Содержание к диссертации
Введение
1. Конформационные свойства глобулярных еежов 11
1.1. Принципы организации и стабилизации структуры 11
1.2. Круговой дихроизм 18
1.2.1. Определение вторичной структуры из спектров 20
1.2.2. Спектры в ближней УФ-области 25
2. Круговой дихроизм ингибиторов протеаз и их комплексов с протеиназами 32
2.1. Вторичная структура 34
2.2. Третичная структура 47
2.3. Свойства комплекса ингибитор-протеиназа 57
Материалы и методы исследования 68
1. Материалы 68
2. Спектрофотометрические измерения 69
2.1. Спектры КД и спектры поглощения 69
2.2. Собственная флуоресценция 71
2.3. Флуоресценция зонда 71
3. Гель-хроматография 72
4. Седиментационный анализ 73
5. Электрофорез в полиакриламидном геле 73
6. Изоэлектрофокусирование в геле 74
7. Диссоциация комплекса фермент-ингибитор 74
8. Ограниченный протеолиз 75
9. Восстановление дисульфидных связей 75
10. Оцределение содержания сульфгидрильных групп 76
11. Модификация остатков лизина 76
12. Модификация остатков аргинина 77
13. Модификация остатков тирозина 77
14. Определение ингибиторной активности 79
1. Сравнительный анализ конформацйи ингишторов протеаз из фасоли и картофеля 81
1.1. Конформация нативных молекул ингибиторов 82
1.2. Влияние денатурирующих агентов на конформацшо ингибитора из фасоли 86
1.3. Влияние денатурирующих агентов на конформацию ингибитора из картофеля 87
1.4. Флуоресцентные свойства ингибиторов 92
2. Особенности превращений образовании фенлент-ингибиторных комплексов 99
2.1. Взаимодействие химотрипсина с нативными ингибиторами из фасоли и картофеля 100
2.2. Взаимодействие химотрипсина с ингибитором из картофеля, модифицированным с помощью ограниченного протеолиза 105
2.3. Связывание флуоресцентного зонда с комплексом химотрипсин-ингибитор из картофеля 106
3. Природа комплексов ингибитора из картофеля с протеиназами . 110
3.1. Физико-химическая характеристика 111
3.2. Стехиометрия взаимодействия 114
3.3. О взаимосвязи структуры и функции 119
4. Влияние модификации функциональных груш ингибитора из картофеля на его взаимодействие с протеиназжи . 122
4.1. Восстановление дисульфидных связей 123
4.2. Модификация остатков основных аминокислот -аргинина и лизина 125
4.3. Модификация остатков тирозина 131
Заключение 139
Выводы 145
Литература 147
- Определение вторичной структуры из спектров
- Конформация нативных молекул ингибиторов
- Взаимодействие химотрипсина с нативными ингибиторами из фасоли и картофеля
- Модификация остатков основных аминокислот -аргинина и лизина
Введение к работе
Белки являются незаменимым компонентом живой материи, они определяют природу основных явлений жизнедеятельности, начиная с ферментативного катализа и кончая процессами мышечной деятельности и нервной проводимости. Белки замечательны тем, что служат не только главным строительным материалом клетки, но и являются регуляторами всех клеточных процессов /12/. Среди белков, выполняющих регуляторную функцию, большое внимание исследователей привлекают ингибиторы протеолитических ферментов. Интерес к этой группе белков обусловлен в первую очередь важностью их физиологических функций. Многочисленными работами доказано участие ингибиторов протеаз в регуляции таких процессов как свертывание крови, оплодотворение, секреция белковых веществ - ферментов, гормонов, токсинов, белков плазмы крови и т.д. /66,186,203/. В живом организме ингибиторы могут играть роль защитных агентов, предохраняя белковые вещества клетки от разрушения протеолити-ческими ферментами /82/. Известно, что овоингибитор, присутствующий в яичном белке птиц, является эффективным ингибитором микробных протеаз /67/. В семенах фасоли имеется белок-ингибитор, способный подавлять активность протеаз патогенного гриба Coiie-totrichum lindemuthianum /148/. Важное физиологическое значение ингибиторов протеаз подтверждается тем, что их недостаток может приводить к тяжелым заболеваниям животных и человека. Имеются данные, что нарушение равновесия между протеолитическими ферментами и их ингибиторами является одним из факторов, способствующим злокачественному росту клеток /56/.
