Содержание к диссертации
Введение
1. Генетическая структура Mycobacterium tuberculosis, её вариабельность и факторы, определяющие вирулентность. Обзор литературы 5
1.1 Геном М. tuberculosis и характерные особенности патогена на примере штамма H37R.V 5
1.2 Генетическая вариабельность М. tuberculosis 11
1.3 Геномные и белковые факторы, определяющие вирулентность М. tuberculosis 27
2. Результаты и обсуждение 45
2.1 Метод вычитающей гибридизации и его применение для полногеномного сравнения внутривидовых вариантов М. tuberculosis 46
2.2 Полногеномное сравнение штаммов М. tuberculosis HN878 и CDC1551, вызывающих различные клинические формы туберкулёза 53
2.3 Полногеномное сравнение российских клинических штаммов М. tuberculosis со штаммом H37R.V 59
2.4 Исследование полиморфизма дифференциальных локусов в популяции клинических штаммов М. tuberculosis, циркулирующих на территории Российской Федерации 67
3. Практическая часть 75
3.1 Материалы 75
3.2 Методы 80
Выводы 94
- Генетическая вариабельность М. tuberculosis
- Геномные и белковые факторы, определяющие вирулентность М. tuberculosis
- Полногеномное сравнение штаммов М. tuberculosis HN878 и CDC1551, вызывающих различные клинические формы туберкулёза
- Исследование полиморфизма дифференциальных локусов в популяции клинических штаммов М. tuberculosis, циркулирующих на территории Российской Федерации
Введение к работе
Туберкулёз - хроническое инфекционное заболевание, вызываемое грамположительной бактерией Mycobacterium tuberculosis. Согласно данным последнего глобального мониторинга, треть мировой популяции заражена этим патогеном [1]. Несмотря на применение краткосрочной хемотерапии и вакцинации с помощью вакцины БЦЖ, борьба с туберкулёзной бациллой остаётся серьезной проблемой здравоохранения. Всё шире распространяется явление лекарственной устойчивости возбудителя ко многим противотуберкулёзным препаратам, а также смертельный вариант заражения М. tuberculosis ВИЧ-инфицированных индивидуумов.
Считается, что предок так называемого туберкулёзного комплекса, в который входят М. tuberculosis, М. bovis, М. bovis BCG, М. africanum и М. microti (МТК - микобактерии туберкулёзного комплекса), произошёл от почвенной бактерии, и что бацилла, поражающая человека, могла возникнуть из бычьей формы вслед за одомашниванием крупного рогатого скота [2]. Впрочем, не так давно эта версия была подвергнута сомнению, и было высказано предположение, что предковый патоген уже был способен инфицировать человеческий организм [3]. Возникновение современной популяции М. tuberculosis связывают с клональным распространением патогена после прохождения так называемого эволюционного «бутылочного горлышка», время её возникновения оценивается в 15-35 тыс. лет назад [4, 5, 6]. Важной характерной чертой современной популяции М. tuberculosis является отсутствие горизонтального переноса генетического материала [6, 7].
К характерным чертам М. tuberculosis как прокариотического организма можно отнести медленное клеточное деление, способность находиться в латентном состоянии, сложное устройство клеточной стенки, внутриклеточный характер патогенеза. Несмотря на отсутствие горизонтального переноса и относительно низкий уровень внутривидовой генетической изменчивости [6, 8, 9], важной проблемой на данный момент является большое фенотипическое разнообразие популяции М. tuberculosis. Штаммы этого микроорганизма демонстрируют различную лекарственную устойчивость и патогенные характеристики, вызывая заболевания разной степени тяжести. Подобные фенотипические отличия связаны прежде всего с изменчивостью ряда генов, которая обеспечивает постоянное возникновение новых вариантов внутри вида [10].
В настоящее время применяется множество экспериментальных подходов, позволяющих группировать штаммы М. tuberculosis согласно их геномным характеристикам и проводить определение неизвестного штамма, относя его к той или иной генотипической группе. Тем не менее, все существующие методы генотипирования преимущественно основаны на полиморфизме повторяющихся последовательностей генома или коротких некодирующих последовательностей [11]. Эти методы не дают возможности соотносить
структурную вариабельность патогена с его функциональными характеристиками. Высокоэффективный метод генотипирования, основанный на вариабельности кодирующих геномных последовательностей, может иметь преимущества перед остальными экспериментальными подходами и использоваться как для диагностических целей, так и для изучения филогенетических отношений между различными штаммами М. tuberculosis.
