Содержание к диссертации
Введение
2. ДНК-метилтрансферазы бактериальных систем рестрикции-модификации (обзор литературы) 8
2.1. Распространение систем рестрикции-модификации и днк-метилтрансфераз в природе 8
2.2. Классификация рм систем 11
2.2.1. РМ системы I типа 11
2.2.2. РМ системы II типа 12
2.2.3. РМ системы III типа 17
2.2.4. РМ системы IV типа 18
2.2.5. Одиночные ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции 18
2.3. Функции ферментов бактериальных рм систем 19
2.3.1. Обеспечение защитной функции. Рестрикция и антирестрикция 19
2.3.2. Участие ДНК-метилтрансфераз в репарации и репликации 20
2.3.3. Другие функции 21
2.4. Опероны рм систем 22
2.4.1. Расположение генов в оперонах РМ систем 22
2.4.2. Регуляция активности ферментов РМ систем II типа С-белками 25
2.5. Классификация и структура днк-метилтрансфераз 28
2.5.1. Классификация ДНК-метилтрансфераз 28
2.5.2. Пространственная структура ДНК-метилтрансфераз 32
2.5.2.1. AdoMet-связывающий домен 32
2.5.2.2. Каталитический домен 36
2.5.2.3. TRD- домен 37
2.6. Специфичность днк-метилтрансфераз 39
2.6.1. Модификация неканонических сайтов ДНК-метилтрансферазами 40
2.6.2. Метилирование ДНК-метилтрансферазами одноцепочечных субстратов 43
2.6.3. Оптимальные условия функционирования ДНК-метилтрансфераз 44
2.7. Механизмы реакций метилирования ДНК 45
2.7.1. Метилирование экзоциклических аминогрупп аденина и цитозина 45
2.7.2. Метилирование эндоциклического С5 атома цитозина 48
2.7.,3. Кинетические свойства ДНК-метилтрансфераз 49
3. Материалы и методы 57
3.1. Материалы 57
3.2. Методы 57
3.2.1. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК 57
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК 58
3.2.3. Метод селективной супрессии полимеразной цепной реакции 58
3.2.4. Определение нуклеотидных последовательностей 61
3.2.5. Определение оптимальных условий метилирования ДНК-субстратов метилтрансферазами РМ системы Bst5l 62
3.2.6. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами 62
3.2.7. Компьютерный анализ последовательностей ДНК и белков 63
4. Результаты и обсуждение 65
4.1. Определение полной нуклеотиднои последовательности оперона рм системы 55/F51 65
4.1.1. Клонирование гена &y/F5IM-3 65
4.1.2. Определение четвертой открытой рамки трансляции 66
4.1.3. Клонирование гена fo/F5IM-4 68
4.1.4. Клонирование гена &sfF5IR 69
4.1.5. Расположение генов в опероне РМ системы Bst на секвенированном участке бактериальной хромосомы 72
4.2. Экспрессия генов днк-метилтрансфераз рм системы bstfsl в клетках E.coli 73
4.3. Анализ первичных структур ДНК-метилтрансфераз 77
4.3.1. ДНК-метилтрансфераза M.i?s/F5I-3 77
4.3.2. ДНК-метилтрансфераза M.BstY5\A 79
4.4. Изучение биохимических свойств днк-метилтрансфераз 82
4.4.1. Определение цепи, модифицируемой M..5.S/F5I-3 82
4.4.2. Определение цепи, модифицируемой Ni.Bst5\-2 и M.#s*F5I-4 83
4.4.3. Сравнение субстратной специфичности ДНК-метилтрансфераз 85
4.4.4. Зависимость активности ферментов от температуры 86
4.4.5. Зависимость активности ферментов от величины рН 86
4.4.6. Зависимость активности ферментов от концентраций ионов Na+ и К+ 90
4.5. Кинетические характеристики днк-метилтрансфераз 92
4.5.1. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на полимерной ДНК 92
4.5.2. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на олигонуклеотидных дуплексах 95
4.5.3. Сравнение кинетических характеристик гомологичных ДНК-метилтрансфераз РМ систем Bst5l и Fokl 98
Выводы 103
Список литературы 104
- Функции ферментов бактериальных рм систем
- Классификация и структура днк-метилтрансфераз
- Механизмы реакций метилирования ДНК
- Определение нуклеотидных последовательностей
Введение к работе
Ферментативное метилирование ДНК, осуществляемое сайт специфическими ДНК-метилтрансферазами (в дальнейшем ДНК-метилазами или просто метилазами) является одной из наиболее интересных и актуальных проблем молекулярной биологии. За последнее время установлена важная роль этой модификации для регуляции экспрессии генов, процессов репликации и репарации в прокариотических и эукариотиоческихорганизмах, однако детальный механизм участия ДНК-метилаз в этих процессах мало изучен.
