Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1.Технология фагового дисплея 11
2. Структура и биология нитчатого фага 14
3. Пептидные библиотеки 16
4. Дисплей пептидов и белков в составе фаговых белков рШ и pVIII 17
5. Минорные фаговые белки pVI, pVII и pIX 19
6. Модификация фага М13 для дисплея 19
7. Фаговые библиотеки "несвободной" структуры 20
8. Области применения фагового дисплея 21
9. Ограничения дисплея, основанного на нитчатом фаге 33
10. Система литических бактериофагов 34
11. Бактериофаг Т4 35
12. Бактериофаг Т7 36
13. Бактериофаг лямбда 36
14. Дисплей на основе белка gpV 38
15. Дисплей на основе белка gpD 39
16. Новый дизайн векторов для библиотек кДНК 41
17. Применение фагового дисплея, основанного на бактериофаге лямбда 42
18. Заключение 50
Материалы и методы 51
Результаты 80
1. Получение жизнеспособных вариантов фага М13, экспонирующих на своей оверхности чужеродные пептиды в составе основного белка оболочки pVIII 80
2. Новая концепция для разработки теста на наличие в сыворотке крови антител ротив вируса гепатита С 103
3. Идентификация опухолевых антигенов путем скрининга библиотек кДНК, спонированных на поверхности фага лямбда, с помощью сывороток пациентов 117
4. Новые векторы для дисплея рекомбинантных антител на основе нитчатого фага 138
Обсуждение 165
- Пептидные библиотеки
- Ограничения дисплея, основанного на нитчатом фаге
- Получение жизнеспособных вариантов фага М13, экспонирующих на своей оверхности чужеродные пептиды в составе основного белка оболочки pVIII
- Идентификация опухолевых антигенов путем скрининга библиотек кДНК, спонированных на поверхности фага лямбда, с помощью сывороток пациентов
Введение к работе
Актуальность темы
Нитчатый бактериофаг М13 и умеренный литический фаг лямбда сыграли существенігую роль в становлении и развитии методологии рекомбинантной ДНК. Широкое применение бактериофага М13 в экспериментальной практике молекулярно-биологических исследований (секвенирование ДНК, получение меченых проб для гибридизации, сайт-локализованный мутагенез), а также центральная роль бактериофага лямбда для развития современной концепции регуляции генов и разработка на его основе векторных систем, используемых для построения библиотек природных репертуаров (геномная ДНК, кДНК, белки), связаны с небольшими размерами фаговых геномов и детальным знанием биологии этих бактериофагов. За последние 15 лет интерес к нитчатым бактериофагам особенно вырос в связи с развитием одного из направлений генной инженерии, получившего название "фаговый дисплей". Эта технология основана на встраивании чужеродных нуклеотидных последовательностей в один из генов, кодирующих оболочечные белки бактериофага. При этом производится гетерогенная смесь фаговых частиц, каждая из которых экспонирует па поверхности свой пептид, закодированный встроенным фрагментом ДНК. Физическая связь между экспонированным пептидом и генетической информацией о нем делает возможным селекцию специфического фага из больших библиотек и определение первичной последовательности пептида, ответственного за связывание. Более 3 тысяч работ, опубликованных к настоящему времени, описывают способы применения фагового дисплея для решения различных генно-инженерных задач.
Близкородственные одноцепочечные ДНК-содержащие нитчатые фаги М13, П и fd, а также разработанные на их основе фагмиды, размножаются на мужских клетках Е. coli, несущих F-фактор, определяющий наличие половых ворсинок, которые необходимы для прикрепления нитчатого фага при инфицировании бактерий. Фаговый капсид построен из 5-ти различных оболочечных белков: pVIII, pill, pVI, pVII и рІХ. В первых экспериментах по фаговому дисплею для экспонирования чужеродных полипептидов использовался минорный белок рШ, представленный в капсиде всего пятью копиями (Smith, 1985). Малая копийность этого белка ограничивает возможности по получению эффективных иммуногенов и селекции низкоаффинных лигандов. Поэтому важно было исследовать возможность использования для фагового дисплея основного белка оболочки pVIII, представленного почти тремя тысячами молекул на вирион. Решение этой задачи давало бы возможность получения иммуногенных частиц значительных размеров и с высокой плотностью целевых эпитопов, полезных для создания искусственных иммуногенов на основе нитчатого фага.
Следует отметить, что фаговые частицы, экспонирующие многие копии пептидов, являются также эффективными антигенами, которые могут использоваться для определения антител в сыворотке крови. При вирусной инфекции организм человека реагирует наработкой большого количества разных антител против различных вирусных антигенных детерминант, присутствующих в сыворотке крови и способных вызывать иммунный ответ в данном организме. Расшифровка и определение последовательностей, которые связывают эти антитела, эквивалентна получению иммунологического изображения данного вируса. Пептидные фаговые библиотеки являются эффективным средством идентификации лигандов для противовирусных антител. При этом, для данного метода не нужна никакая другая информация о болезнетворном агенте, также как и не нужно иметь в наличие сам натуральный антиген или же его фрагменты. Усовершенствование техники фагового дисплея и применение новых стратегий селекции необходимо для разработки новых диагностических тест-систем по определению антител против вирусной инфекции в крови пациентов.