Генетическая вариабельность М. tuberculosis
Генетическая вариабельность штаммов М. tuberculosis играет первостепенную роль в изучении биологии патогена и вызываемого им заболевания. Во-первых, исследование полиморфизма генов и его сопоставление с фенотипическим разнообразием вида позволяет выявлять гены, ответственные за формирование вирулентности микроорганизма. Во-вторых, знание характерных генотипических черт штаммов М. tuberculosis позволяет проводить их группирование и относить неизвестные изоляты к уже известной группе, что является основной проблемой успешной диагностики патогена. Также знание геномных структур штаммов и их принадлежность к определённой группе позволяет выявлять филогенетические отношения между ними и изучать эволюционную историю данного вида. 1.2.1 Полиморфизм повторяющихся элементов генома и их использование для генотипирования М. tuberculosis. Следует заметить, что проблемы, связанные с генотипированием и диагностикой М. tuberculosis, возникли задолго до определения первичной последовательности её генома и до проведения исследований, связанных с изменчивостью кодирующих геномных областей. Для решения этих проблем анализировались библиотеки, содержащие отдельные участки геномов, с целью поиска молекулярно-генетических маркёров для диагностики. Первые обнаруженные случаи геномного полиморфизма М. tuberculosis, на основании которых разрабатывались методы генотипирования, заключались в изменчивости повторяющихся элементов генома. В 1989 году был применен метод, основанный на анализе полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ). Эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами) расщепляют исследуемую ДНК в специфических сайтах и анализируют длины получающихся при расщеплении фрагментов. Как правило для этого используется гибридизация по Саузерну разделённой электрофорезом фракции рестриктных фрагментов с определённым маркёром. В качестве базового молекулярно-генетического маркера для анализа ПДРФ используется последовательность транспозона 1S6110, впервые обнаруженная в геноме М. tuberculosis. IS6110 является членом ІБЗ-семейства инсерционных элементов, имеет длину 1361 п.о. и обнаружена только в геномах микобактерий туберкулёзного комплекса (МТК). Количество копий IS6110 на геном различается для видов и штаммов микобактерий. Большинство штаммов М. tuberculosis, М. africanum и М. bovis содержат от 1 до 20 копий транспозона, интегрированных в различные места генома, в то время как геном вакцинного штамма М. bovis BCG содержит от 1 до 5 копий.
Важным свойством, способствовавшим применению \S6110 в качестве маркера для генотипирования, является его стабильность. Для расщепления микобактериальной ДНК используют рестриктазу PvuII. IS6110 содержит один сайт рестрикции PvuII, поэтому выявляемое число гибридизованных по Саузерну фрагментов соответствует числу копий IS6110 в микобактериальном штамме. Показано, что характерный набор полос рестриктных фрагментов для конкретного штамма М. tuberculosis остаётся идентичным даже после селективного давления при многомесячном культивировании в средах, содержавших различные антибиотики [33]. Впрочем, позднее было продемонстрировано, что высокая подвижность IS6110 приводит к тому, что получаемый рисунок генотипирования остаётся характерным для определённого микобактериального клона на протяжении приблизительно 3,5 лет [34], в дальнейшем он может меняться в связи с новыми внутригеномными транспозициями. Тем не менее, транспозон IS6110 - один из наиболее широко используемых стандартов для молекулярно-эпидемиологических исследований, так как основанный на его полиморфизме метод обладает высокой степенью дискриминации [35, 36, 37, 38]. Локализация IS6110 в хромосоме М. tuberculosis, так же как и копийность, широко варьирует в штаммах МТК, приводя к высокой степени полиморфизма рестриктных фрагментов, содержащих этот маркер, что и позволяет различать среди анализируемых штаммов большое число разных типов. Несмотря на все свои преимущества, метод IS67/0-RFLP типирования не всегда оказывается пригодным для идентификации штаммов микобактерий туберкулезного комплекса с малым (не более 5) числом копий транспозона или с полным их отсутствием. Для преодоления этих затруднений был предложен другой генетический маркер -транспозон IS1081, также присутствующий в геномах МТК и, кроме того, обнаруженный в геноме М. xenopi [39]. 1S1081 имеет длину 1324 п.о. и меньшую по сравнению с 1S6110 представленность в микобактериальных геномах - 5-6 копий на геном. IS 1081 обладает также меньшей, чем IS6110, степенью полиморфизма (предположительно из-за низкой транспозиционной активности). Однако небольшое число копий \S1081 в геноме ограничивает применение этого маркера в эпидемиологических исследованиях и поэтому его использование для генотипирования не получило такого широкого распространения, как использование 1S6110. Очевидным преимуществом IS 1081 является то, что с его помощью можно проводить типирование штаммов М. bovis, которое не удается осуществить при использовании IS6110. Помимо транспозона 1S6110, подходящим генетическим маркером для ПДРФ типирования являются GC-богатые полиморфные последовательности - PGRS, входящие в состав ряда микобактериальных генов, принадлежащих вариабельному генному семейству РЕ, о котором далее будет сказано подробно.
