Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 3
1.1 Экспрессия генов в эукариотической клетке 3
1.2 Подходы к поиску дифференциально экспрессирующихся генов и определению характерных профилей экспрессии 6
1.3 Подходы к поиску редких генов и крупномасштабные проекты по секвенированию 13
1.4 Подходы к созданию нормализованных библиотек 15
1.5 Описание кинетики процесса реассоциации нуклеиновых кислот в растворе 17
1.6 Способы отделения одноцепочечной фракции нормализованных молекул кднк 21
Глава 2. Результаты и обсуждение 32
2.1 ДСН 34
2.2 Проверка пригодности дсн для изоляции оц- днк из смеси нуклеиновых кислот 34
2.3 Создание нормализованных библиотек кднк 40
2.4 Модельный эксперимент-создание нормализованной библиотеки кднк из скелетной мышцы человека 50
2.5 Проверка воспроизводимости метода. Создание нормализованных библиотек из кднк различных тканей человека 55
2.6 Создание нормализованной библиотеки кднк из нейронов aplysia californica 57
2.7 Создание нормализованных библиотек для направленного клонирования 60
2.8 Направленное удаление определенных последовательностей 63
2.9 Заключение 68
Глава 3. Экспериментальная часть 69
3.1 Материалы и оборудование 69
3.2 Методы исследования 73
Выводы 82
Список сокращений 83
Список литературы 84
- Подходы к поиску дифференциально экспрессирующихся генов и определению характерных профилей экспрессии
- Описание кинетики процесса реассоциации нуклеиновых кислот в растворе
- Модельный эксперимент-создание нормализованной библиотеки кднк из скелетной мышцы человека
- Создание нормализованных библиотек для направленного клонирования
Введение к работе
Одним из самых значительных достижений науки XX века стала расшифровка генома человека, и научное сообщество оказалось перед лицом новых глобальных проектов. В настоящее время значительные силы тратятся на секвенирование геномов животных, растений и микроорганизмов. Однако создание каталога генов и карты их расположения на хромосомах не раскрывает принципов функционирования генома. Даже вопрос о количестве генов человека до сих пор остается открытым.
Среди основных направлений современных масштабных исследований функционирования генома можно назвать проекты по выявлению всех экспрессирующихся в организме последовательностей (EST, от английского expressed sequence tag); исследования профилей экспрессии генов и проекты, посвященные экспрессионному клонированию, когда в ходе функционального скрининга экспрессируемых библиотек кДНК идентифицируют гены, отвественные за определенный клеточный фенотип (в частности гены-мишени для лекарственных препаратов).
Все указанные типы проектов сталкиваются со значительными трудностями, связанными с гетерогенностью популяций мРНК, экспрессирующихся в клетке и большими различиями в уровне представленности различных типов мРНК. Эффективным решением проблем, связанных с необходимостью анализа чрезвычайно большого количества клонов для исчерпывающего изучения библиотеки является нормализация библиотеки кДНК (выравнивание уровня представленности различных генов в библиотеке).
Несмотря на то, что за последние 15 лет был разработан целый ряд методов создания нормализованных библиотек кДНК, все они имеют существенные недостатки. Основная цель данной работы состояла в разработке нового метода нормализации библиотек кДНК, который лишен недостатков уже существующих методов, сочетает в себе простоту и эффективность и может быть применен при решении самых разнообразных задач.
Подходы к поиску дифференциально экспрессирующихся генов и определению характерных профилей экспрессии
В эукариотической клетке мРНК составляет 1-5% от всей клеточной РНК. Количество типов траискриптов, одновременно присутствующих в клетке, в зависимости от типа клетки и вида организма может быть от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч.
По различным оценкам в геноме человека закодировано от 28-35 [Weissenbach, 2000; Ewing and Green, 2000] до 50 [Fields et al, 1994], 90 [Antequera and Bird, 1993], a по некоторым данным и до 120-140 тысяч генов. Столь большой разброс в оценках связан с тем, что для определения числа генов используются различные методы (такие как оценка на основе секвенирования EST, предсказание структуры генов на основе геномной нуклеотидной последовательности), а также различные алгоритмы подсчета на основе одинаковых исходных данных.
