Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
Часть I, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Введение 10
Глава 1. Общие свойства РНК-полимеразы, транскрипционный цикл и модели
тройного элонгационного комплекса 10
Стадии транскрипционного цикла 10
Энзиматические реакции, катализируемые РНК-полимеразой, и состояния активного центра 13
Модели, описывающие структуру РНК-полимеразы 15
Модель вон Хиппеля 17
Модель Чамберлена 17
Интегрированная модель РНК-полимеразы 19
Глава 2. Кристаллическая структура корфермента РНК-полимеразы 20
Общая архитектура РНК-полимеразы 21
Элементы структуры РНК-полимеразы 24
Особенности строения эукариотической РНК-полимеразы 27
Глава 3. Взаимосвязь между структурными элементами молекулы РНК-полимеразы
и ее функциями 27
Стабильность элонгационного комплекса РНК-полимеразы 28
Контакты РНК-полимеразы с нуклеиновыми компонентами элонгационного комплекса 30
Структурная основа терминации синтеза РНК 31
Вторичный канал 32
Транслокация РНК-полимеразы вдоль ДНК матрицы 35
Глава 4. Кристаллическая структура холофермента РНК-полимеразы 36
Доменная организация ст-субъединицы 36
Взаимодействие а-субъединицы с корферментом 38
Изменение структуры корфермента вызываемое присоединением сг-субъединицы 39
Структурные основы инициации синтеза РНК 40
Абортивный синтез РНК и структура холофермента 43
Заключение 44
Часть П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45
Бактериальные штаммы 45
Плазмиды 45
Питательные среды и антибиотики 45
Трансформация бактерий 45
Выделение плазмидной ДНК 46
Использование ферментов в молекулярном клонировании , 46
Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)....47
Сайт специфический мутагенез гена гроС 47
Электрофорез ДНК в агарозных гелях и ее очистка 48
Определение нуклеотидной последовательности ДНК по методу Сэнгера 48
Сборка РНК-полимеразы Е. coli из индивидуальных сверхпродуцированных субъединиц 49
Получение промоторной ДНК 49
Электрофорез в полиакриламидных гелях 50
14.Выделение клеточной РНК-полимеразы с олигогистидиновым якорем 50
15. Пришивка РНК-полимеразы Е. coli к З'-концу РНК , 51
A. Пришивка из инициаторных комплексов 51
Б. Пришивка из элонгационных комплексов 52
B. Пришивка из минимального остова (М.О.) 53
Мечение белка с помощью протеин-киназы 53
Картирование района пришивки методом неполного расщепления белка 53
Полное расщепление белка по метиониновым остаткам 54
Количественный анализ пришивок и построение молекулярных моделей 54
Измерение прочности связывания ДНК в открытом промоторном комплексе 55
Инициация РНК синтеза с Т7 А1 промоторного фрагмента 55
Транскрипция наТ7 А1 промоторном фрагменте 56
Свободно-радикальное расщепление РНК в транскрипционном комплексе 57
24.0бразование коротких стабильных РНК продуктов на Т7 А2 промоторе 58
Пришивки из 5' конца коротких стабильных РНК продуктов на Т7 А2 промоторе....58
Прямая фотопришивка РНК-полимеразы к рифампицину 59
Демодификация Rif-GDP или Rif-GTP соединений и меченых ферментов 59
Часть III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 60
Глава 1. Изучение подвижности 3'-конца РНК продукта в активном центре РНК-
полимеразы Е. coli 60
Введение 60
Транскрипционные комплексы и реагенты, использовавшиеся в работе 61
Стратегия картирования мест пришивок и белковые маркеры, использованные в работе 65
Пришивки З'-конца РНК из реагентовс реактивными группами нарибозе 71
Две конформации «F-мостика» активного центра РНК-полимеразы 81
Пришивки З'-конца РНК к активному центру РНК-полимеразы из реагентов с реактивными группами на основании 84
Мутации в консервативном районе G р"-субъединицы 99
Глава 2. Абортивная и продуктивная инициация транскрипции 109
Введение 109
Абортивная и продуктивная инициация наТ7 А2 промоторе 110
Контакты 5'-конца коротких стабильных РНК в тройном комплексе 114
Глава 3. Движение консервативного Hisl237 Р-субъединицы во время инициации
синтеза РНК 117
Введение 117
3.1 Фотопришивка рифампицина в активном центре РНК-полимеразы 118
*
ВЫВОДЫ 124
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 126