Применение PGRS для генотипирования ограничивается, во-первых, слишком большим числом образующихся рестриктных фрагментов, имеющих сходные размеры, а во-вторых, различиями в интенсивности гибридизации полос, соответствующим PGRS-содержащим рестрикционным фрагментам [11]. Помимо транспозонов и PGRS последовательностей геном М. tuberculosis содержит большое количество других повторяющихся элементов, полиморфизм которых также использовался для генотипирования данного патогена. Например, полиморфизм хромосомного DR-локуса (от англ. direct repeat - прямой повтор) лёг в основу метода сполиготипирования (от англ. spacer oligotyping), который был впервые предложен в 1996 году [40]. Этот локус содержит различное число коротких прямых повторов длиной 36 п.о., разделенных уникальными последовательностями (спейсерами) длиной от 34 до 41 п.о. Штаммы микобактерий туберкулезного комплекса различаются по числу DR и, соответственно, спейсеров и могут быть дифференцированы по этому признаку. Полиморфизм DR-локуса связан с гомологичной рекомбинацией между соседними или отдаленными DR. Так как эти прямые повторы высоко консервативны для различных штаммов МТК, то очевидно, что каждая копия DR в составе локуса может использоваться в качестве мишени при ПЦР амплификации. Различия в получаемых при амплификации наборах спейсеров дают разные картины гибридизации с набором синтетических олигонуклеотидов, ковалентно пришитых к нитроцеллюлозной мембране. Порядок расположения синтетических спейсеров на мембране соответствует их расположению в геноме. Таким образом, в результате гибридизации образуется характерный для каждого штамма паттерн гибридизации - сполиготип. Первые же работы по применению сполиготипирования продемонстрировали его технические преимущества по сравнению с существовавшими до этого методами - быстрота анализа (не более 2 дней), высокая специфичность, экономичность за счет применения т.н. обратной блот-гибридизации и возможности использовать гибридизационные мембраны до 20 раз. Успехом методики стала возможность дифференцировать штаммы М. tuberculosis и М. bovis, которые было трудно различать традиционными способами [41]. Большинство работ с применением сполиготипирования посвящено изучению вариабельности клинических штаммов М. tuberculosis в различных регионах мира [42, 43, 44, 45].
Геномные и белковые факторы, определяющие вирулентность М. tuberculosis
Согласно наиболее общему определению, данному в Большой Советской Энциклопедии, вирулентность - это степень болезнетворности (патогенности) данного инфекционного агента, штаммовое свойство возбудителя, определяющее, насколько полно представлены видовые (или типовые) патогенные свойства в отношении основного хозяина у данного штамма. Данное свойство включает в себя способность бактерии внедряться в организм животного, размножаться и распространяться в нём, а также вырабатывать ядовитые продукты жизнедеятельности - токсины. Для того, чтобы определить принадлежность какого-либо гена к факторам вирулентности, наиболее часто используется получение мутантов, дефектных по данному гену. При этом, необходимо, чтобы нарушение данного гена приводило к снижению вирулентности штамма, и последующее введение функциональной копии этого гена (в опытах по комплементации) приводило к восстановлению вирулентных свойств. Подобные опыты на микобактериях часто дают трудно интерпретируемые результаты - слишком многие гены претендуют на роль факторов вирулентности, хотя на первый взгляд не несут специфической функции, которая бы могла объяснить необычную устойчивость микобактерий. 1.3.1 Определение вирулентности М. tuberculosis. Для определения вирулентности М. tuberculosis используются различные модели инфекции клеточных линий (макрофагов) и животных. Внесение мутаций в геном микобактерий также проводится с помощью различных экспериментальных подходов. Для достоверного обнаружения факторов вирулентности микобактерий используются как количественные, так и качественные оценки эффекта мутации на ход заболевания. К количественным характеристикам инфекционного процесса можно отнести, например, летальность мутации, определяемая как процент смертности среди инфицированных животных, наблюдаемый по истечении определённого срока времени. Также летальность мутации может определяться как время, необходимое для достижения определённого уровня смертности в группе животных, инфицированных патогеном. Другой важный количественный параметр, который характеризует вирулентность, - это бактериальная множественность (англ. «bacterial load») - количество бактерий, обнаруженных в организме животного или в эукариотическои клеточной культуре по истечении определённого срока времени после инфицирования. Эти количественные характеристики течения заболевания позволяют сравнивать способность различных патогенных штаммов выживать внутри организма-хозяина во время инфекции.