В типичной эукариотической клетке экспрессируется 10-20 мажорных генов (несколько тысяч копий мРНК на клетку), которые составляют не менее 20 % от всей клеточной мРНК, несколько сотен средних генов (40%-60% мРНК) и несколько тысяч минорных генов (менее 10 копий мРНК на клетку, 20-40% от всей клеточной мРНК) [Carninci et al, 2000].
Некоторые гены экспрессируются во всех типах клеток организма, другие являются специфичными для определенного типа клеток. Так, например, в работе Hsiao и коллег [Hsiao et al, 2001] было показано, что 6.4 % из 7070 проанализированных уникальных последовательностей присутствуют во всех 19 исследованных тканях человека.
Гены, экспрессия которых постоянно детектируется во всех клетках организма, называют генами поддержания клеточного гомеостаза (ГПКГ) [Watson et al, 1965]. Эти гены кодируют белки, обеспечивающие основные функции клетки, такие как: транскрипция, трансляция, поддержание структуры клетки и ее подвижность, клеточный метаболизм и ряд других функций. Функциональное распределение известных ГПКГ человека показано на Рис. 1-1.
Как правило, экспрессия ГПКГ начинается на ранних стадиях эмбриогенеза и продолжается в течение всей жизни клетки [Warrington et al, 2000], однако уровень их экспрессии может значительно варьировать как на разных стадиях развития так и у разных индивидов [Hsiao et al., 2001]. Впрочем, было показано, что для ряда ГПКГ уровень экспрессии варьирует очень слабо [Warrington et al., 2000; Hsiao et al., 2001]. Обнаружение таких генов чрезвычайно важно, так как позволяет сравнивать уровень экспрессии других генов в различных образцах, используя конститутивно экспрессирующиеся гены в качестве внутреннего контроля для стандартизации образцов.
Большую часть клеточной мРНК составляют транскрипты, которые кодируют белки, необходимые для выполнения функций, характерных для данного типа клеток. Уровень экспрессии генов может существенно варьировать в зависимости от условий (например, в зависимости от стадии развития, условий окружающей среды, наличия различных патофизиологических процессов и т.п.) Часть транскриптов специфична для определенного типа клеток, другие детектируются во многих типах клеток, но лишь в некоторых присутствуют постоянно и/или имеют высокий уровень представленности. Экспрессия целого ряда генов может быть обнаружена только на определенных стадиях эмбриогенеза и не встречается во взрослых тканях; тогда как экспрессия других генов специфична только для взрослого организма.
Биологические системы очень сложны и уровень экспрессии гена определяется не только на уровне транскрипции. С точки зрения функции наиболее важным является количество и активность соответствующего белка. Посттранскрипционная модификация, трансляция, посттрансляционная модификация, транспорт - все эти процессы не могут идти со 100% эффективностью [Ayoubi, 1996; Cho et ah, 1998; Hampsey, 1998], но недостаточную эффективность какого-либо из этапов экспрессии гена необходимо компенсировать. Предполагается, что именно с этим связан более высокий средний уровень экспрессии ГПКГ по сравнению со средним уровнем экспрессии генов в клетке. Для большей части транскриптов характерен низкий уровень представленности (менее пяти копий на клетку), в то время как для ГПКГ характерен средний уровень представленности (около 10-50 копий на клетку). Конечно, ряд генов строго регулируется на уровне транскрипции, однако в случае ГПКГ, по-видимому, нет необходимости в столь строгой регуляции количества транскриптов. При наличии избыточного пула транскриптов ГПКГ регуляция экспрессии может осуществляться на уровне трансляции, за счет чего обеспечивается быстрый ответ на изменяющиеся потребности в том или ином белке.
