Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Основы биологического метода анализа 10
1.2. Живые организмы различных систематических групп, используемые в качестве аналитических индикаторов 16
1.2.1. Микроорганизмы как аналитические индикаторы 16
1.2.1.1. Основные аспекты жизнедеятельности микроорганизмов с аналитической точки зрения 16
1.2.1.2. Этапы количественного микробиологического анализа 19
1.2.1.3. Перспективные индикаторные микроорганизмы
1.2.2. Беспозвоночные как аналитические индикаторы 23
1.2.3. Позвоночные как аналитические индикаторы 27
1.3. Формирование аналитического сигнала в биологическом методе анализа 28
1.4. Проблема изучения синергических и антагонистических эффектов при совместном воздействии токсикантов на живые организмы 33
1.4.1. Синергические и антагонистические эффекты при совместном воздействии катионов тяжелых металлов на микроорганизмы 34
1.4.2. Синергизм и антагонизм при совместном воздействии катионов тяжелых металлов на гидробионтов 37
1.4.3. Специфика совместного действия катионов тяжелых металлов на сельскохозяйственные растения 39
1.4.4. Проблема совместного действия катионов тяжелых металлов и других токсикантов на биологические объекты 40
1.5. Выводы по обзору литературы
ГЛАВА 2. Техника эксперимента 44
2.1. Оборудование, реактивы и материалы 44
2.1.1. Оборудование 44
2.1.2. Реактивы и материалы
2.2. Обоснование выбора объектов исследования 46
2.3. Методика исследования
2.3.1. Подготовка посуды и индикаторных организмов 50
2.3.2. Выполнение эксперимента 51
2.3.3. Математическая обработка результатов экспериментов 52
ГЛАВА 3. Комбинированное действие катионов тяжелых металлов на бактерии 55
3.1. Изучение действия смеси катионов цинка и меди на Bacillus subtilis niger 58
3.2. Изучение действия смеси катионов цинка и кадмия на Bacillus subtilis niger 62
3.3. Изучение действия смеси катионов цинка, меди и кадмия на Bacillus subtilis niger 66
3.4. Изучение действия смеси катионов цинка, меди, кадмия и ртути на Bacillus subtilis niger 72
ГЛАВА 4. Влияние вида питательной среды на комбинированные эффекты 81
4.1. Обоснование выбора питательных сред для решения поставленных задач 81
4.2. Способы приготовления питательных сред 83
4.3. Изучение комбинированного действия катионов цинка и кадмия на бактерии на выбранных питательных средах 84
ГЛАВА 5. Определение концентрации тяжелых металлов в смесях с учетом комбинированных эффектов ... 88
Заключение 93
Выводы 96
Литература
- Живые организмы различных систематических групп, используемые в качестве аналитических индикаторов
- Реактивы и материалы
- Изучение действия смеси катионов цинка и кадмия на Bacillus subtilis niger
- Изучение комбинированного действия катионов цинка и кадмия на бактерии на выбранных питательных средах
Живые организмы различных систематических групп, используемые в качестве аналитических индикаторов
Преобразование ответной реакции тест - организма в аналитический сигнал представляет собой одну из самых сложных задач, решаемых в рамках развития биологического метода анализа. Выбор способа регистрации ответного сигнала на заключительной стадии анализа зависит как от целей анализа, так и от механизма и глубины действия вещества на индикаторный организм, и наоборот, организма на определяемое вещество [8]. В качественных и полуколичественных методиках часто используется визуальный способ регистрации аналитического сигнала. Визуально оценивается уровень роста микроорганизмов через определенное время после их посева [14], количество иммобилизованных гидробионтов [15], изменение характера поведения тест - организмов [16]. Для количественного определения веществ предпочтительны приборные способы регистрации аналитического сигнала [17-21]. Подробнее эта тема будет обсуждена в 1.3.
Диапазон определяемых содержаний и предел обнаружения при анализе веществ биологическим методом зависят от ряда факторов: характера и продолжительности действия определяемого вещества на организм, температуры и рН среды, родовой и видовой принадлежности индикаторного организма, его возрастных, половых, индивидуальных особенностей и др.
