не начинается вследствие отсутствия «критической массы» продуктов лизиса. Важно ещё раз подчеркнуть, что на твёрдых средах того же состава, что и жидкие, рост происходит без каких-либо ограничений, что естественно, так как на твёрдых средах бактерии растут в виде колоний, в которых миллиарды клеток тесно взаимодействуют друг с другом. Гетерогенность клеток в колониях, наличие поврежденных и мертвых клеток является хорошо известным фактом (Votyakova et al., 1994; Shapiro and Dworkin, 1997).