Впрочем, до сих пор возникает вопрос: какие различия в уровне экспрессии гена можно считать биологически значимыми? Для большинства генов, по-видимому, разница в уровнях экспрессии в 3-4 раза не имеет особого значения. Однако для ряда генов даже небольшие изменения уровня экспрессии играют существенную роль в клетке. В первую очередь это относится к генам, кодирующим белки, которые могут связываться с рецепторами с различной афинностыо в зависимости от концентрации, а также к генам, кодирующим белки регуляторных каскадов [Warrington et ah, 2000]. К сожалению, точного ответа на вопрос о значимости небольшой разницы в уровнях экспрессии (как на уровне транскрипции, так и в целом) на данный момент не существует, что, в первую очередь, связано с недостаточной чувствительностью и точностью методов оценки количества определенных мРНК в клетке, существующих на данный момент.
Очевидно, что именно те гены, уровень экспрессии которых изменяется в ходе различных процессов (дифференцировка, различные патофизиологические изменения) привлекают наибольшее внимание исследователей, поскольку изучение дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) может привести к пониманию молекулярных механизмов этих процессов и именно эти гены являются потенциальными мишенями для генной терапии.
Технические подходы, предназначенные для сравнения выделенных препаратов РНК с целью поиска дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ), несмотря на чрезвычайное многообразие, имеют одну основу: метод дифференциальной гибридизации или дифференциального скрининга [Rebagliati et al., 1985]. Суть метода состоит в проверке уровня представленности случайно выбранных последовательностей (клонов) кДНК в сравниваемых образцах РНК при помощи гибридизации с целью выявления последовательностей, присутствующих в одном из сравниваемых образцов в гораздо большей концентрации, чем в другом. Очевидным неудобством подобного анализа неупрощенных популяций РНК является высокая трудоемкость, так как популяция транскриптов ДЭГ редко составляет более 1% от всей РНК. Таким образом, поиск единственного ДЭГ мог потребовать сотен раундов гибридизации. Для повышения эффективности дифференциального скрининга был предложен целый ряд методов, таких как: дифференциальный дисплей мРНК, вычитающая гибридизация, серийный анализ экспрессии генов (serial analysis of gene expression, SAGE) и гибридизация с иммобилизованными на твердом носителе олигонуклеотидами и фрагментами кДНК (различные виды ДНК-эрреев и микроэрреев).
Описание кинетики процесса реассоциации нуклеиновых кислот в растворе
Концентрации ионов Na+ сильно влияет на скорость реакции, которая повышается при увеличении концентрации до 1,2М NaCl. Но при дальнейшем увеличении концентрации соли скорость реакции становится постоянной. Константаскорости реакции R при концентрации соли 1,2М NaCl оценивается равной «SxK M V1 [Britten and Davidson, 1985].
Влияние длины реассоциирующих фрагментов на константу скорости реакции при условии, что комплементарные фрагменты имеют одинаковую длину, описывается следующим соотношением: k(Ll)= k(L2) х (L1/L2) , где L1 и L2 - длины фрагментов, то есть скорость пропорционально увеличивается при увеличении длины реассоциирующих фрагментов [Britten and Davidson, 1985]. Сложность ДНК (РНК)
Для простых геномов (вирусных и бактериальных), где нет участков содержащих повторяющиеся последовательности (LINE, SINE и т.п.), скорость реассоциации описывается приведенным выше уравнением и обратно пропорциональна сложности (т.е. размеру генома). Для сложных геномов (геномы эукариот) с большим числом повторов в последовательности ДНК кинетика реассоциации значительно более сложная, мультикомпонентная [Britten and Davidson, 1985]. После фрагментации ДНК, содержащей повторы, соответствующие сегменты будут присутствовать в большей концентрации, чем сегменты с уникальными последовательностями. Поэтому ренатурация фракции повторов (например, поли (A U) последовательности и сателлитной ДНК) будет идти значительно быстрее, чем ренатурация других ДНК [Britten and Kohne, 1968]. Комплементарные цепи фрагмента ДНК, содержащегося в таком геноме в количестве единичной копии, реассоциируют со скоростью, обратнопропорциональной размеру генома [Britten and Kohne, 1968]. Таким образом, изучение кинетики ренатурации позволяет получить информацию о средней повторяемости последовательности. Для упрощения интерпретации экспериментов по реассоциации Watmur и Davidson предложили ввести параметр кинетической сложности нуклеотидной последовательности (Хс), обозначая его числом оснований в несодержащей повторов последовательности [Young and Anderson, 1985].