Наименьшее содержание вещества, определяемого с заданной доверительной вероятностью, характеризуется пределом обнаружения Cmjn, который понижается с увеличением времени наблюдения за тест - организмом (х) и повышением температуры (Т) [9]. В общем виде эта зависимость представлена на рис.2. X Рис. 2. Изменение предела обнаружения в зависимости от времени т и температуры Т Отрезок времени наблюдения за ответной реакцией организма выбирается с учетом цели анализа (хронический эксперимент может продолжаться 40 -50 суток). Температура свертывания белка Т,ф, как правило, ограничивает допустимый интервал изменения температуры. В [9] есть указания на то, что Cniin целесообразно выражать через -log Саш,. При этом зависимость -log Cmjll=f(T,T), изображенная на рис.2, в компактной форме дает достаточно подробную информацию о чувствительности индикаторного организма и условиях выполнения анализа. Взаимосвязь предела обнаружения и ответной реакции организма описывается уравнением Cminn т=К, где п и К - эмпирические константы, характеризующие биологическую активность организма и определяемого вещества. Проблема избирательности является для биологического метода одной из самых сложных. Эта сложность объективна, так как биологическая система, используемая в аналитических целях, в силу своей организации всегда будет менее избирательна к широкому кругу веществ, нежели подобная физико - химическая система. Интегральность отклика тест - организма на действие смесей веществ является достоинством метода при биотестировании и недостатком -при аналитическом определении содержания веществ. Существует два принципиально разных способа повышения избирательности биологического метода. Первый способ состоит в поиске и использовании индикаторных организмов, высокочувствительных к определяемым веществам, и менее чувствительных к сопутствующим. Примером может служить методика определения низких концентраций цинка с помощью микроорганизмов Streptomyces olivaceus [22]. В этой методике аналитическим сигналом является диаметр зон пигментации стрептомицетов при введении в питательную среду катионов цинка. Определению не мешают значительные количества щелочных и щелочноземельных металлов, 200 - кратные количества РЬ2+, 30 -кратные Си2+ и Ni2+, 60 - 90 - кратные Al3+, Se2+. Также возможно избирательное определение катионов кадмия на фоне катионов цинка, меди, кобальта, никеля с помощью плесневых грибов Aspergillus awamori [23]. Посторонние катионы могут присутствовать в концентрациях, в 103 - 105 раз превышающих концентрацию кадмия в растворе.
Второй способ повышения избирательности биологического метода заключается в предварительном изменении биологической активности определяемого вещества и других компонентов пробы с помощью аналитических приемов маскирования или демаскирования : комплексообразования, окисления - восстановления, осаждения, галогенирования и т. д. Изменение биологической активности компонентов анализируемого раствора позволяет получить ответную реакцию индикаторного организма только на определенное вещество или группу веществ, что с учетом механизма их биологического действия дает возможность распознать природу определяемого вещества, а в случаях повышения биологической активности - снизить предел его обнаружения. Совокупность процедур специальной подготовки пробы с последующим биологическим определением вещества носит название химико - биологического метода анализа. Это новое перспективное направление в аналитической химии развивается в Нижегородском государственном университете под руководством проф. А. А. Туманова с 1988 года и обсуждается в работах [24, 25]. Для анализа химико -биологическим методом используют две части пробы, в одну из которых в за 15 висимости от природы определяемого вещества вводят те или иные реагенты, позволяющие изменить (повысить, понизить, снять) биологическую активность компонентов пробы; вторая часть пробы является контрольной. Обе части пробы подвергают биотестированию, при котором оценивают выживание или иную реакцию индикаторного организма после активации или инактивации компонентов и без активации ( в контрольной пробе), и на основании этой оценки судят о качественном составе вещества [25]. Ответную реакцию организма на воздействие модифицированной или контрольной части пробы можно преобразовать в аналитический сигнал, и на основании этого провести количественное определение вещества.
Реактивы и материалы
При использовании позвоночных в биологическом методе анализа в качестве аналитических индикаторов можно применять как целый организм, так и органы, ткани и системы, обладающие ярко выраженной хеморецепцией.
Биологическое определение веществ, основанное на применении целого организма, предполагает контроль поведенческих реакций, скорости размножения и выживаемости. Примером определения веществ с помощью целостных организмов является методика, описанная в [46]. В данной методике в роли индикаторных организмов выступают живородящие рыбки гуппи, а аналитическим сигналом служит продолжительность жизни. Авторами получен ряд чув О L 0-1- 0-1- " 1" ствительности гуппи к катионам тяжелых металлов : Hg Си Cd Pb Ni2+ Мп2+. Минимальная определяемая концентрация Hg2+ 1-Ю"6 моль/л.
