Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ В настоящее время известно множество типов нуклеаз - от высокоспеци-фичиых эндонуклеаз рестрикции, атакующих строго определенные последоватетыюсти ДНК, до ДНК, РНК-неспецифичных экзо- эндо- нуклеаз, гидролизующих не только нуклеиновые кислоты, но к нуклеозид-З'-моно-фосфаты Некоторые из описанных нуклеаз обладают уникальной специфичностью и имеют практическое значение дтя методов молекулярного клонирования, изучения ДНК-белковых взаимодействий, определения структуры нуклеиновых кислот и других
Ранее в нашей лаборатории была выдетена и охарактеризована нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба, впоследствии названная дуплекс-специфической нуклеазой (ДСН) Она гидролизует только двуцепочечную ДНК или цепь ДНК в ДНК-РНК гибридах Для осуществления гидролиза ей необходимо минимум 10 идеально комплиментарных пар оснований Кроме того, ДСН обладает высокой стабильностью Эти свойства позволили разработать несколько молекулярно-биологических методик на основе ДСН, такие как нормализация библиотек полноразмерных кДНК и детекция точечных нуклеотидных замен в геноме Был клонирован ген этого фермента Оказалось, что его аминокислотная постедовательность гомологична ДНК, РНК - неспецифическим эндонуклеазам - ферментам, гидролизующим, как ДНК, так и РНК, как дву-, так и одноцепочечную Поэтому изучение структурно-функциональной организации ДСН является очень интересной научной задачей
ЦЕЛЬ РАБОТЫ Целью данной работы было изучение структурно-функциональной организации дуплекс-специфической нуклеазы камчатского краба
СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, а также выводов и списка литературы Работа изложена на 122 страницах машинописного текста и содержит 44 иллюстрации, 18 таблиц и 135 ссылок на литературные источники
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ Данная работа посвящена изучению рекомбинантной ДСН Мы разработали метод получения активного рекомбинантного фермента, который необходим для исследования структурно-функциональных связей в белке Для аккуратного сравнения ДСН с другими ДНК, РНК - неспецифическими эндонуклеазами мы клонировали несколько нуклеаз из представителей класса Ракообразных Филогенетический анализ выявил две эволюционно различающихся группы нуклеаз - ДСН - подобные и Sm -
подобные («классические») Множественное выравнивание аминокислотных
последовательностей этих белков показало наличие существенных структурных различий представителей упомянутых групп Так же мы создали ряд мутантних вариантов ДСН, содержащих как точечные замены, так и лишенных определенных концевых участков Анализ свойств этих мутантов показал, что «дополнительные» (по сравнению с нуклеазои Serratia marcescens) участки ДСН обеспечивают ее необычные свойства, в том числе субстратную специфичность Исходя из этих результатов, мы выделили новое семейство ферментов -дуплекс-специфические нуклеазы Кроме того, рекомбинантная ДСН была успешно применена в ранее разработанной методике нормализации библиотек полноразмерных кДНК, а термолабильный вариант ДСН был успешно использован для удаления примесей ДНК из РНК проб перед синтезом кДНК
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные материалы диссертации были доложены на следующих международных конференциях Международная конференция молодых ученых «Ломоносов 2007» (Москва, 2007), 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007), 12-ый Международный биологический научный конгресс (Kuala Lumpur, Malaya, 2007)
ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 4 статьи