Более того, последние работы по определению первичной структуры ДНК целого ряда микроорганизмов выявили наличие в бактериальных клетках не одной (как ранее предполагалось), а целого набора генов ДНК метилтрансфераз, что поднимает вопрос о роли такого каскада метилаз для функционирования клетки.
Большинство метилаз является составной частью так называемой сайт специфической системы рестрикции-модификации (РМ системы) бактериальных клеток, обозначаемых по видовому названию микроорганизмов и состоящих, как правило, из эндонуклеазы рестрикции и ДНК-метилтрансферазы, узнающих одну и ту же последовательность нуклеотидов. Ранее было показано, что РМ система Bst 51 из Bacillus stearothermophilus 5 имеет сайт узнавания 5 -GGATG-3 , аналогичный сайту узнавания хорошо известной РМ системы Fokl из штамма Flavobacterium okeanokoites. Однако эндонуклеаза рестрикции Bst5l расщепляет ДНК иначе, чем Fokl, а оперон РМ системы Bst5l, в отличие от РМ системы Fokl, содержит, как минимум, три ДНК-метилтрансферазы. Такая множественность ДНК-метилтрансфераз с одинаковой субстратной специфичностью была обнаружена впервые, так как РМ системы, имеющие более двух ДНК-метилтрансфераз, до настоящего времени не описаны в литературе.
Целью данной работы явилось дальнейшее изучение РМ системы Bst5l, включая установление структуры всего оперона РМ системы и сравнительное исследование свойств выявленных ДНК-метилтрансфераз.
В задачи настоящего исследования входило:
- Определение структуры оперона уникальной системы рестрикции-модификации Bst5l и установление полной нуклеотидной последовательности генов ДНК-метилтрансфераз и эндонуклеазы рестрикции, входящих в эту систему.
- Экспрессия генов ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации Bst5l в клетках E.coli.
- Установление субстратной специфичности всех ДНК- метилтрансфераз системы рестрикции-модификации Bst51.
- Определение оптимальных условий функционирования ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации Bst5l.
- Сравнительное изучение кинетических свойств новых ферментов -ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации Bst5l.