Использование изолированных органов и тканей представляет интерес вследствие их высокой чувствительности, быстроты отклика и возможности автоматизации. Известны методики определения кислот, щелочей и некоторых катионов тяжелых металлов по изменению биоэлектрической активности седалищного нерва лягушки Rana redibunda Z [47]. Установлено, что седалищный нерв с достаточно высокой чувствительностью реагирует на хлориды меди, цинка, марганца и кобальта. Растворы МпСЬ с концентрацией порядка 1-Ю 9 моль/л приводят к длительному повышению возбудимости нерва, а растворы той же соли с концентрацией 1-Ю"6 моль/л угнетают возбудимость нерва. Растворы СиС12 с концентрацией 10 9 - 10"8 моль/л снижают возбудимость нерва вплоть до полного блокирования. В [48] описана методика количественного определения катионов Ag+, Hg2+ на уровне концентраций 10"7 моль/л, и Со +, Ni + на уровне 10"6 моль/л с использованием в качестве аналитического сигнала степени дегенерации тканей человека. Определение проводится методом сравнения дегенерации с контрольными пробирками с известной концентрацией катиона.
Проблема формирования аналитического сигнала является одной из самых сложных при разработке биологических методик анализа веществ. Тест -организм откликается на присутствие (или отсутствие) в среде обитания определяемых веществ путем изменения многих своих свойств: морфологических, культуральных, физиологе - биохимических [49]. Изменение вышеперечисленных свойств может быть при определенных условиях преобразовано в аналитический сигнал. Правильный выбор индикаторного свойства организма и, что особенно важно, способа регистрации аналитической информации определяет успех разработки и использования соответствующей методики. Рассмотрим основные способы регистрации информации, получаемой с помощью биологических методик анализа.
Визуальная оценка аналитических результатов применяется в качественных и полуколичественных методиках. В основном она связана с ростовыми реакциями (микроорганизмы) и с учетом количества иммобилизованных или погибших организмов (парамеции, дафнии и другие гидробионты). В методиках [14, 21] визуально оценивается уровень роста штрихового посева бактерий через определенное время по четырем категориям : нормальный рост, частично угнетенный рост, угнетенный рост, отсутствие роста. В методике [31] рост бактерий оценивается более упрощенным бинарным образом (наличие или отсутствие роста), что не мешает успешному определению латекса трибутилолово-содержащего сополимера на уровне 2-3 мкг/мл. Показана возможность определения интегральной токсичности комбикормов [15] и содержания цианидов в воде [27] с использованием в качестве аналитического сигнала числа иммобилизованных дафний. Использование визуальной регистрации аналитического сигнала в количественных биологических методиках приводит к значительным погрешностям (30 -50 %). Поэтому для количественного определения веществ предпочтительны инструментальные способы регистрации аналитического сигнала. Инструментальному измерению поддается гораздо большее количество жизненных функций индикаторного организма, нежели визуальной оценке. Наиболее простым и широко распространенным способом приборной регистрации ростовых реакций микробных культур является измерение диаметра (площади) зон подавления или стимуляции роста тест - организмов при выращивании их на плотных питательных средах. Этот способ объединяет ряд работ, использующих различные микроорганизмы: плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты, бактерии [17-19]. Изменение размеров зон подавления роста бактерий в зависимости от концентрации исследуемого вещества показано на рис.4.
