Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Метаболизм водорода у фототрофных бактерий 8
Глава II. Общая характеристика гидрогеназ 13
2.1. Распространение и классификация гидрогеназ 14
2.2. Физиологические функции [NiFel-гидрогеназ 15
2.3. Строение активного центра NiFe-гидрогеназ 17
2.4. Механизм каталитического действия и активадия NiFe-гидрогеназ 20
2.5. Факторы, влияющие на активность и стабильность гидрогеназ 23
2.6. Организация генов, синтез [NiFe]-гидрогеназ и его регуляция 26
2.7. Возможности практического применения гидрогеназ .29
Глава III. Взаимодействие гидрогеназ с металлами 32
3.1. Трансформация ионов металлов микроорганизмами, содержащими гидрогеназу 32
3.2. Окисление металлов микроорганизмами, содержащими гидрогеназу 37
3.3. Йнгибироваиие гидрогеназ ионами металлов 40
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42
Глава IV. Объекты и методы исследования , 42
4.1 Микроорганизмы и условия их культивирования 42
4.2 Получение экстрактов клеток и очистка гидрогеназы 43
4.3. Определение гидрогеназной активности 43
4.4. Восстановление ионов металлов клетками бактерий и препаратами гидрогеназ 44
4.5. Окисление металлов препаратами гидрогеназ 45
4.6. Аналитические методы 46
4.7. Электронно-микроскопические методы 46
4.8. Обработка данных и воспроизводимость измерений , 47
у РЕЗУЛЬТАТЫ 48
Глава V. Общая характеристика гидрогеназы пурпурной серной бактерии Л. modestohalophttm . 48
5.1 Физико-химические свойства гидрогеназы 48
5.2. Стабильность гидрогеназы при хранении 50
5.3. Термостабильность гидрогеназы 52
5.4. Влияние рН на активность фермента ,„ 52
5.5. Влияние СО на активность гидрогеназы 54
Глава VI. Влияние ионов металлов на активность и процесс активации гидрогеназ фототрофных бактерий , 57
6.1. Влияние ионов металлов на активность гидрогеназ . 57
6.2. Влияние ионов Ni2+; Cd2+, Cu2+ и Hg2+ на активацию гидрогеназы 61
6.3. Влияние ионов металлов на спектр поглощения гидрогеназы 63
Глава VII. Окислительно-восстановительное взаимодействие клеток и препаратов гидрогеназ из фототрофных бактерий с металлами 64
7.1. Восстановление ионов металлов клетками микроорганизмов 64
7.2. Восстановление ионов металлов гидрогеназами 71
7.3. Окисление металлов гидрогеназами 75
Обсуждение результатов 80
Выводы 86
Список литературы 88
- Механизм каталитического действия и активадия NiFe-гидрогеназ
- Определение гидрогеназной активности
- Стабильность гидрогеназы при хранении
- Влияние ионов металлов на спектр поглощения гидрогеназы
Введение к работе
Актуальность работы. Гидрогеназа является ключевым ферментом метаболизма водорода и катализирует обратимую активацию молекулярного водорода. Способность к образованию и потреблению водорода проявляют представители разных систа-матических групп микроорганизмов [Кондратьева, Гоготов, 1981]
Интерес к гидрогеназам в значительной степени обусловлен стремлением познать их структуру и механизм действия, а также возможностью практического применения этих многоядерных металлоферментов в водородных топливных элементах и биокаталитических системах получения молекулярного водорода с использованием солнечной энергии. По содержанию металлов в активном центре различают два типа гидрогеназ: NiFe-и Fe- гидрогеназы. В последнее время выделяют еще один тип гидрогеназ - ферменты, не содержащие никель и железосерньРкластеров. Все типы гидрогеназ различаются по каталитическим свойствам и специфичности к разным донорам/акцепторам электронов [Vignais, Colbeau, 2004].
Металлы, с одной стороны, необходимы для биосинтеза и каталитического действия ферментов, включая гидрогеназу. С другой стороны, ионы металлов в повышенных концентрациях оказывают токсическое действие на живые клетки и ингибирующее влияние на ферменты. В связи с этим необходимо исследовать влияние ионов металлов в широком диапазоне концентраций на активность и механизм каталитического действия гидрогеназ.