Но кроме количественных параметров, описывающих инфекционный процесс, для определения вирулентности используют качественные характеристики. Так, мутантные микобактерии могут обнаруживать в одинаковой степени замедленный рост в инфицированном организме, но при этом их кривые роста во время течения заболевания различаются. Такие патогены разделяются на три группы [115]. Группа мутантов, не способных к размножению внутри организма-хозяина и быстро элиминирующихся после инфекции, обозначается как SGIV («severe growth in vivo»). Такие бактерии могут не исчезать из инфицированных тканей, но их количество остаётся на постоянном невысоком уровне. Мутантные микобактерии, которые начинают размножаться внутри хозяйского организма сразу после инфекции, но в более замедленных темпах по сравнению со штаммом дикого типа (немутированными бактериями), относятся к группе GIV («growth in vivo»). И наконец те мутанты, которые нормально растут и размножаются на ранних стадиях инфекционного процесса, но чья численность снижается после включения клеточного иммунитета хозяина, относятся к PER-группе («persistence genes»). Описанная классификация мутаций и, соответственно, мутантных микобактерии оказалась весьма удобной для анализа роли генов в патогенезе, когда искусственным путём было внесено большое число генетических изменений в геномы различных микобактерии. Комбинация известных методов внесения мутаций в бактериальный геном с экспериментальными инфекционными моделями и способами характеристики инфекционного процесса позволила исследователям обнаружить ряд генов, играющих важную роль в различных аспектах патогенеза М. tuberculosis. Гены были сгруппированы согласно известным или предполагаемым функциям белков. Экспрессия некоторых из них может регулироваться в процессе течения заболевания. К сожалению, в большинстве случаев, их принадлежность к факторам вирулентности не была показана путём инактивации, обычным подходом, используемым для обнаружения новых вирулентных факторов. 1.3.2 Секреторная активность клетки и функционирование клеточной стенки В этом разделе обсуждаются гены, кодирующие белки, которые поступают во внешнее окружение растущей бактериальной клетки. Это может быть либо культуральная жидкость, либо микобактериальная фагосома. Среди них секретируемые белки и ферменты, которые играют роль в синтезе различных компонентов клеточной оболочки. Белки культуральной жидкости (CFP). Белки культуральной жидкости М. tuberculosis (CFP)- это около двухсот белков, которые обнаруживаются в среде, где происходит рост микобактерий [116]. Их объединение можно считать искусственным, т.к. некоторые члены этой группы являются секретируемыми белками, в то время как другие - ассоциированы с клеточной стенкой. CFP являются предметом активного изучения в связи с их способностью стимулировать механизмы иммунитета организма-хозяина [117, 118, 119]. Поскольку секретирование CFP является свойством живых микобактерий, использование живых ослабленных штаммов М. tuberculosis для вакцинации предпочтительнее тех, что получаются из убитых нагреванием клеток.