Кроме ингибиторов протеаз, известны ингибиторы других ферментов, относящихся к классу гидролаз, например, ингибиторы
липазы и фосфолипазы, инвертазы, дезоксирибонуклеазы, рибонуклеази /22,97,140/.
Специфические вещества, способные действовать как ингибиторы протеолитических ферментов, обнаружены во всех исследованных тканях животных и растений, а также фякроорганизмов /166/. Подавляющее большинство природных ингибиторов протеаз составляют вещества белковой природы. Особенностью этой группы белков является высокая устойчивость к денатурации и протеолитическому расщеплению /12,126/. Поскольку протеолитическому расщеплению подвергаются преимущественно молекулы денатурированных белков, то можно предположить, что устойчивость к денатурации является важным свойством ингибиторов протеаз, непосредственно связанным с их функциями. Как известно, биологические функции белков определяются пространственным строением их молекул, поэтому изучение тонкой структуры белков-ингибиторов, с одной стороны, важно для понимания общей устойчивости белков к денатурации и протеолитическому расщеплению, а с другой стороны, представляет интерес с точки зрения эволюции структуры и функции белковых макромолекул.
Механизм действия белковых ингибиторов включает образование стабильных комплексов с ферментами, характеризующихся низкими константами диссоциации /198/. Комплексы представляют собой белок-белковые соединения, устойчивые при физиологических условиях рН, в связи с этим систему фермент - ингибитор можно рассматривать как удобную модель для изучения высокоспецифических белок-белковых взаимодействий. Следует подчеркнуть, что ключом к пониманию механизма действия белков]ингибиторов служит выяснение детального строения их макромолекул.
В настоящее время исследование пространственной структуры белков представляет собой, пожалуй, наиболее сложную и наименее
_ 7 -
разработанную проблему. Это объясняется, с одной стороны, сложностью конформапионного анализа гибких полипептидных цепей и, на первый взгляд, отсутствием у них достаточно выраженных предпочтительных ориентации. С другой стороны, при изучении белковых макромолекул встречаются трудности в использовании ряда физических, в частности, спектральных методов, поскольку сигналы от множества родственных группировок "сливаются" в один общий сигнал, который не всегда удается расчленить даже при довольно высокой разрешающей способности приборов /32/. Поэтому определение тонкой пространственной структуры белков в водном растворе, т.е. в условиях, в которых белки проявляют свои биологические функции, пока еще представляет исключительно сложную задачу, решаемую лишь в отдельных случаях при комплексном использовании новейших физико-химических методов.
Прямым методом исследования структуры белков является рентгенографический метод. Именно с помощью этого метода впервые были идентифицированы ^-спираль и J> -структура /17/. Метод рентгеноструктурного анализа позволяет определить полные трехмерные конфигурации ряда белковых молекул вплоть до координат отдельных атомов, однако это касается лишь кристаллического состояния, т.е. статической конформации белка. Выше подчеркивалось, что наиболее ценной является информация о динамических конформа-ционных состояниях белковой макромолекулы в растворе, коррелируемых с ее биологической функцией. Поэтому сейчас широко применяются несравненно более простые методы оптики и спектроскопии, дающие косвенную информацию о структуре, но позволяющие исследовать белки в растворах. Помимо простоты, преимущество оптических методов состоит в возможности использования малых количеств веществ и быстром получении результатов.
В зависимости от подхода все оптические методы можно разделить на две группы. Первая группа включает методы, использующие спектральные и оптические свойства самих белков. В частности, на этом принципе основаны методы спектрополяриметрии - круговой дихроизм и дисперсия оптического вращения - и спектрофотометрия в инфракрасной, видимой и ультрафиолетовой области /2,37/. Вторая группа методов применяет специальные зонды - атомы и атомные группы, обладающие выразительными оптическими характеристиками, среди которых наибольшую популярность приобрели флуоресцентные и парамагнитные зонды /13,16/.