Кроме того, многие металлы моут быть донорами электронов в катализируемой гидрогеназой реакции образования водорода и окисляться до растворимой ионной формы [Bryant, Laishley, 1990], Данный процесс моделирует анаэробную биокоррозию металлов в присутствии микроорганизмов, содержащих гидрогеназу.
Важной задачей охраны окружающей среды является поиск технологий очистки сточных вод промышленных предприятий от тяжелых металлов. Комплексное использование химических и биологических методов позволит значительно снизить загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами. Многие микроорганизмы способны аккумулировать в биомассе большое количество тяжелых металлов, а также трансформировать высокотоксичные ионы металлов в малорастворимые комплексы или осадок свободного металла. Однако механизм редокс-трансформации металлов остается неясным. Показано, что микроорганизмы, содержащие гидрогеназу, способны восстанавливать ионы ряда металлов до металлического состояния в присутствии водорода [Lloyd, 2003].
В связи с этим необходим поиск новых продуцентов стабильных и активных гидрогеназ, способных к окислению металлов и восстановлению их ионов в атмосфере водорода. Перспективными продуцентами активных и стабильных гидрогеназ являются фототрофные микроорганизмы.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось выяснение возможности и механизма окислительно-восстановительного взаимодействия гидрогеназ с металлами в модельных системах, используя ранее описанную гидрогеназу Thiocapsa roseopersicina, штамм BBS, и вновь выделенную гидрогеназу Lamprobacler modestohalophilus, штамм Syvash, и исследование свойств гидрогеназы ранее не изученной пурпурной серобактерии L. modestohalophilus.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
получить гомогенные препараты и охарактеризовать свойства гидрогеназы пурпурной серной бактерии L. modestohalophilus,
изучить влияние ионов металлов на активность и активацию очищенных гидрогеназ Т. roseopersicina и L. modestohalophilus,
выяснить возможность восстановления ионов металлов клетками фототрофных бактерий Т. roseopersicina и L. modestohalophilus в атмосфере водорода,
4) изучить восстановление ионов металлов в атмосфере водорода и окисление ме
таллов очищенными гидрогеназами 7*. roseopersicina и L. modestohalophilus.
Научная новизна работы. Впервые показано, что ионы никеля, платины и пал
ладия могут выступать в качестве акцепторов, а металлический порошок кадмия или
цинка)доноров электронов для гидрогеназ, выделенных из фототрофных бактерий.
Установлена способность клеток фототрофных бактерий к восстановлению ионов никеля, платины, палладия и рутения в атмосфере водорода. Добавление метилвио-логена в качестве переносчика электронов приводило к ускорению этого процесса.
Т—L ^J- Тт^г *У L Т-Ч- А-Лт ^_i_
Изучено ингибирующее действие ионов Ni , Cd , Mgr , Си ", Hg , Pt , Pd и Ru3+ на активность и процесс активации гидрогеназ Т. roseopersicina и L. modestohalophilus. Впервые выяснены различные механизмы ингибирующего действия ионов металлов на гидрогеназы микроорганизмов. Установлено, что ионы никеля, кадмия и рутения являются обратимыми ингибиторами гидрогеназ по отношению к окисленному метилвиологену и ие влияют на процесс их активации. Ионы меди и ртути необратимо подавляют как активность, так и активацию гидрогеназ.
г Впервые получены гомогенные препараты и изучены свойства гидрогеназы
пурпурной серной бактерии L, modestohalophilus. Показано, что гидрогеназа этой бактерии устойчива к действию СО, высокой температуры и проявляет высокую стабиль-
* ность при хранении.
v Научная и практическая значимость работы. Полученные данные расширя-
ют имеющиеся представления о свойствах фототрофных бактерий и вьщеленных из них гидрогеназ. Показано, что металлический порошок кадмия или цинка в анаэробных условиях может быть донором электронов для этих ферментов, что важно для выяснения природы коррозии металлов. Выделенная гидрогеназа из L. modestohalophilus, проявляющая высокую устойчивость к действию Ог, СО и температуры, может быть исполь-
v зована при разработке новых видов водородных топливных элементов. На основе кле-
ток фототрофных микроорганизмов возможно создание фотобиореакторов, способных в атмосфере водорода восстанавливать ионы металлов из сточных вод промышленных предприятий.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 6-ой Международ-ной конференции «Гидрогеназа 2000» (Германия, Потсдам, 2000), школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), международной конфе-
*" ренции «Биокатализ 2000, основы и практическое использование» (Москва, 2000), 4-ой,
5-ой и 7-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 1999,2001, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации занимает 105 страниц, содержит 32 рисункам 7 таблиц.