Отличительной чертой морфогенеза нитчатых фагов является сборка капсида, происходящая на внутренней мембране бактерии. Поэтому в библиотеках, основанных на шітпатом фаге, реально представлены только такие белки и пептиды, которые могут транспортироваться через внутреннюю мембрану, сохраняя свою нативную структуру в окисляющей среде периплазматического пространства. В этой связи использование для фагового дисплея литического фага лямбда, который собирается в цитоплазме и освобождается при помощи лизиса бактериальной клетки, позволяет преодолевать проблемы, связанные с жизненным циклом нитчатых фагов. Развитие фагового дисплея на основе бактериофага лямбда дает импульс новым приложениям техники дисплея, одним из которых является широкомасштабный скрининг больших библиотек на основе природных репертуаров. При этом трудоемкая процедура прямого скрининга огромных фаговых библиотек сводится к аффинной селекции, выполняемой в пробирке, и последующему иммуноскринингу небольших фаговых пулов, обогащенных специфическими клонами. Применение подобной техники для скрининга библиотек кДНК, полученных из человеческих опухолей, с помощью сывороток онкологических пациентов дает возможность открытия новых опухолевых антигенов, представляющих собой потенциальные мишени для диагностики и терапии онкологических заболеваний.
Наконец, техника фагового дисплея предлагает удачную альтернативу технологии мышиных моноклональных антител. Библиотеки фаговых рекомбинантных антител обеспечивают возможность селекции человеческих антител, не вызывающих иммунный ответ у пациентов и применимых в клинической практике. При этом можно улучшать
имеющиеся антитела, конструируя библиотеки созревания, дающие клоны с более высокой аффинностью.
Однако при работе по улучшению аффинности одноцепочечного антитела анти-СЕА, исследователи столкнулись с тем, что канонические векторы для дисплея антител далеки от совершенства (Pavoni, Flego et al., 2006). Селекция библиотеки созревания привела к отбору фаговых клонов с возросшей реактивностью, но содержащих TAG или TGA кодоны, которые препятствуют эффективной наработке белка. Накопление супрессированных стоп-кодонов во время селекции указывало на то, что существует сильное селективное давление в бактериях против наработки антитела анти-СЕА, которое, по-видимому, было токсичных! для бактерии. Экспрессия токсичных белков — это хорошо изученная проблема, которая может быть решена несколькими способами, такими как использование регулируемого промотора или уменьшение числа копий плазмиды (Khlebnikov et al., 2002; Bower et al., 2004). Однако дисплей рекомбинантных антител никогда не рассматривался с точки зрения возможного воздействия экспрессии антител на жизнеспособность бактерий. В этой связи, разработка нового вектора для дисплея рекомбинантных антител на нитчатом фаге, который обеспечивал бы высоко эффективный дисплей и селекцию целевых антител и уменьшал селективное давление при дисплее токсичных антител, являлось актуальной задачей.
Цель її задачи исследования
Основной целью настоящей работы являлось: 1) создание новых векторных систем для дисплея пептидов и белков на основе бактериофагов М13 и лямбда; 2) разработка диагностикумов вирусных заболеваний на основе пептидов, селектированных из пептидных фаговых библиотек; 3) идентификация новых опухолеспецифических маркеров для терапии, диагноза и прогноза раковых заболеваний; 4) получение человеческих опухолеспецифических одноцепочечных антител для терапии и ранней диагностики онкологических заболеваний.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
исследовать возможность модификации основного белка оболочки pVIII нитчатого фага М13 и создания на его основе иммуногенных частиц;
исследовать пределы модификации белка pVIII нитчатого фага путем мутагенеза или встроек нуклеотидных последовательностей случайного состава и различной длины в ген белка pVIII;
получить расширенную коллекцию пептидов, имитирующих антигенные детерминанты вируса гепатита С (мимотопов), для эффективного выявления противовирусных антител в сыворотке крови;
- разработать векторную систему для дисплея библиотек кДНК, полученных из
раковых клеточных линий или образцов опухоли молочной железы, взятой от
онкологических пациентов;
- провести поиск новых опухолевых антигенов путем скрининга библиотек кДНК
сыворотками крови онкологических пациентов;
провести расширенный серологический анализ идентифицированных антигенов и статистическую обработку данных, подтверждающую ассоциацию между присутствием в крови специфических антител и наличием опухоли молочной железы;
разработать новый вектор для дисплея антител, пригодный как для конструирования новых библиотек, так и для аффинного созревания антител;
осуществить селекцию опухолеспецифических антител из библиотек рекомбинантных антител, берущих начало от лимфоцитов В, инфильтрованных в опухоль. Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые экспериментально доказана возможность использования основного белка оболочки нитчатого бактериофага для задач фагового дисплея. Получены жизнеспособные варианты фага М13 со встройкой чужеродных пептидов в основной белок оболочки. Продемонстрировано, что встроенные пептиды экспонированы на поверхности фаговой частицы и доступны для взаимодействия с антителами.
Впервые экспериментально доказано, что в системе дисплея с высокой плотностью экспонированных пептидов основным лимитирующим фактором, влияющим на жизнеспособность фаговых частиц, является длина встроенного пептида. Было показано, что пептидная библиотека с высокой плотностью дисплея может быть использована для селекции специфических фагов, связывающих как моноклональные антитела, так и небольшие органические молекулы.
Получена обширная коллекция мимотопов вируса гепатита С, послужившая базой для создания нового пептидного диагностикума этого заболевания. Диагностикум на основе селектированных пептидов позволяет классифицировать сыворотки, получившие статус "неопределенных" при использовании коммерческих тест-систем в формате ELISA или SIA (strip immunoblot assay).
Разработана новая техника скрининга библиотек кДНК из злокачественных опухолей с помощью сывороток пациентов в формате фагового дисплея. Для эффективного дисплея
библиотек кДНК разработана новая векторная система, в которой преимущественно экспонируются природные белки с правильной рамкой считывания. Идентифицированы опухолевые антигены, вызывающие статистически достоверный иммунный ответ у пациентов с опухолью молочной железы.