Интересно, что белки KatG (каталаза-пероксидаза) и SodA (супероксиддисмутаза), необходимые для защиты от активных форм кислорода и для выживания микобактериальной клетки во время инфекции, также были обнаружены среде культивирования М. tuberculosis. Значение такой локализации белков остаётся неясным, но предполагается, что это может обеспечивать более эффективную защиту от токсинов и свободных радикалов, синтезируемых в фагосомах клеток хозяйского организма [120]. Белки Esat6 и CF-10 принадлежат семейству Esat6. В состав этого семейства входят небольшие секретируемые белки, найденные в культуральной жидкости М. tuberculosis. Делетирование генов М. bovis, близко расположенных в геноме и кодирующих белки Esat6 и CF-10, значительно ослабляет вирулентность этого микроорганизма в модельных экспериментах на морских свинках [121]. До сих пор непонятно какой из этих двух белков (или оба) играет роль в вирулентности М. bovis на животных моделях. Гены Rv3874 и Rv3875, кодирующие соответственно CF-10 и Esat6 белки в геноме штамма М. tuberculosis H37R.V, входят в состав последовательности RD1 [17]. Всего в состав RD1 входит девять генов от Rv3971 до Rv3979 включительно [8]. Этот участок генома найден во всех вирулентных штамах М. tuberculosis и М. bovis. И, в то же время, это единственная делеция, общая для всех ослабленных штаммов М. bovis BCG [3]. Так было высказано предположение, что гены в составе данного геномного участка играют роль в возникновении вирулентности у микобактерий. Для проверки этой гипотезы было проведено две серии экспериментов. Во-первых, последовательность RD1 была делетирован в геноме штамма М. tuberculosis H37Rv. Полученный мутантный штамм имел фенотип с ослабленной вирулентностью, как штаммы М. bovis BCG [122]. Другой эксперимент заключался во встраивании участка RD1 в хромосому М. bovis BCG. Полученный штамм проявлял гораздо большую вирулентность нежели его предшественник [96], что однозначно свидетельствовало в пользу того, что гены, входящие в состав RD1 являются факторами вирулентности. На настоящий момент времени достоверно известно, что гены, кодирующие белки CF-10 и Esat6, являются факторами вирулентности М. tuberculosis, хотя их функции и механизм секреции до сих пор остаются неизвестными [119, 123, 124, 125].
Полногеномное сравнение штаммов М. tuberculosis HN878 и CDC1551, вызывающих различные клинические формы туберкулёза
Туберкулёз - хроническое инфекционное заболевание, характеризующееся поражениями органов дыхания, костей, суставов, кожи, мочеполовых и некоторых других органов. Внелёгочные формы туберкулёзного процесса сложнее для идентификации, некоторые (например, туберкулёз глаз) с трудом поддаются лечению, течение болезни в этих случаях длительное, рецидивирующее, прогноз, как правило, неблагоприятный. Не исключено, что различие между штаммами М. tuberculosis, вызывающими различные клинические формы заболевания, следует искать на молекулярно-генетическом уровне. Наличие или отсутствие определённых локусов в геноме штамма могут оказывать влияние на его метаболизм и, соответственно, на выбор пригодной для штамма среды обитания. Таким образом, анализ геномного полиморфизма нелёгочных изолятов может позволить не только выявить факторы, обуславливающие протекание болезни в той или иной форме, но также создать оптимальные средства диагностики новых случаев заболевания. Нами было проведено сравнение генома штамма М. tuberculosis HN878, способного вызывать туберкулёз с внелёгочной формой локализации, и штамма CDC1551. Целью сравнения была оценка эффективности оптимизированного метода ПДРФ вычитающей гибридизации и поиск молекулярно-генетических маркёров, характеризующих ту или иную форму протекания заболевания. Штамм HN878 принадлежит семейству W/Beijing, которое выделяется на основании одинакового сполиготипа. Штаммам этого семейства, циркулирующего на обширной территории от Азии до Северной Америки, свойственен ряд общих структурно-генетических черт. Представители семейства W/Beijing характеризуются повышенной вирулентностью, контагиозностью [50, 51], а также частым проявлением КОНТАГИОЗНОСТЬ (лат. contagiosus заразительный, заразный) — свойство инфекционных болезней передаваться от больных людей или животных здоровым восприимчивым людям (животным). множественной лекарственной устойчивости [52, 53, 54, 55]. Штамм CDC155I является высококонтагиозным и ответственен за недавнюю вспышку лёгочной формы заболевания в США [68, 69]. Последовательность его генома была полностью определена и охарактеризована [9]. В результате проведённого полногеномного сравнения методом вычитающей гибридизации нами были получены дифференциальные последовательности, присутствующие в геноме штамма HN878 и делетированные или изменённые в геноме штамма CDC1551.