Механизм каталитического действия и активадия NiFe-гидрогеназ
В аэробных условиях большинство NiFe-гидрогеназ неактивны и для проявления каталитического действия они должны подвергнуться восстановительной активации (например, с помощью Нг). На рис. 2.3. представлена схема активации и каталитического цикла NiFe-гидрогеназ.
Окисленная, неактивная форма фермента (Niu-A состояние) не готова катализировать активацию водорода (т.е. расщепление Н-Н связи). В восстановительных условиях, лиганд, изображенный как гидроксогруппа (рис 2.3) удаляется с помощью восстановления до воды. При этом атом никеля восстанавливается от Ni3+ до Ni2+, a Niu-A состояние переходит в Niu-S, а затем в Nir-S. Окисленный фермент в отсутствие О2 в Njr-В состоянии способен быстро включится в каталитический цикл. При восстановлении, Ni-B состояние переходит в Ni-S. Ni-S пребывает в трех равновесных состояниях Niu-S (неактивное), Nit-S (подготовленное) и Nia-S (активное) состояние [De Lacey et al., 1997]. Показано, что каждое из активных состояний Nia-S, Nia-C и Nia-R вовлекается в каталитический цикл [Cammack, 2001]. Фермент в активном состоянии (Nia-S) связывает Нг с железом, Каталитический цикл затем продолжается с гетеролитическнм расщеплением молекулярного водорода в металлическом центре. Ni-R окисляется одним электроном, формирующим активное Ni-C состояние, в котором гидрид связан с NiFe центром. Рис. 2.3. Предполагаемый механизм активации и каталитического действия [NiFe]-гидрогеназ. На схеме в комбинированном виде представлены процесс активации и каталитического действия, полученные путем потенциометрического титрования, кинетических измерений и кристаллических структур окисленной и восстановленной форм [NiFe]-гидрогеназ. Связывающие серные и двухатомные лиганды железа опущены, показаны только тиоловые группы цистеиновых лигандов атома никеля [NiFe]-гидрогеназ. Нижними индексами обозначены состояния активного центра: «u» - unready («неактивное»); «г» - ready («подготовленное»); «а» — active («активное») [Vignais, Colbeau, 2004; Foerster etal.,2003].
Принципиальным для катализа является вопрос о природе расщепления молекулы водорода. Все исследователи сходятся во мнении, что расщепление водорода в активном центре гидрогеназ происходит гетеролитически. Это мнение основано, в частности, на работах по изучению изотопного обмена между Нз и D2O [Adams, 1990; Albracht, 1994]. Во всех случаях подтверждается модель: Н2 + Е - ЕН" + Н+ (4) Каталитический акт окисления К2 включает следующие стадии: сорбцию молекулы Нг активным центром; гетеролитическое расщепление её на протон и гадрид-ион; освобождение протонов в среду, сопряженное с переносом электронов внутри молекулы фермента; передачу электронов редокс-партнёру гидрогеназы. Такая реакция происходит в присутствии акцепторов электронов. Обратная реакция - восстановление протонов до Нг - требует присутствия доноров [Vignais et al., 2004]. Детальное изучение кинетики окисления водорода акцептором электронов, катализируемого гидрогеназой Т. roseopersicina, представлено в работе [Зорин и др., 1988]:
где Е - гидрогеиаза, А- акцептор электронов, метилвиологен или бензилвиологен. На стадиях (1), (2) и (6) равновесие сильно смещено в сторону образования продуктов. Стадия (4) также является медленной и определяет скорость ферментативной реакции, стадии (3) и (5) могут протекать как в прямом, так и в обратном направлении.