Опыт работы с белками и полипептидными соединениями, накопленный за последние годы, позволил довольно точно определить границы применения различных методов. Ценную информацию о вторичной структуре ряда белков удалось получить с помощью метода дисперсии оптического вращения. Метод ИК-спектроскопии успешно применяется для изучения подвижности в белках и полипептидах /37/. Метод имеет большую чувствительность к j3~ складчатой структуре полипептидной цепи. В этом смысле он является прекрасным дополнением к методу дисперсии оптического вращения, с помощью которого можно количественно оценить содержание oi -спиралей в макромолекуле /15/. Ограничения в использовании Щ-спектро^ скопии связаны, главным образом, с методическими трудностями. ИК-спектры большинства биологических объектов наиболее просто получить в твердом виде, хотя возможно проведение измерений и в виде растворов.
Ряд специальных вопросов пространственного строения был успешно разрешен на основе люминесцентных методов. Методы собственной люминесценции широко используются для изучения структур-
«- у —
ных и динамических характеристик белковой молекулы. С помощью флуоресцентных зондов можно определить размеры и форму белковой молекулы, регистрировать небольшие конформационные перестройки, важные для функционирования белка. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), дающая уникальную информацию о поведении отдельных функциональных групп белка в растворе в условиях, близких к нативным, представляет собой необходимое дополнение к методу рентгеноструктурного анализа /16/.
В исследованиях четвертичной структуры сложных белков все большее значение приобретают нейтронографические методы и метод электронной микроскопии /36/. Эти методы широко применяются при изучении механизмов образования таких сложных функционирующих надмолекулярных структур, как рибосомы, митохондрии, вирусы, жгутики бактерий и т.д.
Способность к ассоциации обнаружена у ряда природных инги
биторов протеаз, однако их молекулы никогда не образуют крупных
белковых агрегатов. Одни белки-ингибиторы присутствуют в раст
воре в виде равновесной смеси мономер . - димер или мономер ~
~ димер = тример /86,91,143,174/, другие образуют четвертичную структуру /141,190/. У большинства ингибиторов протеаз функционально активной является молекула, состоящая из одной полипептидной цепи и поэтому при изучении пространственной структуры белков-ингибиторов особого внимания заслуживают методы определения вторичной и третичной структур белков в растворе. В настоящее время практически единственным, кроме рентгеноструктурного анализа, широко доступным методом, позволяющим получать информацию о количественном содержании о<-, /- и неупорядоченных структур в белках является метод кругового дихроизма /2/.
В представленной диссертационной работе методом кругового дихроизма исследована конформапия двух белков-ингибиторов, выделенных из семян фасоли и клубней картофеля. Оба ингибитора характеризуются высоким содержанием дисульфидных связей, но в отличие от ингибитора из фасоли ингибитор из картофеля имеет четвертичную структуру и содержит в 1,5 раза больше остатков гидрофобных аминокислот /20/. В связи с этим в сравнительном аспекте изучено влияние денатурирующих агентов на конформацию ингибиторов, охарактеризованы их флуоресцентные свойства и способность связываться с флуоресцентным зондом. Методом кругового дихроизма изучены особенности взаимодействия .с протеиназами. Получены данные, позволившие сделать вывод о том, что взаимодействие ингибиторов с химотрипсином сопровождается локальными конформационными изменениями, затрагивающими, главным образом, молекулу ингибитора. Дан детальный анализ состава комплексов, образуемых димерной молекулой ингибитора из картофеля с ферментами. Проведена химическая модификация отдельных функциональных групп в молекуле ингибитора из картофеля с целью выяснения их участия в ассоциации субъединиц и проявлении ингибиторной активности.
В литературном обзоре рассмотрены вопросы, касающиеся принципов организации и стабилизации глобулярных белков. Специальный раздел посвящен анализу метода кругового дихроизма, позволяющего изучать пространственную структуру белков. Особое внимание уделено имеющимся в литературе данным по макромолеку-лярному строению белков-ингибиторов сериновых протеаз. Изложены современные представления о механизме образования фер-мент-ингибиторных комплексов.
- II -
Определение вторичной структуры из спектров
Биологические функции белков, в том числе и белков-ингибиторов, определяются пространственным строением их молекул. Имеющиеся в литературе данные относительно размеров и формы белков-ингибиторов позволяют отнести их к классу глобулярных белков. В связи с этим целесообразно рассмотреть вопросы, касающиеся структуры глобулярных белков, принципов их стабилизации и самоорганизации.