Изучение действия смеси катионов цинка и кадмия на Bacillus subtilis niger
Для исследования выбраны следующие области концентраций катионов: Zn2+ : 1-Ю"5 - 1-Ю"4 моль/л; Си2+ : 2.5-10"5 - 2.4-10"4 моль/л. Данные концентрации в основном меньше минимальных ингибирующих концентраций, представленных в таблице 3, что объясняется большей чувствительностью лаг - фазы как аналитического сигнала по сравнению с уровнем суточного роста бактерий. Использовано 6 градаций концентрации цинка и 8 градаций концентрации меда. Получен массив значений относительной продолжительности лаг - фазы (Тэ) при различных сочетаниях концентраций катионов. По массиву экспериментальных данных согласно уравнению (2) построена функциональная модель токсического действия исследуемой смеси катионов на бактерии. Уравнение моделирующей функции имеет вид: Тмыс. =0.14-1.6-103CZn -1.7-103ССи +6.7-Ю6 + + 4.9- 107Cl+1.06 -107СД,
График функции представлен на рис 10. Достоверность полученной модели оценена с помощью критериев, описанных в 2.3.3. Коэффициент корреляции экспериментальных и "модельных" данных составил 0.87, что считается хорошим результатом для биологических систем (рис. 12). Значение % - критерия 21 при значении х криг 61 говорит о том, что гипотеза об описании экспериментальных данных функцией вида (2) является правильной при выбранном значении доверительной вероятности (Р = 0.95). Средняя погрешность прогноза токсичности смеси катионов по уравнению (5) составляет 12 %.
На основании данных об индивидуальном действии цинка и меди на бактерии (табл. 5, рис. 6, 7) согласно (4) сформирована функция, описывающая гипотетическое аддитивное действие токсикантов. Уравнение функции имеет вид:
При сравнении рис. 10 и рис. 12 видно, что значения Тм в целом лежат ниже значений Тддц, что позволяет предположить наличие в исследуемой системе антагонистического эффекта. Для количественной оценки совместного воздействия цинка и меди на бактерии согласно уравнению (3) сформирована функция взаимного влияния токсикантов (WZnCu), имеющая следующий вид:
График функции представлен на рис. 13 с помощью линий равного уров Рис. 13. Функция взаимного влияния катионов цинка и меди при их действии на бактерии
Из рис. 13 видно, что практически во всей области исследуемых концентраций катионов имеет место антагонистический эффект (Wzncu l)- Величина Wzn.cu, усредненная по области исследуемых концентраций, составляет 0.5. Полученные данные согласуются с результатами качественной оценки совместного действия катионов на бактерии (см. табл. 4). Анализ функции взаимного влияния позволил найти координаты минимума: Czn = 2.5-Ю"5 М, Сси _ 8.6-10"5 М. При этих концентрациях катионов значение WznCu составляет 0.24, что соответствует максимальному уровню антагонизма в данной системе. При увеличении концентрации как катионов цинка, так и меди, значение WZn о, увеличивается, т.е. характер комбинированного действия приближается к аддитивному. 3.2. Изучение действия смеси катионов цинка и кадмия на Bacillus subtilis niger
Для исследования выбраны следующие области концентраций катионов: Zn2+ : 1-Ю"5 -1-Ю"4 моль/л; Cd2+ : 5-Ю"6 - 2.6-105 моль/л. Использовано 6 градаций концентрации цинка и 6 градаций концентрации кадмия. Получен массив значений относительной продолжительности лаг - фазы (Тэ) при различных сочетаниях концентраций катионов. По массиву экспериментальных данных согласно уравнению (2) построена функциональная модель действия исследуемой смеси катионов на бактерии. Уравнение моделирующей функции имеет вид:
Функциональная модель действия смеси Zn2+ - Cd2+ на бактерии Достоверность полученной модели оценена аналогично 3.1. Коэффициент корреляции экспериментальных и "модельных" данных составил 0.89 (рис. 15). Значение х - критерия 4.5 при значении Хкрш- 45.6 говорит о том, что гипотеза об описании экспериментальных данных функцией вида (2) является правильной при выбранном значении доверительной вероятности (Р = 0.95). Средняя погрешность прогноза токсичности смеси катионов по уравнению (8) составляет 10.4%.
Изучение комбинированного действия катионов цинка и кадмия на бактерии на выбранных питательных средах
Для культивирования бактерий в лабораторных условиях можно использовать различные виды питательных сред. Известно более двух тысяч их разновидностей [96]. Однако применение питательных сред при исследовании комбинированных эффектов в рамках биологического метода анализа накладывает на них определенные ограничения.
Естественные среды содержат минимально измененные органические вещества природного происхождения. Как правило, состав таких сред неизвестен, что затрудняет их применение при количественных микробиологических исследованиях.