Изучение кинетики мРНК-кДНК гибридизации показало, что существует несколько классов представленности клеточной мРНК, различающихся по сложности [Galau et ah, \911]. Наибольшей сложностью (1,3x107 нуклеотидов) обладает класс минорных транскриптов. Скорость реассоциации молекул мРНК этого класса с кДНК значительно ниже, чем скорость реассоциации более представленных транскриптов. Класс мажорных транскриптов в исследованном образце содержал лишь 12 различных последовательностей в количестве около 7200 копий каждого транскрипта на клетку и сложность этого класса транскриптов 2,5x10 нуклеотидов. Молекулы этого класса реассоциируют с кДНК быстрее остальных. Таким образом, скорость реакции гибридизации мРНК с кДНК обратно пропорциональна сложности реассоциирующей фракции; и для реассоциации молекул соответствующих минорным транскриптам нужна более исчерпывающая гибридизация, т.е. более высокие значения Cot. Температура инкубации
Опытным путем было установлено, что скорость ренатурации максимальна при температуре, лежащей приблизительно на 25С ниже температуры плавления (Тт) дуплекса [Britten and Kohne, 1968; Young and Anderson, 1985]. Оптимальная температура инкубации при гибридизации зависит от GC состава реассоциирующих цепей, длины фрагментов L, концентрации Na+. Обычно в ДНК-ДНК гибридизации в солевых водных растворах используют температуру инкубации 68 - 70С. РНК-ДНК гибридизация
Гибридизация мРНК с комплементарной цепью ДНК в обычных солевых условиях следует несколько другим закономерностям, вероятно из-за большого числа вторичных структур в молекуле РНК. Скорость РНК-ДНК гибридизации в присутствии избытка мРНК растет при увеличении концентрации соли в водных растворах не так быстро, как скорость ДНК-ДНК реассоциации [Young and Anderson, 1985].
Специальные условия, увеличивающие скорость реакции
Фенол-ускоренная гибридизация. Kohne и соавторы обнаружили резкое увеличение скорости реассоциации ДНК при инкубации в двухфазной системе -эмульсии фенола [Kohne et al, 1977]. При низких концентрациях ДНК (4 мкг/мл) скорость реассоциации увеличивается более чем в 10000 раз, при больших концентрациях (1,6 мг/мл) увеличение скорости не превышало 35 раз. Скорость РНК-ДНК гибридизации в эмульсии фенола также возрастает (в 100 раз). Метод фенол-ускоренной гибридизации (PERT) нашел впоследствии применение в вычитающей гибридизации как геномов, так и кДНК [Travis and Sutcliffe, 1988; Kunkel et al, 1985]. Скорость реассоциации двух комплементарных молекул в растворе ограничена скоростью их диффузии. Возможно, что быстрая скорость реассоциации в PERT возникает за счет создания локальной высокой концентрации одноцепочечной ДНК и ее агрегации в двухфазной системе. Подобным образом можно объяснить наблюдаемое увеличение скорости реакции при использовании инертных полимеров с высокой молекулярной массой таких как декстран сульфат и полиэтилеигликоль [Britten and Kohne, 1968; Young and Anderson, 1985]. Использование катионных детергентов
Было обнаружено, что скорость ренатурации комплементарных цепей кДНК значительно возрастает при добавлении некоторых катионных детергентов, например цетилтриметиламмоний бромида (СТАВ) [Pontius and Berg, 1991]. Ренатурация ДНК в присутствие СТАВ может происходить при температурах выше температуры плавления дуплекса ДНК, что свидетельствует о влиянии этого детергента на стабильность ДНК спирали. Влияние СТАВ проявляется в более эффективном увеличении скорости гибридизации коротких фрагментов. По мере увеличения длины фрагментов относительное увеличение скорости падает от 300 - кратного (для 124 -нуклеотидных молекул) до 20 - кратного (для 1800 - нуклеотидных молекул) относительно скорости реакции в обычных солевых условиях.