Линдерштрем-пДанг /134/ предложил схему, согласно которой структура глобулярных белков делится на первичную (последовательность аминокислотных остатков, ковалентно связанных между собой в полипептидной цепи), вторичную (расположение водородных связей между группами кн и со), третичную (упаковка полипептидной цепи в компактную глобулу) и четвертичную (способ расположения двух и более полипептидных цепей относительно друг друга).
Исследования, проведенные в течение трех последних десятилетий позволили установить ряд общих положений, характеризующих специфику пространственной упаковки полипептидных цепей. Прежде всего считается доказанным, что первичная структура полностью детерминирует пространственную структуру белка любой степени сложности. Это означает, что топология укладки полипептидной цепи не требует никакой специальной генетической информации и полностью предопределена последовательностью аминокислот в цепи. Достаточно веским экспериментальным доказательством могут служить факты обратимой денатурации белков. В частности, такая денатурация была осуществлена в лаборатории Анфинсена для ряда белков - рибонуклеази, трипсина, лизоцима - в условиях, близких к физиологическим /41/. Во-вторых, было установлено, что пептидная связь нн-со имеет планарную транс-конфигурацию. И наконец, было показано, что для соединений пептидно-белковой природы характерно наличие определенных упорядоченных пространственных структур, реализуемых в соответствующих условиях. Термин "вторичная" структура объединяет все типы упорядоченных структур, встречающиеся в белках. Наиболее известными из них являются d-спираль, и ju-структура. В модели ь-спирали, предложенной Полингом и Кори /158/, на один виток приходится 3,6 аминокислотных остатка. Средняя длина спирального участка в нативной глобуле составляет 10-15 остатков /18/. Форма с -спирали такой длины близка к сферической. -спираль стабилизуется водородными связями, связывающими каждую группу СО с группой 2Ш, четвертой по счету от нее мономерной единицы. Такая система водородных связей придает -спирали особую устойчивость и поэтому oi -спираль характеризуется весьма плотной внутримолекулярной упаковкой без каких-чпибо пустот. Кроме d-спирали экспериментально было доказано существование спирали 3JQ /7/. Теоретически возможны и другие способы спиральной упаковки полипептидной цепи, однако из всех возможных форм -спираль является наиболее стабильной, так как обеспечивает образование максимального числа водородных связей и внутримолекулярных контактов, особенно между гидрофобными группами.
Другими элементами вторичной структуры являются jS-участки с параллельной и антипараллельной ориентацией вытянутых полипептидных цепей, скрепленных внутри- и межцепочечными водородными связями /3/. Если о -спираль образуется путем поворота мономерной единицы на 100 вокруг оси, то /-структура возникает в результате зигзагообразной укладки голипептидной цепи. Способность к образованию вторичной структуры тесно связана с полярностью боковой R-группы: почти все гидрофобные остатки стабилизуют и / -структуру, а почти все короткие гидрофильные и все заряженные остатки (а также глицин и пролин) дестабилизуют как с -, так и J -структуру; остатки же, состоящие из длинной гидрофобной цепи и полярной, но незаряженной головки занимают промежуточное положение. Например, полилизин образует -спираль при рН 12,0, когда его R -группы не несут никакого заряда. Полиглицин также способен образовывать « -спираль, но в большей степени он стремится принять /-конформацию, при которой цепь находится в относительно растянутом состоянии. Тип вторичной структуры, образованной в каждом гидрофобном участке цепи, определяется природой входящих в него гидрофобных групп и их распределением в цепи. Если в цепи гидрофобные группы занимают положение 1-3, то образуется преимущественно j -форма. Способности аминокислотных остатков к образованию /-структуры значительно более специфичны, чем их способности к образованию х-спиралей. Известно, что остатки ароматических аминокислот имеют тенденцию встраиваться в / -структурные участки /3/.