Всего в нашей работе было получено 9 дифференциальных фрагментов, представляющих собой последовательности ДНК, заключённые между двумя сайтами рестрикции AIuI. Все фрагменты оказались высокогомологичными (97-99%) последовательностям генома штамма М. tuberculosis 210 и частично гомологичными геному CDC1551 (приложение 1). Штамм 210, также как и HN878, использовавшийся для сравнения в качестве трейсера, принадлежит семейству Beijing, и в настоящий момент ведётся работа по определению его полной геномной структуры. Найденные в результате сравнения отличия разделились на три принципиальные группы (рис.15). Первая группа генетических различий между геномами HN878 и CDC1551 - это новые места интеграции транспозона IS6110. В результате вычитающей гибридизации было найдено три различных фрагмента (В2, В4 и Е12), 5 -концевая часть которых была идентична концевой части транспозона IS6110, а З -концевая часть каждого фрагмента оказалась идентичной определённому гену CDC1551 (рис.15, а, б). В геноме CDC1551 в районе данных генов встраивания IS6110 не происходит. Проведенная ПЦР ортологичных локусов в геномах HN878 и CDC1551 показала, что во всех трёх случаях в геном HN878 интегрирована полноразмерная копия транспозона (праймеры для ПЦР комплементарны геномным участкам, фланкирующим места интеграции IS6110). Фрагменты В2 и Е12 образуются в результате встраивания IS6110 в участок генома штамма HN878, расположенного между генами, гомологичными МТ3269 и МТ3270, а также МТ0001 и МТ0002 соответственно (рис.15, а). Ещё один случай полиморфизма заключается во встраивании IS6110 непосредственно в последовательность гена-гомолога МТ1515, кодирущего катион-транспортирующую АТФазу, принадлежащую семейству Е1-Е2 (рис.15, б). Интересно, что одним из характеристических признаков Beijing сполиготипа является встраивание IS6110 в район точки начала репликации (А1 инсерция) [198]. Данный признак мы и обнаружили в случае фрагмента Е12. Случай встраивания транспозона между генами МТ3269 и МТ3270 до сих пор в литературе описан не был. Гены МТ3269 и МТ3270 кодируют белки с неизвестными функциями, поэтому о каких-либо функциональных последствиях интеграции говорить трудно. Хотя наиболее очевидным следствием интеграции мобильных элементов является потеря транскрипционной активности генов, в кодирующую последовательность которых происходит встраивание IS элемента, в последнее время появились данные об участии IS6110 элементов в усилении транскрипции лежащих рядом генов. В частности, Сафи с соавторами показали, что в структуре IS6110 существует промоторная последовательность, расположенная около правого TIR (terminal inverted repeat), которая повышает свою активность в условиях быстрого роста микобактерии, например при инфекции моноцитов [199]. Эти авторы показали, что в геноме штамма 210, родственного HN878, 1S6110 расположен в 3 области гена Rvl469 (его ортолог в геноме CDC1551 - ген МТ1515, описанный выше).
При этом регуляторные последовательности IS6110 существенно увеличивают транскрипцию следующего гена, Rvl468, ортологичного МТ1514 в геноме CDC1551, который кодирует белок семейства PE-PGRS. В геноме штамма HN878 нами обнаружена аналогичная инсерция, что также позволяет предположить, что и в этом геноме IS6110 в определенных условиях модулирует повышенную экспрессию расположенного рядом гена МТ1514. Аналогичную роль промотора IS6110 можно предположить и в случаях встраивания IS 6/./0 в межгенную область (фрагменты В2, Е12). Сафи с соавт. предполагают, что фенотип семейства Beijing может быть обусловлен общностью в расположении IS элементов в геноме, которые определяют общность транскрипционного паттерна этого семейства. Вторая группа дифференциальных фрагментов является результатом геномных перестроек различных повторяющихся последовательностей. Два фрагмента представляют собой участки генов семейства РРЕ. Белки этого семейства характерны только для микобактерии (см. обзор литературы) и могут представлять главный источник антигенной изменчивости патогена. Фрагмент Е1 (рис.15, в) состоит из пяти коротких повторяющихся последовательностей ДНК, идентичных вариабельному участку гена МТ1968, кодирующего белок РРЕ семейства в геноме CDC1551. Длина этого участка составляет 59 п.о., длина спейсеров между повторами - 13 п.о. Фрагмент D12 представляет собой комбинацию участков гомологии с МТ3448, МТ3458, МГ3453 и другими генами штамма М. tuberculosis CDC 1551, кодирующими белки семейства РРЕ (рис.15, г). Третий фрагмент, G6, представляет собой последовательность ДНК, идентичную участкам в составе повторов (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) в геноме CDC 1551, но содержащую небольшие мутации инсерционно-делеционной природы (рис. 15, д). Подобные различия в структуре, связанные с повторяющимися последовательностями, могли появиться в результате межгенных или внутригенных рекомбинационных событий [200]. Известно, что эти механизмы ответственны за антигенную вариабельность других бактериальных патогенов [201]. В формировании вариабельности ряда геномных локусов могут участвовать также IS транспозоны. Так, участки геномов, гомологичные последовательностям дифференциальных фрагментов G6 и Е1, содержат поблизости места интеграции IS6110 элемента. Известно, что горячие точки интеграции транспозона часто характеризуются высоким уровнем инсерционно-делеционного полиморфизма в геномах М. tuberculosis [80, 81,82,83].