Разработана новая векторная система дисплея рекомбинантных антител, облегчающая селекцию токсичных антител и обладающая более высокой эффективностью отбора целевых молекул. Новый вектор был использован для конструирования библиотек рекомбинантных антител, берущих начало от лимфоцитов, инфильтрированных в опухоль, и селекции опухолеспецифических антител. Продемонстрирована высокая эффективность нового метода по сравнению методами, опубликованными в литературе.
Положения, выносимые на защиту:
Капсид нитчатого фага может быть модифицирован без нарушения его жизнеспособности. При этом увеличение длины пептидной встройки в основной белок оболочки, введение непарного числа цистеиновых остатков и увеличение положительного заряда аминоконцевого района белка pVIII негативно сказывается на жизнеспособности фага. Пептиды, встроенные между 4-м и 5-м а.о. зрелой формы основного белка оболочки, экспонированы в раствор и доступны для взаимодействия с антителами.
Пептидная библиотека, полученная при встройке случайных пептидов длиной 8 а.о. во все копии основного белка оболочки нитчатого фага, является достаточно представительной для селекции лигандов для различных рецепторов.
Мимотопы, имитирующие натуральные вирусные антигены, могут быть выделены из фаговых пептидных библиотек с помощью сывороток больных пациентов, даже не имея информации о болезнетворном агенте. Селектированные пептиды могут использоваться как эффективный заменитель вирусных белков в диагностических тест-системах.
Новые векторы на основе фага лямбда, Х.КМ4 и ХКМ8, предназначенные для встройки фрагментов ДНК в 5'-конец гена gpD, обеспечивают эффективный дисплей белковых доменов в составе белка D на поверхности фага лямбда. Библиотеки кДНК эукариотических клеток, полученные при использовании этих векторов, экспонируют белковые домены преимущественно с натуральной рамкой считывания.
Селекция опухоль-ассоциированных антигенов с помощью сывороток онкологических пациентов приводит к идентификации преимущественно цитоплазматических шгтигенов.
Спонтанный иммунный ответ на антиген D7-1 при раке молочной железы растет с развитием стадии заболевания.
Понижение уровня экспрессии рекомбинантных антител за счет введения amber-кодона приводит к повышению эффективности селекции целевых антител.
Лимфоциты В, инфильтрированные в опухоль, могут служить источником рекомбинантных антител потенциально полезных для терапии и диагностики рака.
Апробация работы
Представленные в диссертации результаты были доложены на различных конференциях и симпозиумах: Международном симпозиуме "Proceeding of seventh international symposium on metabolism and enzymology of nucleic acids including gene and protein engineering" (Bratislava, Czechoslovakia, 1990), Международной конференции "Medical biotechnology immunization and AIDS" (Ленинград, 1991), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино 1992), Международной конференции "Phage display" (Cold Spring Harbor Laboratory, Long Island, New York, 1992), Международной конференции "Molecular genetics of bacteria and phages" (Cold Spring Harbor Laboratory, Long Island, New York, 1993), Международной конференции "EMBO workshop on Molecular repertoires and mehtods of selection" (Perugia, Italy, 1993), конференции Итальянской Ассоциации Генетиков AGI (Associazione Genetica Italiana) (Senigallia, Italy, 1993), Международной конференции "EMBO-FEMS meeting on Bacterial Viruses, Molecular Biology and Biotechnology" (Gargnano, Lake Garda, Italy, 1994), Конференциях Итальянской Федерации FISV (Federazione Italiana Scienze della Vita) (Riva del Garda, 1999, 2000, 2001, 2002), Международном семинаре "Basic Science in ISTC Activities" (Academgorodok, Novosibirsk, 2001), Международном Симпозиуме "7th International Symposium on Predictive Oncology & Intervention Strategies" (Nice, France, 2004), Международном семинаре "Monoclonal Antibodies: Research, Development and Applications" (Rome, Italy, 2005), Международной конференции "2nd IFOM'IEO Campus Meeting on Cancer" (Milan, Italy, 2006), Международном конгрессе "25th Congress of the International Association for Breast Cancer Research" (Montreal, Canada, 2006).
Публикации
По материалам диссертации получено 5 международных патентов и опубликовано 28 статей.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из семи разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы" и "Список литературы".
Работа изложена на 230 страницах машинописного текста и включает 72 рисунка, 11 таблиц и список литературы, содержащий 501 ссылку.
Пептидные библиотеки
Термин "пептидная библиотека" относится к коллекции пептидов, кодируемых следовательностями, встроенными в ген какого-либо из оболочечных белков фага. исло возможных индивидуальных клонов в библиотеке равно 20", где п - длина спонируемого пептида. Например, библиотека 7-мерных пептидов теоретически ожет содержать 20 или 1.28x10 различных клонов. Однако количество независимых онов в библиотеке ограничено эффективностью трансформации бактерий. Так как удно сконструировать библиотеку, содержащую более 10 -10 независимых клонов, то е библиотеки со вставками больше 7 аминокислот являются непредставительными, е. не кодируют все возможные последовательности пептидов заданной длины. Однако такая оценка не принимает во внимание вырожденность генетического да. Двадцать аминокислот кодируются разным числом триплетов, приводя к неравной едставленности отдельных аминокислот в пептидной последовательности. В лынинстве библиотек аминокислотные последовательности закодированы триплетами [К или NNS, где N - любой их четырех нуклеотидов, К - G или N, S - G или С. Этот етод не только уменьшает встречаемость стоп-кодонов с 3/64 до 1/32, но и увеличивает тречаемость аминокислот, кодируемых только одним триплетом с 1/64 до 1/32. В еале, пептидный репертуар должен состоять из коллекции молекул, в которых все 20 о. встречаются с равной вероятностью во всех позициях. Это может быть получено при орке нуклеотидной последовательности из смеси двадцати триплетов, кодирующих ные аминокислоты (Nord jet al., 1995; Nappi jet al., 2000). Альтернативная стратегия я синтеза последовательностей ДНК, содержащей 20 кодонов, основана на пользовании фосфорамидитных производных динуклеотидов (Neuner et al., 1998).