Еще одним не решенным остается вопрос о связях гидрида с никелем или железом, и формированием моста между этими двумя металлами. На рис 2.3 Ni-C представлен связанным с гидридным лигандом, координированным между атомами М и Fe [Foerster et al., 2003]. Остаток аминокислоты, который протонируется в течение активации или активного цикла фермента, также полностью не идентифицирован [Магопеу и Bryngelson, 2001; Sieghbalm et al., 2001; Fan, Hall, 2001]. Дальнейшее одно электронное окисление NiFe центра в Ni-C состоянии высвобождает этот гидрид как протон и генерирует Ni-S (Ni2+), заканчивая цикл. Ближайший (проксимальный) [4Fe-4S] кластер получает электроны от NiFe центра и передает их через [3Fe-4S] на дистальный [4Fe-4S] кластер, который расположен близко к поверхности молекулы и способен в то же время передать электроны внешнему акцептору или донору. Пара Ni-C/Ni-R находится в термодинамическом равновесии с водородом. В отсутствии окислительно-восстановительного партнера фермент так же активирует молекулярный водород, что можно видеть при помощи водородных изотопов. В присутствии Вг, фермент расщепляет его молекулу на дейтерон (D+) и дейтерид (D ), который посредством обмена с протонами растворителя (НгО) ведет к формированию HD и Щ Тот же самый путь используется для выделения В.2 в ЇҐЮг обменной реакции и в восстановлении протонов экзогенным электронным донором [McTavish et al., 1996; Vignais et al., 2002]. Катализ H /1 обмена является необходимым условием для функциональных моделей активных участков гидрогеназы [Georgakaki et al., 2003].
Ряд современных исследований посвящен вопросу локализации субстрата Н2 (или Dj) в активном состоянии фермента и гидрида (дейтерида) после гетеролитическо-го расщепления молекулы [Bertrand et al.s 2000; Muller et al., 2002]. Для того чтобы проанализировать механизм активации Щ и идентифицировать протонные пути, были получены мутанты гидрогеназ с сайт-направленным мутагенезом аминокислотных остатков, ближайших к активному участку [De Lacey et al., 2000]. Предполагают, что протоны из активного центра от атома Ni переходят к His72, а затем к GlulS, который при вращении передает протоны по цепочке. В ее состав входят четыре молекулы воды, карбоксильный остаток главной С-терминальной цепи, дополнительная молекула воды, консервативный глутамат (Glu46) и молекула воды, которая является лигандом атомов Mg или Fe, располагающихся около поверхности белка. Последняя молекула воды, участвующая в цепи переноса протона, является, наряду с двумя дополнительными молекулами воды, лигандами консервативного глутамата (GIu321). Атом магния участвует не только в переносе протонов от активного центра к поверхности молекулы, но и организации белковой молекулы [Volbeda et al., 1995; Fontecilla-Camps et al., 2001].
Определение гидрогеназной активности
Активность фермента определяли двумя методами: 1) по восстановлению метилвиологена (бензилвиологена) («Sigma») водородом спектрофотометрическим методом в кювете Тунберга [Zorin et al., 1996], - реакционная смесь (общим объемом 2 мл) содержала 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 7,0 (9,0), 4 (1) мМ раствор метилвиологена (бензилвиологена) и 5-10 мкг белка гидрогеназы. Активность фермента рассчитывали по формуле 1. Arfl=(ADV)/s60o, (1)
где Агд - активность гидрогеназы місмоль Нг/мин; AD = D2 — Di, разность значений оптической плотности между двумя точками в 1 мин; V - объём реакционной смеси (мл); seoo - коэффициент экстинкциж метилвиологена.
Все измерения активности фермента проводили при температуре 30С. Для расчета активности использовали молярные коэффициенты поглощения восстановленного метилвиологена (seoo —13,00 мМ"1#см") и бензилвиологена (S555- 7,55 мМ" см" ) [Серебрякова, Гоготов, 1981]. Ферментативную активность выражали в мкмоль НУ мин на 1 мг белка.
2) и методом газовой хроматографии по выделению водорода из восстановленного дитионитом метилвиологена [Zorin et al., 1996], - реакционная смесь (2 мл) включала 5-10 мкг белка препарата, 50 мМ Tris-HCl-буфер (рН 7,0), 4 мМ метилвиологена и 20 мМ дитионита натрия. Реакционные сосуды (герметично закрытые пенициллиновые пузырьки на 15 мл, воздух в которых был заменён аргоном) инкубировали на качалке (120-150 об./мин), при 30С. Через определённые промежутки времени шприцем отбирали пробы газовой фазы, состав которых анализировали на газовом хроматографе «Га-зохром-3101» Общую активность гидрогеназы рассчитывали по формуле 2:
где: Агд - гидрогеназная активность, нмоль Н мин-мл; К — коэффициент пропорциональности; h - высота пика, соответствующая Нг, мм; Уг.ф. - объем газовой фазы (разность между объёмом сосуда и объёмом реакционной смеси), мл; t - время реакции, мин; Vnp. - объём активного компонента, мл,
Гидрогеназную активность рассчитывали как отношение общей активности к содержанию в препарате белка и выражали в нмоль 1 /мин на 1 мг белка.