Искусственные питательные среды содержат очищенные органические и неорганические компоненты. Эти среды должны содержать все необходимые для роста и размножения микроорганизмов вещества, являющиеся источниками азота и углерода. Искусственные среды можно разделить на самостоятельно изготавливаемые в лабораториях и выпускаемые централизованно (сухие питательные среды) [97]. Источниками азота в таких средах в основном служат белки животного происхождения - мясо (преимущественно говяжье), рыба, мясо -костная мука, казеин. Также для этой цели применяют заменители мяса - плаценту, кровяные сгустки, дрожжи; можно использовать белки растительного происхождения (соевые бобы, ячмень, горох). Нами показано, что питательные среды, содержащие животные белки или продукты их гидролиза, связывают тяжелые металлы в большей степени, чем среды с другими источниками азота. Это затрудняет применение животных белков в качестве компонентов питательных сред для микробиологического метода анализа. Также при выборе среды для исследования действия катионов тяжелых металлов на микроорганизмы следует отдать предпочтение сухим питательным средам в силу постоянства их состава.
Синтетические питательные среды состоят из растворов химически чистых веществ (в основном неорганических солей) в строго определенном соотношении. В качестве источников азота в этих средах обычно используются добавки аминокислот. Преимущество синтетических питательных сред заключается в сведении к минимуму содержания веществ, связывающих тяжелые металлы, а также в воспроизводимости их состава. Вместе с тем, синтетические среды достаточно редко используются в микробиологическом методе анализа. Это связано с их недостаточным обогащением питательными веществами, что затрудняет рост индикаторных организмов.
По консистенции питательные среды разделяют на жидкие, полужидкие и плотные [98]. В качестве уплотнителей используют агар-агар, желатин, иногда силикагель. Плотные среды получают добавлением к жидким средам 2-2.5% агар-агара, 2-3% желатина или 1.5% силикагеля; полужидкие среды содержат 0.8 - 1.2% агар-агара. Питательные свойства плотной среды зависят только от наличия комплекса питательных веществ и не зависят от уплотнителя. Выбор консистенции питательной среды в микробиологическом анализе зависит от способа регистрации аналитического сигнала.
Для создания осмотических условий, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов, в питательные среды добавляют 0.5% хлорида натрия. Это необходимо учитывать при работе с некоторыми катионами, например катионами серебра. Исследованию воздействия катионов цинка, меди, кадмия и ртути на бактерии данное количество NaCl не мешает.
Как правило, оптимальный для жизнедеятельности бактерий рН питательных сред находится в интервале 7-7.4. Однако при данных значениях рН доля катионной формы некоторых тяжелых металлов резко уменьшается. Поэтому для исследований необходимо выбирать меньший уровень рН среды: 5 -6.5.
Учитывая вышеизложенное, для изучения комбинированного действия катионов тяжелых металлов на бактерии при выбранном способе оценки аналитического сигнала больше всего подходят плотные питательные среды, приготовленные из сухих промышленных препаратов и содержащие минимальное количество животных белков (или не содержащие их вовсе). Этим требованиям всех лучше соответствует дрожжевой агар Ставропольского НИИ вакцин и сывороток, который и был выбран в качестве базовой питательной среды в начале исследования. В данной части работы в качестве дополнительных питательных сред предложены триптозный агар, приготовляемый из сухого препарата (Ferak Berlin), и картофельный агар на основе порошка сухого агара и картофельного отвара.
Дрожжевой агар готовится из порошка дрожжевого агара Ставропольского НИИ вакцин и сывороток путем растворения в воде (4 г порошка на 100 мл дистиллированной воды) с последующим автоклавированием под давлением 1 атм в течение 30 минут. Емкости с питательной средой хранятся в затемненном месте; разлив осуществляется над пламенем спиртовки.
Триптозный агар готовится из порошка триптозного агара Ferak Berlin растворением в воде (4 г порошка на 100 мл дистиллированной воды) с последующим автоклавированием под давлением 1 атм в течение 30 минут.
Картофельный агар готовится путем добавления к 20% картофельному отвару порошка агар-агара (2 г на 100 мл отвара) с последующим автоклавированием в течение 30 минут под давлением 1 атм. Способ приготовления картофельного отвара: 200 г очищенного картофеля нарезать, залить 1 л дистиллированной воды, прокипятить 30 мин, фильтровать через ватно-марлевый фильтр, картофель промыть и довести объем отвара дистиллированной водой до 1 л.