Модельный эксперимент-создание нормализованной библиотеки кднк из скелетной мышцы человека
При создании образцов нормализованной кДНК, обогащенных полноразмерными последовательностями транскриптов, важно не допустить частичной деградации кДНК в ходе гибридизации. Известно, что длительная инкубация кДНК при высокой температуре (68-70С) приводит к потере длинных молекул ДНК. Поэтому гибридизацию образцов полноразмерной кДНК часто осуществляют в присутствии формамида, что позволяет проводить денатурацию и гибридизацию ДНК при более низких температурах [Carninci et ah, 2000]. Однако мы обнаружили, что ДСН инактивируется в присутствии формамида (данные не приведены). Таким образом, этот подход оказался неприменим в нашем случае.
Для увеличения скорости гибридизации (и, следовательно, уменьшения времени гибридизации) возможно также применение ряда методик, таких как фенол-ускоренная гибридизация (PERT) или гибридизация в присутствии ионных детергентов. Однако при использовании энзиматического разделения фракций применение этих модификаций требует дополнительного переосаждения ДНК после гибридизации, что усложняет метод. В связи с этим мы решили оказаться от применения подобных методик гибридизации.
Мы использовали протокол гибридизации нуклеиновых кислот, хорошо зарекомендовавший себя в методе вычитающей гибридизации SSH [Diatchenko et ah, 1996; Gurskaya et ah, 1996] и основные усилия направили на выявления оптимальных времени и температуры гибридизации, при которых сохраняется специфичность гибридизации и не происходит деградации длинных молекул кДНК. Проверка активности ДСН в присутствии используемого в этом протоколе буфера для гибридизации показала, что несмотря на существенное снижение активности фермента удаление дц- фракции может проводиться непосредственно после гибридизации (без переосаждения ДНК).
Время гибридизации является одним из важнейших параметров при нормализации полноразмерных библиотек кДНК. Недостаточное время гибридизации снижает эффективность нормализации, в то время как слишком продолжительная инкубация ДНК при высоких температурах приводит к потере длинных молекул кДНК, обусловленной деградацией ДНК.
Для подбора максимально допустимого времени гибридизации амплифицированную кДНК денатурировали при температуре 97 в течение 1 минуты и оставляли ренатурировать в присутствии буфера для гибридизации на 1, 2, 4, 6, 8 и 12 часов при температуре 68. По окончании гибридизации, образцы кДНК реамплифицировали и сравнивали длину продуктов ПЦР с контрольным образцом, не подвергавшимся гибридизации. Было показано, что гибридизация в течение 2-6 часов не приводит к уменьшению среднего размера молекул в библиотеке кДНК. Болеее длительная гибридизация приводит к уменьшению представленности в образце длинных молекул кДНК по сравнению с исходной библиотекой.
Из теоретических расчетов основанных на кинетике гибридизации известно, что гибридизация 99% фракции высокопредставленных и 90 % среднепредставленных последовательностей (при используемой концентрации ДНК) происходит за 4-5 часов гибридизации [Young and Anderson, 1985]. Таким образом, при эффективном удалении двуцепочечной фракции в нормализованной оц- фракции кДНК представленность мажорных генов будет снижена примерно в 100 раз (в случае особо высокопредставленных последовательностей возможно и большее снижение представленности), а представленность средних генов - в 10 раз. Теоретически этого должно быть достаточно для эффективной нормализации образца кДНК.
При удалении двуцепочечной кДНК необходимо снизить вероятность образования вторичных структур одноцепочечными молекулами целевой фракции, поскольку внутримолекулярные участки дц- ДНК могут быть гидролизованы при обработке нуклеазой, что приведет к потере части целевой фракции. В связи с этим мы решили проводить обработку ДСН при температуре 70 (т.е. при той же температуре, при которой проводится гибридизация ДНК). Несмотря на то, что эта температура несколько выше температурного оптимума фермента, потеря активности ДСН незначительна, и удаление дц-кДНК может проводиться в таких условиях.