Интересно отметить, что в некоторых случаях эффективную библиотеку можно лучить, используя не все 20 возможных а.о. В CDR-петлях человеческих муноглобулинов 39% всего набора аминокислот приходится на тирозин, серии и ицин (Zemlin et al., 2003). Этот факт привел к идее о создании библиотек нтетических антител, основанных на использовании только 4 а.о. в позициях CDR-тель, обращенных в раствор. Удивительно, что наборы четырех аминокислот, лючающие тирозин, аланин, аспарагиновую кислоту и серии, или треонин, аргинин, ицин и аланин, приводили к селекции антител с наномолярной аффинностью (Fellouse al, 2004; Fellouse et al., 2006
Рецепторный минорный белок pill и основной белок оболочки pVIII чаще всего пользуются для дисплея пептидов и белков на поверхности нитчатого фага. Структура их белков хорошо изучена, что позволяет рационализировать дизайн пептидных блиотек (Banner et al., 1981; Marvin, 1990; Nambudripad et al., 1991; Holliger & iechmann, 1997; Lubkowski et al., 1998). Оба белка обращены N-концами в раствор, этому короткие пептиды встраиваются для дисплея именно в этот район. При этом не рушается сборка фаговой частицы и сохраняется инфекционность бактериофага. читается, что большинство пептидов или белковых доменов могут быть спонированы на поверхности фага в составе белка рШ. Исключения могут быть язаны с чувствительностью встройки к протеазам периплазматического пространства и невозможностью мембранного транспорта встроенного белкового фрагмента. Более дробно эта проблема будет обсуждаться в главе 1.9.
В системе pVIII, жизнеспособность фага падает с возрастанием длины пептидной тройки (Ильичев и соавт., 1989; Minenkova et al., 1993; Greenwood et al., 1991). ольшинство 6-мерных встроенных пептидов хорошо переносятся фагом, но только 40% мерных встроек приводят к формированию инфекционных фаговых частиц (Iannolo et ., 1995). При длине встройки 15 а.о., практически нет пептидов, которые можно было і встроить во все копии белка pVIII. Тем не менее, функционирующие 8-мерные блиотеки в которых все копии pVIII несут встроенный пептид, описаны в литературе etrenko et al., 1996; Iannolo et al., 1997). Из-за высокой плотности встроенных пептидов верхностная архитектура таких фагов обладает свойствами, которые не присущи дельным пептидам. Такие "ландшафтные" библиотеки могут быть полезны для лекции низкоаффинных лигандов. Однако из-за различной скорости роста фагов, ставляющих библиотеку, обусловленной тем, что не все пептиды одинаково агоприятны для сборки фагового капсида, в процессе селекции отбираются мпромиссные варианты фагов, эффективно растущие и способные связывать олекулу-мишень (Iannolo et al., 1997).
Более длинные пептиды могут быть встроены в pVIII без нарушения фагового изненного цикла, при сборке химерных фаговых частиц, имеющих мозаичное строение псида, состоящего из нормальных и рекомбинантных белков. Способность к рмальной сборке фаговых частиц восстанавливается при введении в клетку гена, дирующего белок pVIII дикого типа. Дополнительный ген может находиться либо в номе самого фага вместе с рекомбинантным геном, либо в геноме фага-помощника, гда как рекомбинантный ген находится в фагмиде, небольшой плазмиде, несущей рагмент ДНК, отвечающий за начало репликации нитчатого фага (ori fl). В такой стеме пропорция между рекомбинантным рШ и белком дикого типа варьируется от скольких молекул на капсид до 50% от общего белка (Cesareni et al., 1999).
Согласно номенклатуре предложенной Смитом и Шульцем (Smith & Schultz, 93) существуют четыре основные стратегии для дисплея пептидов и белков на капсиде тчатых бактериофагов: 3; 3+3; 8; 8+8, Рис 4.
Четыре типа фагового дисплея. (3) Фаговый геном содержит единственную копию гена II со встройкой, поэтому все копии этого белка экспонируют клонированный полипептид. +3) Гибридные системы основаны на присутствии двух копий гена рЕ1. Обе копии могут ходиться в геноме фага (А), при этом ген дикого типа имеет более сильный промотор и спрессируется на более высоком уровне. Альтернативно используется система фагмида/фаг-мощник (В). Фаговая частица содержит более короткий геном фагмиды, а фаг-помощник еспечивает экспрессию фаговых генов. Рекомбинантный белок или библиотека спрессируются с гена, который несет фагмида. Системы, основанные на использовании белка III, аналогично позволяют конструировать бактериофаги, экспонирующие пептидные следовательности с высокой (8) или низкой (8+8) плотностью.