Функции ферментов бактериальных рм систем
Со времени открытия РМ систем долгое время считалось, что ферментативный барьер от внедрения в бактериальные клетки фаговой ДНК - единственная функция этих ферментов. Чужеродная ДНК узнается и разрезается эндонуклеазами рестрикции по немодифицированным сайтам мишеням. Неспособность бактериофагов инфицировать определенные ф штаммы E.coli получило название "рестрикция" т.е. "ограничение". По эффективности защиты от фагового заражения бактериальные РМ системы значительно различаются. Степень инфицирования может различаться от 10 до 107 раз [97]. Количество сайтов узнавания хозяйской бактериальной эндонуклеазой в фаговых геномах коррелирует с эффективностью фагового заражения. Например, у фага Т7 E.coli количество сайтов GATC и CCWGG т на геном фага в 39937 п.о. равно 5 и 2, состветственно, а по теории вероятности 156 и 78. ф Следует отметить, что наличие РМ системы не всегда препятствует проникновению фаговой ДНК в бактериальную клетку. Некоторые основания геномных фаговых ДНК, например у Т-четных колифагов, гликозилированы, что значительно расширяет возможности фагов преодолевать рестрикционный барьер в бактериальных системах, т.к. бактериальные эндонуклеазы рестрикции, как правило, не гидролизуют Ф гликозилированную ДНК. Некоторые бактериофаги в процессе эволюции включили в свои геномы гены ДНК-метилтрансфераз, которые модифицируют остаток аденина в последовательности GATC [18]. Метилазы бактериофагов в соответствии с их защитной функцией называют "антирестрикционными". #
Биологическая роль ДНК-метилирования в процессах репарации и контроля репликации на сегодняшний момент более ясно представляется для Dam метилазы E.coli, которая модифицирует адениновое основание в последовательности GATC. Следует отметить, что одиночные метилазы или их аналоги, подобные Dam E.coli и узнающие последовательность GATC, широко распространены у бактерий [14-17]. Функционирование Dam метилаз ф, связано с системой пострепликативной репарации неправильно спаренных оснований ДНК, подобной MutHLS E.coli [98]. Метилирование нуклеотидных оснований в узнаваемых сайтах является маркером для распознавания родительской и дочерней цепей.
Статус метилирования имеет периодичность между полуметилированным и полностью метилированным состоянием. Большинство узнаваемых сайтов приводится в состояние полного метилирования за 2-4 секунды после репликации. Этот короткий интервал времени позволяет пострепликативной репарационной системе осуществить дискриминацию между двумя цепями и исправление ф решшкационных ошибок на немодифицированной дочерней цепи ДНК [98]. Кроме того, Dam метилирование E.coli тесно связано с регуляцией репликации ДНК в бактериальном клеточном цикле. Точка начала репликации - origin E.coli содержит 11 сайтов GATC, которые на протяжении 20 минут клеточного цикла сохраняют полуметилированное состояние. Эту функцию обеспечивает SeqA белок, связывающийся с origin и ф предотвращающий модификацию этого региона [99-101]. Состояние полной модификации сайтов origin включает новый цикл репликации хромосомной и внехромосомной ДНК клетки. Детальное изучение ферментов систем рестрикции-модификации W-1 привело к выводу, что метилирование нуклеиновых оснований ДНК связано и с другими важнейшими аспектами функционирования генетического аппарата прокариотических клеток, такими как, регуляция экспрессии генов и формирование структуры хроматина. Предполагается, что процессы метилирования участвуют в сегрегации хромосомы E.coli, т.к. метилазы и другие белки, связывающие ДНК, большую часть своего существования проводят в пределах нуклеоидов в ,щ состоянии взаимодействия с ДНК [102]. Показано, например, что метилаза фага Р1 участвует в правильной упаковке ДНК в фаговые головки [103]. Было выявлено, что метилирование аденина в сайтах GATC бактериального генома контролирует патогенность ряда штаммов Salmonella typhimurium [104], Escherichia coli [3], Neisseria meningitidis [105], Bordetella pertussis [106]. В настоящее время ведется поиск ингибиторов dam метилирования, как эффективных антибактериальных препаратов [107]. Щ Некоторые авторы полагают, что одна из функций метилаз состоит в защите собственной ДНК от свободных генетических элементов, таких как транспозоны, ретротранспозоны и вирусы, встройка которых в геном может привести к мутациям или летальному исходу [108-110].