БЛАГОДАРНОСТИ 126
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 127
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
CAPS - З-(циклогегсиламино) 1-пропансульфат
dNTP — дезоксирибонуклеозидтрифосфат
DTT -дитиотреитол
EDTA - этилендиаминтетраацетат
HEPES- 4-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-1 -этан-серная кислота
IPTG - изопропид-Р-тио-О-галактопиранозид
МпТБ марганцевый транскрипционный буфер
PMSF - метилфенилсульфонилфторид
SDS - додецилсульфат натрия
TEMED - 1,2-Бис-(диметиламино)-этан
TNCBA - тио-нитро-бензойная кислота
АТФ — аденозин трифосфат
БМ - буфер с мочевиной
ГДФ - гуанозин дифосфат
ГТФ — гуанозин трифосфат
МО - минимальный нуклеотидный остов
нт. - нуклеотидов
НТФ - рибонуклеозидтрифосфат
об/мин - оборотов в минуту
О.Е. - оптическая единица
п.н. - пар нуклеотидов
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ПЭ - промоторный элемент
СБ - стоп буфер
ТБ - транскрипционный буфер
ТК -тройной комплекс
ТРИС - Трис-(гидроксиметил)-аминометан
ТЭК - тройной элонгационный комплекс
»
УТФ - уридин трифосфат ЦТФ - цитозин трифосфат
*
»
Введение к работе
Актуальность темы
На протяжении последних 30 лет РНК-полимераза Е. coli является объектом пристального внимания в качестве модельной системы для изучения транскрипция. Этот большой мультисубъединичный фермент с молекулярной массой около 450 kDa состоит из четырех субъединиц корфермента (о^рр') обладающего каталитической активностью, а также ст-субъединицы, необходимой для узнавания промоторных последова-тельностей ДНК и инициации синтеза РНК. В настоящее время получен большой объем информации о строении РНК-полимераз, основанной на расшифровке трехмерной структуры ферментов, как про-, так и эукариот. Надо отметить, тем не менее, что РНК-полимераза в составе кристалла фиксируется только в одном из возможных конфор-мационных состояний, поэтому необходимо применение различных биохимических и генетических методов для выявления альтернативных конформаций фермента, физиологическое значение которых может быть исследовано исходя из природы комплекса, в котором они были получены.
Теоретически можно предположить два вида конформационной подвижности в транскрипционном комплексе - перемещение в пространстве частей нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) относительно фермента или изменение в структуре белка. Примером первого типа являются транслокация РНК-полимеразы по матрице и переход фермента в состояние транскрипционного ареста. Оба процесса сопровождаются движением нуклеиновых компонентов комплекса относительно РНК-полимеразы (Komissarova and Kashlev 1997, Nudler et al., 1997). Внутримолекулярные перемещения белковой части транскрипционного комплекса также неоднократно постулировались (Krummel and Chamberlin 1992), однако прямых доказательств движения такого рода не существовало. Определение трехмерной структуры РНК-полимеразы позволило предложить молекулярные основы для подобных процессов. Одним из примеров пластичности белка может служить изменение в строении «F-мостика» (Zhang et al„ 1999; Gnatt et al., 2001). Несмотря на сходное строение прочих компонентов активного центра и высокую
гомологичность данного участка белка среди различных РНК-полимераз, этот элемент вторичной структуры занимает два разных положения в составе эукариотического и прокариотического ферментов. Такая разница может отражать два альтернативных состояния активного центра, однако не исключено, что различие обусловлено видовым разнообразием структуры РНК-полимераз. Несомненный интерес привлекает также и процесс инициации синтеза РНК. Известно, что РНК-полимераза при переходе от инициации к элонгации меняет свои свойства, приобретая высокую устойчивость и процессивность, тогда как инициациаторный комплекс относительно нестабилен. Таким образом, процесс ухода с промотора также сопровождается конформационным переходом. Появление кристаллических структур холоферментов бактериальных РНК-полимераз (Murakami et al., 2002a,b; Vassylyev et al., 2002) позволило установить некоторые молекулярные основы стабилизации фермента.