Ограничения дисплея, основанного на нитчатом фаге
Моноклональные антитела (МКА) широко используются для селекции лигандов фаговых пептидных библиотек. Хотя исследования кристаллической структуры казывают, что эпитопы реальных белков, как правило, пространственные, ибольший вклад в энергию связывания дает короткий линейный пептид. В лынинстве случаев пептиды, выделенные из фаговых библиотек, несут короткий нейный район аналогичный белку, который использовался для получения МКА wirla et al., 1990; Scott & Smith, 1990; Maruyama et al., 1994; Bonnycastle et al., 1996; ellofiore et al., 2006). Таким образом, если существует линейный эпитоп, связывающий иное МКА с аффинностью не меньше 100 цМ, то он может быть идентифицирован с мощью процедуры биопаннинга. В связи с этим фаговый дисплей является едпочтительным инструментом для картирования линейных эпитопов (Cortese et al., 94; Cortese et al., 1995; Vaccaro et al., 1997; Dore et al., 1998; Ramasoota et a., 2005; Deng al., 2007). Кроме того, техника фагового дисплея может быть использована для ъяснения некоторых характеристик различных МКА. Так в одной из недавно убликованных работ методом фагового дисплея было показано, что моноклональные титела, способные связывать парафинированные и фиксированные формалином срезы аней, узнают именно линейные эпитопы (Sompuram et al., 2006). В случае, когда не существует короткого линейного пептида в эпитопе, который особен связывать антитело с достаточно высокой аффинностью, процесс селекции .иводит к идентификации "мимотопа" - т. е. пептида, который имитирует антиген alass et al., 1993; Johnson et al., 1998). В некоторых случаях мимотопы являются также иммуногенными имитаторами исходного эпитопа, так как при иммунизации мышей и вызывают перекрестный иммунный ответ с исходным антигеном (Keller et al., 1993; rlandi et al., 1994; Meola et al., 1995; Rudolf et al., 1998). Следует отметить, что зможна селекция пептидов не только при помощи МКА, но и смеси антител, например и помощи поликлональных сывороток. Использование сывороток пациентов, іадающих вирусными инфекциями и аутоиммунными заболеваниями, приводит к лекции вирус-специфических мимотопов (Folgori et al., 1994; Prezzi et al., 1996) и ептидов, имитирующих аутоантигены (Cortese et al., 1998; Mennuni et al., 1997). Для эпитопов непептидной природы таких, как полисахариды или ДНК, также огут быть найдены пептидные мимотопы при скрининге пептидных библиотек с спользованием антител, узнающих полисахариды (Oldenburg et al., 1992; Hoess et al., 993; Pincus et al., 1998) и ДНК (Gaynor et al., 1997; Sibille et al., 1997). И в этом случае кие пептиды могут вызывать иммунный ответ против исходного антигена (Putterman Diamone, 1998). Таким образом, впервые в 1997 г. была предложена стратегия для іработки вакцин, основанных на пептидных мимотопах полисахаридов (Phalipon et al., 97).
Важно отметить, что использование дисплея на основе белка pVIII дает ределенное преимущество, так как, благодаря высокой иммуногенности гибридных агов, несущих множественные копии селектированного пептида, нет необходимости мического синтеза пептидов или конъюгирования их с белком-носителем. Вместо ого, прямая инъекция фаговых частиц приводит к сильному иммунному ответу (Willis al., 1993; Minenkova et al., 1993; di Marzo Veronese et al., 1994).
Белок-белковые взаимодействия Использование пептидных фаговых библиотек для изучения взаимодействий тиген-антитело привело к более широкому использованию этого подхода для учения белок-белковых взаимодействий. Такие исследования дают информацию о атуральных партнерах исследуемого белка и механизме белкового узнавания. Кроме го, получение специфических лигандов позволяет исследовать физиологические следствия нарушения формирования макромолекулярного комплекса in vivo. Большинство белков для которых были получены пептидные лиганды с цМ финностью относятся к таким небольшим белковым доменам, как SH3, РТВ, EH, WW PDZ (Songyang et al., 1993; Songyang et al., 1994; Sparks et al., 1994; Dente et al., 1997; alcini et al., 1997; Songyang et al., 1997), которые широко встречаются в различных еточных белках. В работе Бремнеса было показано, что даже короткие пептиды могут гть использованы для скрининга фаговых библиотек (Bremnes et al., 1998). Авторы ой работы использовали пептид длиной 15 аминокислотных остатков, происходящий з цитоплазматического домена ассоциированного белка гистосовместимости II класса, изолировали 10-мерный пептид, узнающий лейциновый эндосомальный сигнал ртировки. В случае домена ЕН, который впервые был описан в белках Epsl5 и Epsl5R ong et al., 1995), в результате скрининга пептидной библиотеки было установлено, что от белковый модуль связывает AsnProPhe-содержащие пептиды с предпочтительным азмещением основных или гидрофобных аминокислот в позиции +1 и со слабым редпочтением для Ser или Thr в позиции -1 (Salcini et al., 1997). Последующий прямой рининг библиотеки, экспрессирующей кДНК человеческих фибробластов, выявил есколько потенциальных партнеров взаимодействия для домена ЕН, при этом каждый з них содержал мотив NPF, ранее идентифицированный с помощью фаговой пептидной блиотеки. Сайт-направленным мутагенезом было показано, что именно оследовательность NPF отвечает за взаимодействие белков.
Пептиды, полученные в результате скрининга пептидных фаговых библиотек, огут быть использованы, в свою очередь, для скрининга библиотек кДНК. Такая хника называется COLT (cloning of ligand target) (Sparks et al., 1996). 1.83. Агонисты и антагонисты рецепторов Мембранные рецепторы не подвергались систематическому анализу с помощью агового дисплея в основном из-за их большого размера, сложной топологии и, ответственно, сложности получения необходимого количества белка, имеющего . авильную конформацию, для биопаннинга. Однако получение растворимых доменов екоторых рецепторов, а также развитие методов селекции на клетках, позволило зонировать пептиды, которые связывают гликопротеин ПЬ/Ша (O Neil et al., 1992); тегрин абрі (Murayama et al., 1996); рецептор IL-1 (Yanofsky et al., 1996); итропоэтин (Wrighton et al., 1996); тромбопоэтин (Cwirla et al., 1997; Kimura et al., 97); рецептор урокиназы (Goodson et al., 1994) и основного комплекса стосовместимости II класса (Hammer et al., 1992; Hammer et al., 1993; Hammer et al., 94).