Опероны РМ систем могут располагаться как на хромосомной ДНК, большинство РМ систем (Smal, Dpnll, Fokl [40,44,111]), так и на плазмидной ДНК (Llal, PvuU, coP15I [112-114]). В РМ системах I типа каждая субъединица кодируется одним геном. Как правило, с одного промотора транскрибируются гены hsdM и hsdS как единый оперон, а с другого - ген hsdR. Для наиболее изученных РМ систем Ш типа, таких как Есо?11 и Есо?\51, показано, что транскрипция генов res и mod идет с одного промотора как единой транскрипционной единицы [82]. В то же время, в расположении генов РМ систем П типа наблюдается большое разнообразие (таблица 2.2.). Клонирование генов и их биохимическое изучение позволили расширить знания о структуре оперонов РМ систем П типа. Помимо известных генов ДНК-метилтрансферазы, эндонуклеазы рестрикции или S-субъединицы, в составе оперона иногда присутствует такой элемент как контрольный белок, или С-белок (controller) [115].
Классификация и структура днк-метилтрансфераз
ДНК-метилтрансферазы катализируют перенос метильной группы от универсального донора S-аденозил-Ь-метионина (SAM) в определённое положение основания ДНК в составе специфической последовательности с образованием метилированного ДНК-продукта и 8-аденозил-Ь-гомоцистеина (SAH). По типу катализируемой реакции метилтрансферазы подразделяют на два класса: 5тС-цитозинметилазы и аминометилазы, которые в свою очередь подразделяются на ЫбтА-аденинметилазы и Н4тС-цитозинметилазы [121,122]. ЫбтА-аденин и К4тС-цитозинметилазы переносят метильную группу с SAM на экзоциклическую аминогруппу, а 5тС-цитозинметилазы модифицируют эндоциклический атом углерода в 5-ом положении цитозинового кольца (рисунок 2.1.). Перенесенные метальные группы во всех случаях оказываются расположенными в большой бороздке двойной спирали ДНК, которая в В-форме этого биополимера является наиболее доступной областью для эффективного распознавания последовательности нуклеотидов путем образования водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Аминометилазы широко распространены у одноклеточных микроорганизмов, бактериофагов и низших эукариот, тогда как у эукариот обнаружено только 5тС-метилирование. На сегодняшний день большое число секвенированных генов метилаз позволило провести множественное выравнивание и сравнительное изучение структур ферментов. Сравнение первичных последовательностей ДНК-метилтрансфераз выявило существенное сходство определенных аминокислотных участков, так называемых "консервативных мотивов" (СМ - conserved motifs), внутри каждой из этих групп метилаз.
Показано, что все 5тС-метилазы содержат набор из десяти последовательных консервативных блоков аминокислотных остатков (1-Х) и домена TRD (target recognition domain), выполняющего функцию сайт-специфического узнавания [39,123,124]. Одна из общих классификаций для аминометилаз была предложена Malone с соавт. [125]. При сопоставлении последовательностей 42-х аминометилаз (ЫбтА-метилаз и Ы4тС-метилаз) было выявлено девять консервативных мотивов, структурно подобных 9-ти из 10-ти консервативным участкам 5тС-метилаз, которые формируют три функциональных домена: AdoMet-связывающий, каталитический и TRD. В основу данной классификации положено сходство первичных структур и взаимное линейное расположение основных доменов. Комбинации расположения доменов относительно друг друга дают основание для классификации метилтрансфераз на 6 классов: а, Р, у, с, 5, С, , причем группа 5тС-метилаз однородна и составляет у класс, а ЫбтА-метилазы и N4mC-метилазы не формируют отдельных групп по структурным мотивам (рисунок 2.2.). Степень консервативности аминокислотных мотивов внутри каждого класса очень высока, хотя и имеется некоторая вариабельность за счет замен аминокислот с подобными свойствами. В аминометилазах не обнаружен аналог IX мотива 5тС-метилаз [126]. Ферменты разных классов отличаются по молекулярной массе: а - небольшие метилазы 260-334 а.к. остатков, у крупные 325-580 а.к. остатков, (3 - разные 228-531 а.к. остатков.