Содержание белка определяли по Лоури [Методы общей бактериологии, 1989] и Брэдфорд [Bredford, 1976],
Восстановление ионов металлов клетками бактерий и препаратами гидрогеназ изучали в долговременных и кратковременных экспериментах. Для проведения долговременных экспериментов клетки бактерий собирали в конце логарифмической фазы роста центрифугированием (10 000g, 20 мин, 4С), промывали три раза 20 мМ Tris-HCl буфером рН 7,0 и ресуспендировали в том же буфере до плотности биомассы около 9,0 мг клеток (сухой вес)/мл. Клеточную суспензию или препараты гидрогеназ активировали в течение ночи в атмосфере водорода. Реакционная смесь (общим объемом 4 мл), состоящая из аликвоты суспензии клеток (0,4 мл) или препарата гидрогеназ (5-10 мкг белка); 50 мМ Tris-HCl буфера рН 9,0; 4 мМ метилвиологена и 0,04 мМ NiCl2 (PdCl2; RuCl3; [PtClelCNH ). Её помещали в 10 мл пузырьки, которые заполняли водородом и закрывали резиновыми пробками с зажимами и инкубировали в течение 26-30 дней при температуре 24С. В долговременных экспериментах скорость восстановления ионов металлов определяли по уменьшению концентрации иоиов металлов в реакционной среде спектрофотометрическим методом с использованием диметилглиоксима [Дорохова, Прохорова, 1991]. Пробу, содержащую №С12 (0,005-0,1 мг/мл), смешивали с 1 мл 2% K-Na тартрата, доводили дистиллированной водой до конечного объема 2,0-2,5 мл и встряхивали. Затем к полученной реакционной среде поочередно добавляли 0,1 мл h (0,05 М 12 в 0,1 г/мл KI); 0,1 мл диметилглиоксима (5 мМ раствор в 96% этаноле); 0,6 мл 1 М NaOH и дистиллированную воду до конечного объема 10 мл. Реакционную смесь встряхивали и измеряли ее оптическую плотность при 470 нм через 30 мин. Раствор МС12 (0,005-ОД мг/мл) использовали в качестве стандарта для построения калибровочного графика.
Скорость восстановления ионов металлов измеряли так же в кратковременных экспериментах по поглощению водорода при помощи DW1 О2/Н2 электрода Hansatech (Англия). Реакцию проводили в кювете (общий объем 1 мл) с магнитной мешалкой, закрытой газонепроницаемой тефлоновой крьшікой при 30С. Реакционная смесь состояла из аликвоты препарата гидрогеназ (5-10 мкг белка); 50 мМ Tris-HCl буфера рН 9,0; 2 мМ метил- (бензил-) виологена (1 мМ K3Fe(CN)6); 0,01 мМ NiCl2 (PdCI2; RuCl3; [PtCl6](NH4)2) и 0,1 мл дистиллированной воды, насыщенной водородом. Скорость поглощения водорода вычисляли, используя стандартное количество водорода (т.е. 100 мкл дистиллированной воды, насыщенной водородом при 30С, содержащей 77,4 нмоль Н2). В контроле, не содержащем ионы металла, поглощения водорода не наблюдалось, 4.5. Окисление металлов препаратами гидрогеназ.
Скорость окисления металлов определяли по выделению водорода, измеренного на газовом хроматографе и DW1 02/Н2 электродом Hansatech (описанного выше). Реакционная среда с общим объемом 2 (1) мл содержала 10 (5) мг порошка металла, 50 мМ MES (2-[N-morpholiao]-ethanesulfonic acid)-NaOH рН (4,0 - 7,0), 4 (2) мМ метилвиологена. 5-10 (1-5) мкг белка. В контроле, в отсутствие металла, выделение водорода не наблюдалось. 4.6. Аналитические методы.