Подбор оптимальных условий удаления дц- фракции кДНК осуществлялся следующим образом: амплифицированную кДНК подвергали денатурации и оставляли ренатурировать в буфере для гибридизации (1 час, 70С). Затем к образцу добавляли равный объем предварительно прогретого 2х буфера для обработки ДСН и различные количества ДСН (0.1 - 5 ед. Куница). Обработку проводили в течение 5-30 минут. После обработки образец амплифицировали и анализировали при помощи электрофореза в агарозном геле.
Основными критериями отбора оптимальных условий обработки ДСН были: 1) сохранение в подвергавшемся обработке образце средней длины молекул кДНК аналогичной исходному образцу и 2) исчезновение в обработанном образце полос, соответствующих мажорным транскриптам (равномерность шмера).
При недостаточной обработке ДСН (недостаток фермента или времени обработки) наблюдалось сохранение (полностью или частично) исходного паттерна полос, соответствующих мажорным транскриптам. При избыточной обработке наблюдалось существенное уменьшение среднего размера фрагментов кДНК в библиотеке и уменьшение максимальной длины фрагментов. Характерные примеры амплификации образцов кДНК подвергнутых недостаточной, оптимальной и избыточной обработке при помощи ДСН представлены на Рис. 2-7. Исходя из результатов анализа библиотек кДНК, подвергавшихся различным режимам обработки ДСН, было выбрано оптимальное количество и время обработки нуклеазой: 0.5-2 единиц Куница ДСН на реакцию, продолжительность обработки 20-25 минут.
Инактивация фермента может осуществляться путем прогревания образца при 97С в течение 7 минут, однако это может привести к деградации части длинных молекул кДНК. В связи с этим мы останавливали реакцию добавлением ЭДТА до концентрации 5 мМ. Такое количество ЭДТА приводит к полной инактивации ДСН (поскольку ДСН проявляет активность только в присутствии ионов Mg2+), и при этом не мешает последующей амплификации образца при помощи ПЦР.
На основе полученных результатов были выбраны такие условия проведения гибридизации и обработки нуклеазой (см. Материалы и Методы), при которых не наблюдалось уменьшения средней длины фрагментов кДНК в библиотеке. Одновременно мы разработали альтернативную схему создания нормализованной библиотеки кДНК, основанную на нормализации первой цепи кДНК.
Создание нормализованных библиотек для направленного клонирования
В контрольном эксперименте было отсеквенировано 1150 случайно выбранных клонов из ненормализованной библиотеки кДНК A. californica (CNS_MCC). После удаления сиквенсов не содержащих вставок и недостоверных результатов осталось 1121 клонов представляющих 745 неперекрывающихся нуклеотидных последовательностей. Анализ полученных сиквенсов из ненормализованной библиотеки выявил несколько типов кДНК представленых большим числом клонов в библиотеке (мажорные последовательности). Так, среди клонов, для которых была определена нуклеотидная последовательность, 101 клон соответствовал 16S митохондриальной рибосомальной РНК, 108 клонов соответствовали! 8S рибосомальной РНК и 31 клон представлял последовательности относящиеся к 28 S рибосомальной РНК.
Из нормализованной библиотеки (CNS_MCC_N) было отсеквенировано 4437 клонов. После удаления сиквенсов не содержащих вставок и недостоверных результатов осталось 4309 клонов представляющих 3775 неперекрывающихся нуклеотидных последовательностей. Среди этих нуклеотидных последовательностей 3326 встречались только один раз, в то время как 449 были представлены более чем одним клоном в полученной выборке.
Для подтверждения эффективности нормализации, мы проанализировали представленность мажорных генов (наиболее часто встречающихся в данной библиотеке кДНК исходя из результатов секвенирования клонов из ненормализованной библиотеки) в нормализованой библиотеке кДНК. Частота встречаемости этих последовательностей представлена в таблице 2-3.