Достаточное разнообразие узнаваемых метилазами последовательностей можно упорядочить. В группе а ЫбтА-метилазы узнают последовательность (C/G)MN(0-2)T(G/C), где М(А/С); 14 из 17 метилаз группы (3 узнают (G/C)N(0. 3)MN(0-2)(G/C) и 11 из 12 в группе у - TNNA, исключением в данном случае является M.EcoRl (GAATTC). Группы є, 8, С, по данным Malone с соав. считались гипотетическими. За последние два года охарактеризованы представители класса С, M.7voORF1413P из Thermoplasma volcanium [127] и M.BcnlA из Bacillus centrosporus [128], а также класса 5 - M.MvvoI из Methanobacterium wolfei [129]. Интересным является тот факт, что M.Vspl, M.CfrBl и M.BamYft. на N-проксимальном конце имеют протяженный участок более 100 аминокислотных остатков до первого консервативного мотива, который теоретически может считаться TRD. В этом случае M.Vspl можно отнести как в класс у, так и в класс є, а M.CfrBl и М.ВатШ в класс Р или є. В настоящее время для ДНК-метилтрансфераз так же используется классификация, предложенная KJimasauskas с соавторами [130,131]. Два основных консервативных мотива СМ I и СМ IV (ранее он обозначался как II) в первичной структуре аминометилаз могут изменять свой порядок относительно друг друга, что отражается в индексе обозначения класса - "12" или "21". Название классу дает аминокислота в первой позиции консервативного мотива (D/N/S)PP(Y/F/W) для аминометилаз и G(P/F)PC для цитозиновых метилаз. D2 и S12 соответствуют по Malone классу a, D2i и S2i класу Р, a N!2 соответствует классу у. Представители класса N2] не обнаружены. Методом рентгеноструктурного анализа установлена пространственная структура для некоторых ДНК-метилаз, в основном из РМ систем II типа: Hhal [132-134], Haelll [135], Taql [136,137], Pvull [138], DpnM [139], Rsrl [140] (рисунок 2.3.). Несмотря на различное линейное расположение консервативных мотивов, все ферменты имеют значительное сходство в общей пространственной структуре. Характер укладки определенных элементом вторичной структуры образует внутреннее ядро (кор), общим элементом которого является семискладчатый (3—слой, в котором одна 3 цепь ((37) имеет антипараллельное направление.
Схематично семицепочечное ядро можно обозначить как 6] 1[ 5] А] \] 2\ 3 [141], где каждая (3-складка чередуется ос-спиральными элементами, участвующими как в формировании активных сайтов, так и в формировании общей пространственной структуры пептидного скелета метилаз (рисунок 2.4.). Интересно отметить, что универсальная структура центрального ядра метилаз характерна и для других ферментов, таких как катехол-О-метилаза [142], глицин-1Ч-метилаза [143], протеиновая метилаза CheR [144], мРНК-КЭП-метилаза VP39 [145], переносящих метильную группу с AdoMet на строго определенный атом соответствующего субстрата. Предполагается, что высокая консервативность третичной структуры коровых элементов говорит об их общем эволюционном происхождении [146]. AdoMet-связывающий домен формируется консервативными мотивами I, II, III, X. (рисунок 2.5.). Мотив I (FxGxG) аминометилаз формирует вторичную структуру [31 -петля- аА, где Gly корового триплета участвует в связывании метионина молекулы SAM, однако в структуре
Механизмы реакций метилирования ДНК
На сегодняшний день механизм метилирования аминогрупп аденина и цитозина ДНК-метилтрансферазами изучен недостаточно хорошо. Структура комплекса фермент-ДНК для адениновых метилаз получена только для M.Taql [195]. Согласно предложенному механизму (рисунок 2.6.) метильная группа SAM переносится в положение К6-аденина с образованием каталитически компетентного тройного комплекса ДНК-метилаза-SAM через образование промежуточного соединения - положительно заряженного иона Ы6-метиламмонийаденина [196-198]. Предполагается, что для этого требуется отрицательная поляризация атомов N4C или N6A, которая может создаваться в результате образования водородных связей между протонами экзоциклической аминогруппы и аминокислотными остатками пролина и аспарагина СМ IV аминометилаз [138]. Возникающая при этом отрицательная поляризация экзоциклического атома азота облегчает последующий перенос метильной группы с SAM. Механизм метилирования несколько изменяет классическое понимание строения ДНК спирали вследствие ее локального изменения при модификации. При изучении комплекса M.Hhal со специфической ДНК [195], а также комплексов M.Taql и М.НаеШ с короткими обнаружен так называемый эффект выворачивания Й [195], т.е. Щ внеспиральное расположение модифицируемого основания (рисунок 2.7.).