Определение изоэлектрической точки проводили по методу Ригли с модификациями в приборе для диск-электрофореза. Для приготовления рабочего раствора использовали 40%-ный Амфолин («LKB»), рН 3,5-5,0 [Гильманов и др., 1971]. После окончания шоэлектрофокусирования, определяемого по прекращению падения силы тока, гели извлекали из трубочек, промывали в дистиллированной воде и проявляли в них гидрогеназную активность. Для определения изоэлектрической точки гидрогеназы, из параллельно полученных не проявленных гелей вырезали зоны шириной 3 мм, соответствующие зонам уже проявленной гидрогеназы. Вырезанные зоны продавливали через стеклянный шприц и заливали дистиллированной водой. Через 24 ч определяли значения рН на рН-метре ОР-264/1.
Определение четвертичной структуры, Субъединичный состав гидрогеназы и оценку молекулярной массы субъединиц определяли электрофорезом в 12,5% ПААГ в присутствии 0,1 % Ds-Na по методу Лэммли [Laemmli, 1970]. Образцы для электрофореза, содержащие 5-10 мкг белка, обессоливали с использованием микро концентраторов («Araicon», США) и кипятили 10 мин в буфере с Ds-Na. Белки в геле окрашивали после фиксации 0,05%-ным раствором кумасси R-250. Концентрацию бешса определяли по методу Бредфорд [Bradford, 1976].
СО получали разложением муравьиной кислоты концентрированной H2SO4 при ЮО С. В работе использовали реактивы отечественного производства марки х.ч. и осч. («Реахим», Россия).
Стабильность гидрогеназы при хранении
Как и для гидрогеназы Т. roseopersicina [Зорин, Гоготов, 1982], фермент из L. modestohalophilus проявлял высокую стабильность при хранении. Для выяснения условий, влияющих на стабильность гидрогеназы L. modestohalophilus, была изучена кинетика инактивации фермента при хранении под разными газовыми фазами и разных температурах (рис. 5.3). Оказалось, что температура оказывает более существенное влияние на стабильность фермента, чем состав газовой фазы. Так, период полуинактивации гидрогеназы при хранении на воздухе при 4С был почти в 5 раз, а под аргоном и водородом - почти в 2 раза выше, чем при 20С. При хранении под аргоном стабильность препаратов гидрогеназ была примерно в 1,5 раза выше, чем под воздухом и водородом. Хранение препаратов гидрогеназы из L. modestohalophilus при температуре -70С не снижало активности этого фермента в течение длительного времени.
Препараты гидрогеназы ( 100 мкг в расчете на белок) инкубировали в среде, состоящей из 50 мМ Tris-HCl-буфера (рН 7,0) и 0,02% NaN3. За 100% активности фер мента принимали активность гидрогеназы, равной 40 мк моль Н /мин на 1 мг белка, измеренной в реакции окисления водорода в 50 мМ Tris-HCl-буфере (рН 9,0) при 30С.
Гидрогеназа L. modestohalophilus проявляет высокую устойчивость к нагреванию. Для изучения термостабильности фермента препараты гидрогеназы этой бактерии инкубировали 1,5 мин при заданной температуре в среде, содержащей 50 мМ Tris-HCl-буфер (рН 7,0), а затем измеряли ее каталитическую активность в реакции окисления водорода (рН 9,0, 30С). Значительная инактивация фермента наблюдалась при температуре выше 80С (рис 5.4, а). Для изучения влияния температуры на активность гидрогеназы из L. modestohalophilus препарат гидрогеназы (2-5 мкл) вносили в предварительно нагретую реакционную смесь и измеряли активность фермента в реакции окисления водорода. Температурный оптимум реакции восстановления метилвиологена составил 85С (рис. 5.4, б). Активность гидрогеназы возрастала более чем в 10 раз лри увеличении температуры от 30аС до 80С, достигая 531 мкмоль Нг/мин на 1 мг белка.
Влияние рН на активность фермента.