Более специализированный подход, впервые описанный в работе Велса, был именен для поиска специфических высокоаффинных агонистов и антагонистов для цепторов человеческого гормона роста (Lowman et al., 1991; Lowman & Wells, 1993), терлейкина-6 (Cabibbo et al., 1995), белка heregulin (Ballinger et al., 1998). В этом одходе, вместо библиотеки случайных пептидов, использовался полный лиганд, троенный в состав белка рШ. Для получения библиотеки рандомизировались а.о., ормирующие поверхность взаимодействия с рецептором.
Аффинные реагенты часто способны ингибировать активность молекулы ишени, т. к. они могут связывать активный сайт ферментов или, например, . едотвращать связывание ростовых факторов с рецепторами. Кроме того, аффинный агент может связывать субстрат молекулы-мишени (Klimka & Shami, 2003). екоторые характеристики пептидных ингибиторов затрудняют их терапевтическое спользование, однако они являются удобным инструментом для исследования и оценки олекулы-мишени в лабораторных условиях (Montigiani et al., 2003). Обычно пептидные нгибиторы имеют низкую аффинность, поэтому они переводятся в мультимерную орму или конъюгируются с белком-носителем, и, таким образом, используется эффект идности (Montigiani et al., 2003; El-Mousawi et al., 2003). Такой подход был пользован для разработки ингибитора токсина сибирской язвы (Mourez et al., 2001).
Чаще всего в лабораториях и клинической практике в качестве ингибиторов спользуются антитела (Glennie & van de Winkel, 2003). Антитела лучше подходят для гибирования, так как эти молекулы по своей сути предназначены для связывания утих молекул. Прямой скрининг неиммунных (naive) библиотек в некоторых случаях озволяет изолировать антитела с наномолярной аффинностью ( Lue t al., 2002), в то емя как для других антител нужно провести несколько раундов мутагенеза для стижения такой аффинности (Baker et al., 2003). Для полного ингибирования в которых, особенно сложных случаях, например при ингибировании токсина ботулина, ебуется два или три антитела, связывающих разные эпитопы этого токсина owakowski et al., 2002).
Получение жизнеспособных вариантов фага М13, экспонирующих на своей оверхности чужеродные пептиды в составе основного белка оболочки pVIII
Мы проводили анализ полученных библиотек на размер встроенных фрагментов. ыло показано, что размер встройки большинства фрагментов в этих библиотеках рьируется от 100 до 400 п.о., Рис. 46. Селекцию опухолевых антигенов проводили, как исано в главе 3.3.4. Таким образом, нами был идентифицирован 21 новый клон, роявляющий предпочтительную реактивность с положительными сыворотками, Таблица 6. нализ последовательностей найденных клонов показал, что они относятся к 18 различным иным продуктам, так как 4 клона, Т5-9, Т9-21, Т9-27 и ТІ 1-7, имели гомологию с азличными районами одного и того же гена, обратной транскриптазы, Рис. 47. Большая асть клонов, отобранных из новых библиотек, содержала фрагменты известных генов с равильной ориентацией и верной рамкой считывания. Исключение составлял клон Т5-18, есущий фрагмент ДНК онкогена туе с альтернативной рамкой считывания. Некоторые из айденных генных продуктов, такие, как гомолог обратной транскриптазы (клоны Т5-9, Т9-1, Т9-27 и ТІ 1-7), протеин киназа С-связывающий белок (Т6-1), белок температурного шока . g-2 (ТІ 1-13) были ранее идентифицированы методом SEREX (Chen, 2000; Eichmuller et al., 001; Scanlan et al., 2001; Nakatsura et al., 2001; Scanlan et al., 1998). Фаговые лизаты естировали, используя положительные и отрицательные сыворотки. Все найденные тигены реагировали предпочтительно или исключительно с положительными ыворотками. Восемь антигенов реагировали с единственной сьгоороткои, использованной ля селекции. Пять антигенов (Т6-2, Т6-7, Т7-1, Т9-21 и Т9-27) имели выраженный пухолевый профиль реактивности, Р 0.05. Оставшиеся клоны либо реагировали с малым роцентом сывороток, либо панель сывороток была недостаточна, чтобы сделать пределенное заключение.
Последовательности 4-х идентифицированных клонов, имеющих частичную гомологию с оследовательностью обратной транскриптазы. Аминокислотная последовательность представлена днобуквенным кодом. Идентичные а.о. в белке обратной транскриптазы и найденных фрагментах бозначены тире. Данные клоны были изолированы из библиотек различного происхождения, при ом название клона включает название исходной библиотеки. Клоны Т9-21 и Т9-27 реагировали с ольшим числом положительных сывороток.
Экспрессия генов, выявленных ТАА, в опухолях молочной железы
Экспрессию некоторых из найденных генов, определенных нами как опухолевые нтигены (ТАА), анализировали с помощью полуколичественной ПЦР, используя в качестве атрицы кДНК, синтезированную при помощи SMART технологии. Сравнением уровней кспрессии целевых генов, амплифицированных при использовании SMART кДНК и оответствующей полной РНК, ранее было показано, что SMART кДНК аккуратно отражает . овни экспрессии, найденные в полной РНК (Zhumabaeva et al., 2001). При помощи ПРЦ єна р-актина, который конститутивно экспрессируется всеми видами клеток, мы ормализовали панель кДНК, полученных из 10 различных образцов карциномы молочной елезы, лимфатического узла с метастазами, нормальной молочной железы и тестикул, а акже лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, Рис. 48.