В нашей лаборатории на протяжении последних 10 лет для структурно-функциональных исследований использовался метод аффинной модификации белка, включающий ковалентные пришивки нуклеиновых кислот к РНК-полимеразе и последующее картирование точек контакта. Этот подход позволяет выявлять участки белка, входящие в состав функциональных доменов РНК-полимеразы в активных транскрипционных комплексах. В настоящей работе аффинная модификация белка была использована в сочетании с биохимическими и генетическими методами с последующим наложением результатов картирования на имеющиеся трехмерные кристаллические структуры фермента. Комплексный подход позволяет глубже понять многие механизмы лежащие в основе синтеза РНК и его регуляции, а также выявить ранее неизвестные (или только теоретически постулируемые) внутренние движения РНК-полимеразы.
Цель работы и задачи исследования
Целью работы являлось исследование структурных изменений в белковом и нуклеиновом компонентах тройного комплекса в районе активного центра РНК-полимеразы во время транскрипции и соотнесение их с функциональными свойствами исследуемых комплексов. В работе ставились следующие задачи:
1. С помощью метода аффинной модификации изучить подвижность З'-конца РНК продукта в активном центре фермента и определить амплитуду его движения.
2. Изучить процесс инициации с Т7 А2 промотора, выявить минимальный стабильный инициаторный комплекс и определить в нем положение 5'-конца РНК с помощью аффинной модификации.
Научная новизна и практическая ценность работы
В данной работе методом аффинной модификации удалось определить положение З'-конца РНК в активном центре РНК-полимеразы. В зависимости от природы исследуемых комплексов оно было соотнесено с ранее постулированными состояниями фермента: активно транскрибирующим, посттранслокационным, арестованным и гипертранслокационным. Обнаружено новое состояние З'-конца РНК, в котором концевой нуклеотид вывернут относительно своей комплементарной пары в составе ДНК. Установлено, что две взаимоисключающие конформации «F-мостика» существуют одновременно в одной и той же популяции молекул РНК-полимеразы Е. coli. Предложена модель регуляции транскрипции посредством конкуренции между входящим нуклеотидом, растущим концом РНК и компонентами «F-мостика». Используя направленный точечный мутагенез, получен ряд мутаций в консервативном районе G (З'-субъединицы. Выдвинута гипотеза об участии этого района в поддержании структуры «F-мостика».
Подробно изучена инициация синтеза РНК с Т7 А2 промотора, сопровождающаяся синтезом коротких стабильных РНК продуктов. На основании полученных данных предложена гипотеза инициации синтеза РНК с этого промотора по двум альтернативным путям.
Исследована фотопришивка антибиотика рифампицина к активному центру РНК-полимеразы и сделан вывод о подвижности сегмента (3-субъединицы, содержащего Hisl237. Движение этого сегмента белка может принимать участие в инициации синтеза РНК, стабилизируя и направляя вновь синтезируемый продукт.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы и 44 рисунка. Библиография включает в себя 182 названия, в том числе 5 русских и 177 иностранных.
Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Введение
Транскрипция генетической информации является одним из основополагающих процессов любой живой клетки, У большинства организмов его осуществляют ДНК зависимые РНК-полимеразы (Chamberlin, 1974). Наиболее изученной с функциональной точки зрения является РНК-пол имераза Е, coli. Будучи родственной в структурном плане РНК-полимеразам прочих бактерий, а также эукариот (Allison et al., 1985; Sweetser et al., 1987; Minakhin et al., 2001), данный фермент представляется удобной моделью для изучения процесса транскрипции в целом.
РНК-полимераза Е. coli является главным источником РНК в клетке. Еще один РНК-синтезирующий фермент - ДНК-праймаза, образует лишь короткие РНК-затравки во время репликации ДНК и не способна к поддержанию транскрипции (Bouche et al., 1975; Rowen and Kornberg, 1978; Smiley et al., 1982). Известны две каталитически активные формы РНК-полимеразы: корфермент, в состав которого входят две идентичные а-субъединицы (Мг= 36.512), р-субъединица (Мг= 150.619), р'-субъединица (Мг= 155.162), (о-субъединица (Мг= 11.000) (Burgess, 1969; Chamberlin, 1974) и холофермент, представляющий собой комплекс корфермента с одной из о -субъединиц клетки. В то время как корфермент способен поддерживать синтез РНК, только холофермент может инициировать транскрипцию на специфических последовательностях ДНК, называемых промоторами.