Исследование влияния рН среды на активность гидрогеназы L. modestohalophilus показало, что активность фермента в реакциях окисления и образования водорода бьша постоянной в начальный период времени при всех значениях рН. Оптимум рН в реакции образования водорода составил 4,0, а в реакции окисления Нг находился в диапазоне 8,5 - 9,5 (рис. 5.5). Такие же оптимальные значения рН характерны для гадрогеназ из других фототрофных и хемоторофных бактерий [Серебрякова и др., 1987; Zorin et al., 1996]. 45 -j 40 -35 -ЗО 25 20 H 15 10 5 О
Оптимум pH гидрогеназы L, modestohalophilus в реакции образования (Л и окисления (2) водорода.
Известно, что окись углерода является ингибитором гидрогеназ из ряда фото-трофных бактерий [Серебрякова, Гоготов, 1991]. Зависимость начальной скорости поглощения Нг гидрогеназой L. modestohalophilus от концентрации СО при различном содержании окисленного метилвиологена описывается параллельными прямыми в координатах 1/v от [Цо (рис. 5.6). Следовательно, СО является бесконкурентным по отношению к окисленному метилвиологену ингибитором.
Влияние ионов металлов на спектр поглощения гидрогеназы
Клетки фототрофных бактерий Т. roseopersicina и L. modestohalophilus в долгосрочных экспериментах в атмосфере водорода аккумулировали ионы Ni2+, Pt4+, Pd2+ и Ru + из реакционной среды, образуя черный осадок и металлическое зеркало на поверхности сосуда (рис 7.1).
Опыты проводились в пенициллиновых флаконах, закрытых резиновыми пробками и зажимами (рис. 7.1). 1. Флакон содержит 0,4 мл суспензии клеток, 0,04 мМ NiCb, 0,05 М Tris-HCl буфер (рН 9.0) и 4 мМ метилвиологен в атмосфере Аг. 2. То же, что и 1, без метилвиологена в атмосфере водорода. 3. То же, что и 1, в атмосфере Нг. Конечный объем реакционной смеси 4 мл.
В атмосфере аргона в экспериментах с ионами никеля не наблюдались образования осадка, а небольшое уменьшение концентрации ионов никеля в реакционной среде, возможно, происходило за счет адсорбции ионов металлов на поверхности клеток (рис. 7.2) [Pumpel et al., 2003]. Добавление метилвиологена в реакционную систему приводило к ускорению этого процесса. Скорость восстановления ионов никеля клетками бактерий в присутст вий метилвиологена была максимальной в течение первых 24 часов и достигала 1,7 нмоль и 1,0 нмоль Ni(II) на мг биомассы (сухой вес)/час для Т. roseopersicina и L. modestohalophilus, соответственно. После 25 дней инкубации приблизительно 80% для клеток Т. roseopersicina и более чем 60% для клеток L. modestohalophilus 0,04 М NiCh было восстановлено из раствора и в реакционной среде наблюдалось образование черного осадка.
Участие бактерий в восстановлении ионов никеля и локализацию этого процесса исследовали с применением электронно-микроскопических методов. На тотальных препаратах клеток бактерий видно, что черные гранулы накапливаются в межклеточном пространстве (рис. 7.3) и на поверхности клеток бактерий (рис. 7.4 и 7.5).
Рис. 7.3. Электронно-микроскопические фотографии тотальных препаратов клеток Т. roseopersicina после инкубации с NiCb в атмосфере водорода. Линия 0,5 цм (а) и 1,0 цм (б). Рис. 7.4. Электронно-микроскопические фотографии тотальных препаратов клеток Т. roseopersicina. Клетки инкубировали с 0,04 мМ NiCh в атмосфере аргона (а) и под Ні (б) в присутствии метилвиологена в качестве донора электронов. Линия = 0,5 \хм.
Рис. 7.5. Электронно-микроскопические фотографии тотальных препаратов клеток L. modestohalophilus. Клетки инкубировали с 0,04 мМ NiCb в атмосфере аргона (а) и под Нг (б) в присутствии метилвиоло-гена в качестве донора электронов. Линия = 0,5 цм.
На фотографиях препаратов ультратонких срезов видно, что темные образования накапливаются внутри клеток микроорганизмов (рис. 7.6 и 7.7). Для увеличения контрастности срезов препараты обработали раствором уранилацетата.
Рис. 7.6. Электронно-микроскопические фотографии ультратонких срезов клеток Т. roseopersicina инкубированные с 0,04 мМ NiCh под Аг (а) или Нг (б). Срезы с 3%-ным уранилацетатом в 70%-ом этаноле. Линия = 0,5 \ім.