Было показано, что три идентифицированных антигена, фукозилтрансфераза (Т6-7), инк-фингер (ТІ 1-6) и р53-связывающий белок (Т1-52), экспрессируются конститутивно по ипу убиквитина как во всех опухолях, так и в нормальных тканях, Рис. 48А. Некоторые из нтигенов, такие, как Т5-15 (КІАА1735), Т5-13 (Sosl), ТІ 1-5 (гипотетический белок
GC4170) экспрессируются на пониженном уровне во многих опухолях, Рис. 48В. В то ремя как антигены ТІ 1-9 (гипотетический белок AF225417) и Т7-1 (КІАА1288) имели овышенный уровень экспрессии в 50% первичных опухолей и единственном имфатическом узле с метастазами, Рис. 48С. ПЦР анализ экспрессии генов. В тесте использовали 7-10 кДНК, полученных из различных бразцов опухоли молочной железы (пациенты В84, В85, В87, В89, В90, В91, В92, В93, В95 и В96). бразец, обозначенный LMB82, соответствует лимфатическому узлу с метастазами, полученному от ациента В82 с карциномой молочной железы. кДНК были нормализованы амплификацией гена р-ктина. На рисунке (А) представлены гены, которые экспрессируются по типу убиквитина, (В) - гены пониженной экспрессией и (С) - с усиленной экспрессией. (trap ankyrin repeat) усиленно экспрессируется в большинстве протестированных пухолей, по сравнению с нормальной молочной железой. Однако при этом данный антиген орошо экспрессируется и в нормальных лимфоцитах и тестикулах. Чтобы оценить очность полуколичественного метода анализа, используемого для оценки экспрессии генов опухолях, мы амплифицировали известный опухолевый антиген neu/HER2. Среди семи ротестированных образцов данный ген высоко экспрессировался в двух опухолях (29%), то находится в согласии с литературными данными по карциноме рака (Thomas & Berner, 000; Lattaetal., 2002).
Исследование гуморального иммунного ответа у пациентов с опухолями молочной железы на большой панели человеческих сывороток Функции и значение антител, вырабатываемых у пациентов в ответ на раковые аболевания, в настоящее время остаются плохо изученными. Однако тестирование таких нтител и определение их уровня может быть полезно для клинического прогноза болезни. апример, известно, что уровень циркулирующих в крови антител анти-MUCl хорошо оррелирует с продолжительностью жизни пациентов с раком поджелудочной железы armonica et al., 2003). У пациентов с хронической миелогенной лейкемией, получивших . ансфузию донорских лимфоцитов для лечения рецидивов, высокий титр антител, пецифических к антигену CML66, коррелирует с ремиссией заболевания (Yang et al., 2001). о этой причине интерпретация иммуногенности и дальнейшее изучение встречаемости атурального гуморального иммунного ответа у опухолевых пациентов может дать важные ведения, позволяющие прогнозировать ожидаемую продолжительность жизни пациентов, а акже проводить мониторинг иммунного ответа на соответствующую иммунотерапию.
Экспрессия рекомбинантных белков Фрагменты опухолевых антигенов, выделенные из библиотек фагового дисплея, роизводили в виде рекомбинантных белков, клонируя в плазмидах pGEX-SN, рКМ4-6Н или КМ13 (Minenkova et al., 2003; Pavoni et al., 2006). В результате получали рекомбинантные елки, сшитые либо с GST, либо с белком gpD. Результирующие белки получали название, охраняющее номер фагового клона и несущее приставку GST или D в зависимости от белка осителя. Чтобы исключить возможную неспецифическую реактивность человеческих ывороток с белками носителями, специфическая реактивность сывороток рассчитывалась ак разность реактивности с рекомбинантным и контрольным белками. И только два клона 9-27 и ТІ 1-5 анализировались с помощью ELISA, используя исходные клоны на фаге
Идентификация опухолевых антигенов путем скрининга библиотек кДНК, спонированных на поверхности фага лямбда, с помощью сывороток пациентов
Наконец, в бактериях, несущих шіазмиду рКМ19, после синтеза рекомбинантного лка лидерный пептид щелочной фосфатазы отщепляется при транслокации через мембрану рекомбинантный белок scFv-ДрШ встраивается в фаговую частицу. Использование дерной последовательности и двух первых а.о. щелочной фосфатазы, натурального риплазматического белка Е. coli, гарантирует эффективный и правильный процессинг, и орку антител в бактериях. Предложенная векторная система для получения растворимых тител нуждается в субклонировании гена, кодирующего антитело, в подходящей плазмиде. а этой стадии два дополнительных а.о. могут быть сохранены или удалены, согласно еланию экспериментатора.
Комбинация относительно низкой экспрессии антител из-за введения amber-кодона с учшенной эффективностью дисплея делает нашу плазмиду полезной, как для селекции комбинантных антител против заданных целевых белков из больших библиотек, так и для аффинного созревания. Плазмида гарантирует эффективный дисплей и уменьшает ияние селективного давления, направленного против "трудных" антител во время лекции. Кроме того, новый вектор особенно полезен для созревания антител, так как ісокиЙ уровень экспрессии может увеличивать авидность фаговых частиц, экспонирующих титела, приводя к селекции антител только с умеренной аффинностью.