Основание-мишень в этом случае выворачивается на 180Й из двойной спирали ДНК с разрывом межнуклеотидных водородных связей через малую бороздку в каталитический карман фермента. Вследствие такого выворачивания & два реагента, разделенные достаточным расстоянием о ( 15Й), приводятся в непосредственную близость для осуществления акта щ катализа [197,199]. Взаимодействие между Туг (СМ IV), Phe (СМ VIII) и гидрофобными боковыми группами (СМ VI) каталитического сайта с одной стороны и атомами гетероцикла вывернутого основания-мишени с другой стороны задают строго определенную ориентацию при прямом переносе метильной группы. Интересный факт был описан Reinisch с соавт. [135] при изучении комплекса М.Т/яеШ-ДНК. Неправильно спаренный тимин ДНК легче принимает внеспиральное положение и хотя не проникает глубоко в каталитический карман и не образует консервативных связей с аминокислотными остатками активного центра, он образует гиброфобный Щ контакт с аденозилом SAM. Этим объясняется факт более прочного связывания с ДНК, где сайты узнавания содержат неправильно спаренные основания вместо модифицируемого [200,201]. Для идентификации конформационных изменений основания-мишени применяется метод флуоресценции, когда в сайте узнавания модифицируемый остаток аденина замещается на его флуоресцирующее производное 2-аминопурин, квантовый 4 выход которого резко возрастает при разрыве межнуклеотидных взаимодействий в ходе " выворачивания" [202-204]. Эффект " выворачивания" был обнаружен в ДНК при действии таких ферментов как Т4 эндонуклеаза V [205], эндонуклеаза IV [206], урацил ДНК-гликозилаза человека [207], а также некоторых ферментов репарации [208].
В отличие от N-метилаз, каталитическая реакция метилирования эндоциклического С5 атома цитозина изучена более детально и установлен следующий механизм катализа (рисунок 2.8.) [39,209,210]. Согласно этому механизму, рассмотренному на примере M.Hhal [211,212], С6 пиримидинового кольца цитозина подвергается нуклеофильной атаке сульфгидрильной группой Cys 81 консервативного мотива IV, что приводит к Ц разрыву двойной связи С5=С6 и образованию ДНК-белкового комплекса через временную ковалентную связь с Сб. При этом возникающий отрицательный заряд в С5 положении цитозина дает возможность взаимодействовать с электрофилом - метильной группой SAM с последующим замещением. Для облегчения этой нуклеофильной атаки возможно используется протонирование атома N3 отрицательно заряженной боковой цепью другого аминокислотного остатка (G119 СМ VI), что приводит к оттягиванию отрицательного заряда с атома С5. Эта же кислотная группа вместе с карбоксильной группой того же аминокислотного остатка образуют водородные связи с атомом N4 основания, в то время, как атом 02 образует водородную связь с положительно заряженной группой другого остатка R165 мотива СМ VIII. После метилирования атома С5 происходит удаление с него протона и разрыв связи S-C6. Такие промежуточные ковалентные комплексы метилаза-ДНК изучены для Hhal [213], НаеШ [209], ЕсоШ\ [214], EcoDam [215].