Одним из способов оценки качества нормализации библиотеки кДНК на основе результатов секвенирования нормализованной библиотеки может быть оценка ее сложности с тем допущением, что библиотека идеально нормализована. Для этого необходимо произвести анализ частоты встречаемости отдельных клонов и найти наиболее соответствующее распределение по Пуассону. Наши результаты наилучшим образом соответствовали распределению по Пуассону со значением ц равным 0.27. Таким образом, в библиотеке из метацеребральных ганглиев аплизии должно быть около 16 000 различных генов. Это число соответствует ожидаемому числу различных типов мРНК в ЦНС моллюска. Полученные данные свидетельствую об эффективности разработанного протокола создания нормализованных библиотек кДНК. Таблица 2-3. Относительная представленность мажорных генов в нормализованной и ненормализованной библиотеках из гигантских метацеребральных клеток из ЦНС Aplysia californica.
Нормализованные библиотеки кДНК могут быть использованы для крупномасштабных функциональных скринингов, а также для проектов по секвенированию 5 или 3 фрагментов генов. В этом случае предпочтительной является библиотека с определенной ориентацией вставки кДНК - так называемая направленная библиотека. Это упрощает экспрессию клонированных фрагментов, снижает затраты на анализ библиотеки. Мы разработали модификацию метода ДСН нормализации, позволяющую создавать нормализованные библиотеки кДНК, пригодные для направленного клонирования. В основе метода лежит протокол, разработанный нами для нормализации амплифицированных библиотек кДНК. Отличие заключается в том, что на концы молекулы кДНК вводятся модифицированные адаптеры. Их внешняя часть одинаковая (содержит ИКП, как и в случае протокола НАК, что необходимо для применения методики регулирования средней длины продукта ПЦР), а внутренняя часть содержит различающиеся сайты для эндонуклеаз рестрикции, необходимые для осуществления направленного клонирования в соответствующий вектор.
Введение в структуру адаптера рестриктных сайтов может производится как в ходе синтеза первой цепи (в этом случае используются модифицироваиые олигонуклеотиды для синтеза первой цепи), так и при помощи ПЦР (применимо для библиотек, полученных любым стандартным способом).
Основной проблемой, связанной с введением длинных адаптеров оказывается возможное уменьшение сложности нормализованной библиотеки за счет потерь, связанных с гибридизацией адаптерных последовательностей и существенным уменьшением одноцепочечной фракции (двухцепочечные участки адаптера удаляются нуклеазой, в связи с чем молекулы не могут быть амплифицированы в ходе ПЦР).
Для уменьшения потерь, связанных с деградацией адаптерных последовательностей, мы попробовали использовать термостабильный белок, связывающий одноцепочечную ДНК (single strand binding protein, SSB) [Dabrowski et al, 2002]. Этот белок связывает одноцепочечную ДНК, и, по-видимому, способствует денатурации участков дц-ДНК небольшой протяженности. Размер сайта связывания белка соотвествует 30-35 нуклеотидам.
Для проверки влияния SSB на качество нормализованной библиотеки были созданы нормализованные библиотеки кДНК плаценты человека для направленного клонирования: 1) в соответствии со стандартным протоколом для нормализации амплифицированной кДНК (контрольная библиотека) и 2) с добавлением SSB (до концентрации 2 мкМ в реакционной смеси) перед обработкой ДСН. Полученные библиотеки сравнивались с исходной ненормализованной библиотекой кДНК и между собой.
Для амплификации библиотеки после обработки ДСН полученной по протоколу с использованием SSB (первый раунд ПЦР-амплификации) требуется меньшее количество циклов, чем для амплификации библиотеки, созданной с использованием стандартного протокола (16 и 20 циклов ПЦР соответственно). Исходя из этих результатов, можно предположить, что сложность библиотеки созданной с использованием SSB выше, чем сложность библиотеки, приготовленной в соответствии со стандартным протоколом НАК. При анализе при помощи электрофореза в агарозном геле различий в среднем размере фрагментов кДНК и характере шмера не наблюдалось (Рис. 2-14).