Новый вектор применяли для конструирования библиотек рекомбинантных антител, рущих свое начало от В лимфоцитов, инфильтрированных в опухоль. По сравнению с В мфоцитами периферической крови, клональность которых не регистрируется методами ямого секвенирования клонов ( 1/20000), В клетки, происходящие из лимфатических лов, лежащих поблизости от опухоли или инфильтрированные в опухоль, представляют много более ограниченный репертуар антител (Corenella-Wood et al, 2003). Около 7% мфоцитов лимфатических узлов и 18-68% лимфоцитов, инфильтрированных в опухоль, і инадлежат клональным группам, указывая на те и на другие, как на перспективный точник опухолеспецифических антител. Действительно, об идентификации таких антител лимфатических узлов при помощи фагового дисплея сообщалось в литературе (Clark et al., 97; Rothe et al., 2004; Xu et al., 2004). Однако мы столкнулись с трудностями при лучении свежего оперативного материала, содержащего лимфатические узлы, от циентов с раком молочной железы. Дело в том, что согласно современной медицинской актике, хирург не удаляет пациентам десятки лимфатических узлов, лежащих поблизости опухоли, а только "сигнальный" лимфатический узел или небольшой кластер узлов сигнальный" и ближайшие к нему), производя, тем самым, как можно более щадящее рургическое вмешательство. После этого тонкие срезы практически всего лимфатического ла изучаются на предмет присутствия микрометастаз и отдельных раковых клеток. В зультате такой материал становится недоступен для экстракции мРНК и приготовления блиотек.
Как обсуждалось ранее в Главе 3.4.5, культивирование В клеток, происходящих от мфоцитов, инфильтрированных в опухоль и создание коротко живущих гибридом (Sicora al., 1982; Sicora et al., 1983), эксперименты по экспансии В-клеток, происходящих из опсий человеческих опухолей (Punt et al., 1994, Zhang et al., 1995); а также в работы по ансплантации фрагментов ткани человеческой опухоли легких иммунодефицитным ышам, продолжающей производить специфические антитела за счет присутствия фильтрированных лимфоцитов в опухолевую ткань (Imahayashi et al., 2000; Yasuda et al., 02) подтверждали идею о том, что такие В лимфоциты производят антитела, способные спознавать раковые клетки. Однако, несмотря на все вышеизложенные свидетельства того, о опухолевые ткани содержат инфильтрированные активированные В клетки, которые огут служить источником специфических антител против опухолевых антигенов, несколько сследовательских групп потерпели неудачу при попытке селекции опухолеспецифических тител из подобных библиотек (Coronella et al., 2001; Roovers et al., 2001; Hansen et al., 01). При проведении биопаннинга на очищенных опухолевых антигенах, живых пухолевых клетках или срезах замороженной опухолевой ткани были выделены антитела, нающие актин или другие цитоплазматические белки и не способные различать пухолевые и нормальные клетки. Только в последующих работах двум группам удалось іделить из подобных библиотек специфические антитела, узнающие опухолевые клетки oronella et al., 2002; Kotlan et al., 2005). В то же самое время, альтернативный подход, свободный от ограничений, связанных с хникой фагового дисплея и основанный на прямом скрининге экспрессионной библиотеки екомбинантных антител, происходящих из TIL, позволил By с соавторами (Wu et al., 2002) іделить обширную панель опухолеспецифических антител. Полученные результаты азывали на то, что возникающие трудности при селекции антител с помощью фагового исплея из библиотек с ограниченным разнообразием антител, являются результатом есовершенства векторов, используемых для дисплея.
В нашей работе мы исследовали клональность антител в первичных опухолях лочной железы и показали, что 7 образцов из 10 (70%) могут служить источником ухолеспецифических антител.
Библиотеки рекомбинантных антител, сконструированные при помощи вектора Ml9, были подвергнуты селекции на очищенных опухолевых антигенах, а также на тактных клетках карциномы. В том и в другом случае поставленная задача была решена. нтересно отметить, что при селекции на живых клетках мы не использовали едварительную селекцию библиотеки на клетках нормального эпителия, направленную на еднение фагового пула и освобождение от неспецифических антител, связывающихся с етками неспецифическим образом, как описано во многих работах (Ridgway et al., 1999; opping et al., 2000; Shadidi et al., 2001;Rothe et al., 2004; Xu et al, 2004). Это указывает на то, о наши библиотеки антител содержат очень ограниченный натуральный репертуар ухолевых антител, а не широкий спектр антител с новой специфичностью, полученный и рекомбинации легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. Кроме того, нами было казано, что библиотеки, берущие свое начало от лимфоцитов, инфильтрированных в ухоль, функционируют более эффективно, чем библиотека из лимфоцитов риферической крови, при селекции на клетках.
Таким образом, на основании проведенного исследования было показано, что образцы ухоли, размером не более 0.2 г, полученные в результате мастэктомии, могут служить точником для конструирования библиотек рекомбинантных антител, обогащенных ухолеспецифическими антителами. Нами была получена панель опухолеспецифических тител, охарактеризованных по их способности связывать поверхность раковых клеток етодами ELISA, флуоресцентного окрашивания клеток и проточной цитометрии, Рис. 71 и . Селекция специфических антител, как против очищенных белков, так и против живых еток карциномы, указывает на то, что данный метод перспективен для получения ловеческих рекомбинантных антител, которые можно использовать для терапии и агностики опухоли молочной железы и других видов рака. Кроме того, исследование кального иммунного ответа у пациентов на опухолевые антигены может иметь значение я прогноза болезни, а также служить источником открытия новых антигенов.