Определение нуклеотидных последовательностей
Нуклеотидную последовательность гена bstF5IM-3 определяли методом Максама и Гилберта [258,259]. ПЦР-продукты, полученные методом селективной супрессии полимеразнои цепной реакции, секвенировали с использованием набора BigDye TCSK ("Qiagen GmbH", Германия) на автоматическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer ("РЕ Applied Щ) Biosystems", США) в соответствии с указаниями фирмы-производителя. #) Влияние различных температур, рН и концентраций ионов К+ и Na+ на активность метилаз определяли в реакциях метилирования ДНК фага X (dam-, dcrrf) по количеству включенных [3Н-СН3]-групп. Реакционный буфер содержал: 100 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0.2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 5% глицерина. Влияние температуры на активность ДНК-метилтрансфераз изучали в диапазоне от 25 до 65С. Подбор оптимальной величины рН проводили в диапазоне значений от 4 до 11. Для определения солевых условий использовали три концентрации NaCl и КС1: 50, 100 и 150 мМ в реакционном буфере, а также стандартный буфер без добавления солей для контроля. Концентрация SAM составляла 5 мкМ, концентрации ферментов M.BstF5l-\, M.#s/F5I-2, M.&S/F5I-3 и M.Bst5l-4 составляли 12 нМ, 8 нМ, 90 нМ и 57 нМ, соответственно. Значение рН подбирали оптимальным для каждого фермента. Время реакции - 20 минут.
Подсчет радиоактивности производили как описано в пункте 3.2.7. Использовали стандартную методику регистрации переноса метилтрансферазой на ДНК-субстрат от S-аденозил-Ь-метионина радиоактивно меченой СН3-группы. Реакции метилирования проводили при 55С, а для M.#s/F5I-3 и при 60С. Реакционная смесь для проведения
реакции метилирования содержала 100 мМ Трис-HCl (значение рН подбиралось оптимальным для каждой метилазы), 1мМ EDTA, 1 мМ ДТТ, 0.2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 5% глицерина. Конечный объём реакционной смеси, концентрации субстратов и фермента варьировали в зависимости от условий эксперимента. Время подбирали таким образом, чтобы обеспечить измерение начальных скоростей реакций.
В качестве субстрата использовали ДНК фага X, а при расчете концентраций концентрации участков метилирования б -ОСАТО-З /З -САТСС-З , получаемые умножением молярной концентрации ДНК на число потенциальных участков модификации (150 сайтов узнавания на молекулу ДНК фага X). Через определенные интервалы времени из реакционных смесей отбирали аликвоты и наносили на фильтры DE81 ("Whatman", 1x1 см). Для учёта слабой фоновой радиоактивности, обусловленной остаточным количеством (после процедуры отмывки фильтров) неспецифически сорбированного [3H-CH3]-SAM, параллельно наносили на фильтры аликвоты аналогичных смесей, в которых отсутствовал фермент. Фильтры промывали трижды раствором 0.02 М NH4HCO3, дважды водой и один раз 75% этанолом, после чего фильтры высушивали и считали их
Н-радиоактивность в толуольном сцинтилляторе при помощи счетчика радиоактивности " Searle Mark III". Расчётные концентрации [3Н-СН3]-групп, включенных в ДНК, в пределах 5-8% совпадали с концентрацией остатков дезоксиаденозина, способных метилироваться. Эксперименты повторяли не менее 2 раз. Для выявления открытых рамок трансляции использовалась программа Vector NTI v.4.10. (InforMax, Inc.). Поиск гомологичных белковых последовательностей проводился по базам данных Swiss-Prot и TrEMBL с использованием программы BLASTp-2 с параметрами по умолчанию (http://www.expasy.org/tools/blast). Для множественного выравнивания аминокислотных последовательностей использовали программу CLUSTALW v. 1.74 [260] с параметрами по умолчанию (http://www.ebi.ac.uk/clustalw).