Исследование полиморфизма дифференциальных локусов в популяции клинических штаммов М. tuberculosis, циркулирующих на территории Российской Федерации
Нами был предложен способ генотипирования штаммов М. tuberculosis методом геномной ПЦР следующих локусов: G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, МГ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rvl762c. Локусы А4 и МТ3489 оказались неполиморфными в изученной популяции, поэтому были исключены. Локусы Rv0073 и Rvl762c получены как дифференциальные в серии не включённых в диссертацию экспериментов. Эффективность и достоверность предложенного нами метода, названного Ш-типированием, была показана на коллекции 172 штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в центральных регионах Российской Федерации. Данная коллекция создана в лаборатории И.Г. Шемякина (ГНЦ Прикладной Микробиологии, г. Оболенск), там же проводилось IS5770-RFLP типирование, сполиготипирование и кластеризация штаммов. Согласно результатам, полученным И.Г. Шемякиным с сотр., 51 штамм из коллекции принадлежал семейству AI (сполиготип LAM), циркулирующему на территории Российской Федерации и вьщеленному недавно [204]; 46 штаммов входило в состав семейства W/Beijing; 49 штаммов представляло семейство Haarlem. Остальные представители коллекции принадлежали редко представленному сполиготипу Т, либо для них сполиготип не был идентифицирован. Результаты 1S6110-KFLP типирования, сполиготипирования, ID-типирования и последующей кластеризации штаммов представлены в приложении 4. Результаты ID-типирования. Из представленных в приложении результатов видно, что сорок четыре (96%) изолята семейства W/Beijing характеризуются наличием локусов G2, МТ1360, МТ2081, МТ2082, МТ3426, МТ3427, МТ3428 и отсутствием локусов МТ1799, МТ1802, МТ2508, Rv0073, Rv1762с, а два штамма (4%) - наличием локусов G2, ИГ 1360, МТ2081, МТ2082, МТ3427, МТ3428 и отсутствием локусов МГ1799, МТ1802, МТ2508, МТ3426, Rv0073, Rvl762c. Помимо принадлежности к сполиготипу Beijng все эти изоляты имеют IS6110 профиль, характерный для W семейства.
Тридцать девять штаммов (80%) семейства Haarlem характеризуются наличием всех двенадцати локусов МТ1360, МТ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rvl762c и G2; шесть (12%) - наличием локусов G2, МТ1360, МГ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2508, Rv0073, Rvl762c и отсутствием локусов МТ2082, МТ3426, МГ3427, МТ3428; два (4%) - наличием локусов МТ1360, МТ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3426, МТ3427, МГ3428, Rv0073, Rvl762c и отсутствием локуса G2; один (2%) штамм - наличием локусов G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, МГ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rv 1762с и отсутствием локуса МТ3426; и наконец один (2%) изолят характеризуется наличием локусов G2, МТ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2082, МТ2508,МТ3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rvl762c и отсутствием локуса МТ1360. Тридцать один штамм (61%) семейства AI/LAM характеризуется наличием МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3426, МГ3427, МТ3428, Rv0073 и отсутствием локусов G2, МТ1360, MF1799, МТ1802, Rvl762c. IS6110 профиль штаммов этого кластера имеет характерный набор ДНК фрагментов (6010,4840,4640,4510,4120, 3280, 2750, 2620, 2000, 1280 и 920 п.о). Шесть штаммов (12%) характеризуются наличием локусов МТ1360, МГ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3426, Rv0073 и отсутствием локусов G2, МТ1799, МТ1802, МТ3427, МТ3428, Rvl762c; четыре изолята (8%) - наличием МГ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МГ3426, MT3427, MT3428, Rv0073, Rvl762c и отсутствием G2, MT1360; три изолята (6%) -наличием МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3426, МГ3427, МТ3428, Rv0073, Rvl762c и отсутствием G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802; три штамма (6%) - наличием G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, МТ2508, МТ3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073 и отсутствием МТ2081, МТ2082, Rv 1762с; два штамма (4%) - наличием локусов МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3426, Rv0073, Rv 1762с и отсутствием G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, МТ3427, МТ3428; один штамм (2%) - наличием локусов G2, МТ1360, МТ2081, МТ2082, МГ2508, МТ3426, МТ3428, Rv0073 и отсутствием МТ1799, МТ1802, МТ3427, Rv 1762с; и один (2%) - наличием G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2508, Rv0073, Rvl762c и отсутствием МТ2082, МТ3426, МТ3427, МТ3428. Профили амплификации, полученные в результате ID-типирования популяции, позволяют проследить за полиморфизмом отдельно взятых генов - потенциальных факторов вирулентности, а также провести предварительную кластеризацию популяции по генотипическим характеристикам. Результат ПЦР амплификации локуса МТ2508, обозначенный как отрицательный, представлял собой делецию 212 п.о. в последовательности данного гена. Положительным результатом считалось наличие в геноме неповреждённой копии МТ2508. Результаты ID-типирования популяции показали, что делеция в гене МТ2508 характерна исключительно для представителей семейства W/Beijing, все остальные штаммы имели неповреждённую копию гена. Поскольку делеция в гене МТ2508 не связана с мобильными элементами или повторяющимися последовательностями генома и строго характеристична для семейства W/Beijing, она является UEP (unique event polymorphism), описанной нами впервые. В нескольких случаях, рассматривавшихся как отрицательный результат ПЦР, амплифицировался фрагмент, отличающейся от ожидаемой длины.
Так, в случае ПЦР геномных ДНК штаммов М. tuberculosis 105, 123, 136, 277, 492, 564, 571, 713 и 724 с праймерами, дизайнированными на локус МТ1799 амплифицировался продукт длиной около 1.5 Kb, в отличии от ожидаемой длины 197 п.о. Определение первичной структуры ПЦР продукта, образующегося на матрице ДНК штамма М. tuberculosis 105, показало, что в ген plcD происходит встраивание транспозона \S6110 (координата встраивания: 1978936 по геному CDC1551). При этом не происходит делетирования 5 -концевой части гена plcD, как в геноме штамма М. tuberculosis H37Rv. Сайт интеграции IS6110 в геноме штамма 105 расположен далее сайта интеграции транспозона в геном H37Rv на 220 нуклеотидов. Точка интеграции транспозона соответствует положению 1068 нуклеотида от 3 -конца интактного гена, в отличии от генома H37Rv, где точка интеграции расположена на расстоянии в 848 нуклеотидов от З -конца гена. Точное положение сайта интеграции 1S6110 определялось только для штамма М. tuberculosis 105. Тем не менее, идентичная картина ПЦР амплификации данного локуса на восьми других изолятах говорит о том, что транспозон интегрировался в участок генома, расположенный между местами отжига праймеров, то есть между 1978843 и 1979006 нуклеотидами генома М. tuberculosis CDC1551, и это событие не сопровождалось делецией прилегающей области генома. Район генаplcD , также как и гена кутиназы (МГ1805 в геноме CDC1551 и Rvl758 в геноме H37Rv), расположенного неподалёку, является горячей точкой интеграции 1S6JJ0 [81, 82]. Гомологичная рекомбинация между транспозонами может приводить к потере протяжённого участка генома размером до 20 Kb [83]. Один из таких вариантов делеций описан в литературе, как RvD2 [87] В нашей коллекции изолятов 92 штамма не содержат последовательности RvD2, что подтверждается отсутствием продукта ПЦР амплификации с праймерами, комплементарными локусам, фланкирующим участок делеций. Из них 46 штаммов принадлежат семейству W/Beijing, 43 - семейству AI/LAM, два - ТІ, которое оказалось генетически близким к AI/LAM, для одного штамма сполиготип не идентифицирован. 69 штаммов в коллекции содержат неповреждённый участок RvD2 в геноме, из них 49 -принадлежат семейству Haarlem, 8 - AI/LAM, 3 штамма -Ти для девяти сполиготип не удалось определить. Помимо этих двух наиболее распространённых вариантов, в коллекции российских клинических штаммов М. tuberculosis были обнаружены другие варианты генетической структуры этого района. Девять штаммов, о которых уже говорилось выше, содежат транспозон, интегрированный в ген фосфолипазы, таким образом их геномы содержат последовательность RvD2, нарушенную встраиванием 1S6110. Шесть штаммов из девяти принадлежат сполиготипу ТІ и для трёх он не идентифицирован.