Кроме J, -спиральных и /-структурных участков в белковой молекуле имеется заметное количество /-изгибов /4,61/. Венка-тачалам первый охарактеризовал 15 возможных типов /-изгибов в глобулярных белках /191/. Льюис и соавт. /133/, сгруппировав все типы /-изгибов, выделили три основные класса, отличающиеся по величине двугранных углов внутреннего вращения в основной цепи (-С-к-связь) и (С-С-связь). Изгиб образован тетра-пептидом, в котором СО-группа первого остатка связана водородной связью с ин-группой четвертого остатка. В отличие от -спиральных и ]ь-структурных участков, состоящих главным образом из остатков гидрофобных аминокислот, соединяющие их -изгибы и петли, обогащены короткими полярными группами, заряженными группами, глицинами и пролинами, поэтому /-изгибы называют факторами инициации и терминации -спирали и ju-слоя /61/.
Наряду с регулярными структурами полипептидная цепь включает участки гибкой, изменяющейся, статистически неупорядоченной структуры, называемой иначе "беспорядочным клубком". Например, полилизин при рН 5,7 принимает конфигурацию "беспорядочного клубка".
Третичная структура характеризует способ сворачивания полипептидной цепи, содержащей регулярные и нерегулярные участки, в компактную глобулу.
Конформация нативных молекул ингибиторов
Среди растений, используемых в пищу, особенно богаты ингибиторами протеаз некоторые виды фасоли и картофеля. В лаборатории белковых регуляторов метаболизма Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР были разработаны методы выделения двух ингибиторов растительного происхождения - ингибитора из картофеля (белок с pi 7,3) и ингибитора из фасоли (белок с pi 4,7), изучены их физико-химические свойства и специфичность /23,25,27/. Показано, что оба белка весьма устойчивы к воздействию денатурирующих агентов. Устойчивость к денатурации, как отмечалось в литературном обзоре, является важным свойством ингибиторов, непосредственно связанным с их функцией, и по всех вероятности, обусловлена особенностями пространственной организации их молекул.
Оптическими методами широко изучались конформационные свойства низкомолекулярных ингибиторов типа ингибитора Баумана-Еирк, выделенных из разных видов бобовых растений. К этому семейству ингибиторов по-видимому, принадлежит исследуемый ингибитор из фасоли. О конформации ингибиторов, выделенных из картофеля и других растений из семейства пасленовых, практически ничего неизвестно.
Настоящая глава посвящена изучению конформации двух ингибиторов, выделенных в лаборатории из клубней картофеля и семян фасоли, путем измерения спектров КД и флуоресценции.
В дальней УФ-области спектры КД двух ингибиторов сходны. Спектр ингибитора из фасоли характеризуется наличием отрицатель-ной полосы с экстремумом при 203 нм ( [9] оз = -Ю2000+400) (рис.7). В спектре ингибитора из картофеля, представленном на рис.8 наблюдается отрицательная полоса такой же интенсивности, но при 198 нм ( [9] jgg = -10400+500). Отсутствие отрицательного дихроизма около 209 и 222 нм указывает на низкое содержание или даже полное отсутствие в ингибиторах Л-спиральных участков. Согласно расчетам, проведенным по методу Чена /60/, в ингибиторе из фасоли содержится 4-7$ (-спиральных участков и 2Ь% ь-формы, в ингибиторе из картофеля о -спиральные участки полностью отсутствуют, а на долю J -структуры приходится 30$. На основании полученных данных можно заключить, что доминирующим типом структуры в обоих ингибиторах является конформация "неупорядоченного клубка". Для правильной интерпретации спектров Щ ингибиторов в ближней УФ-области их сравнивали со спектрами поглощения, представленными на рис.9.
В ближней УФ-области спектр Щ ингибитора из фасоли имеет две широкие полосы примерно одинаковой интенсивности - положительную с центром 248 нм ( [9] 248 = І90±10) и отрицательную с центром около 280 нм ( [0] 2QQ -220+10). Кроме того, имеется еще небольшой отчетливый максимум при 234 нм ( [9] 034г 130+5) (рис.7А, кривая I). Зная, что в ингибиторе из фасоли отсутствует триптофан, но имеется I остаток тирозина, 7 s-s связей и 2 остатка фенилаланина /27/, можно предположить, что отрицательная полоса в области 270-310 нм обсусловлена комбинацией дисульфид-ных связей, остатков фенилаланина и остатка тирозина, неионизованная форма которого, по-видимому, определяет полосу при 234 нм. Положительная полоса около 248 нм, вероятнее всего, обусловлена дисульфидными связями. Спектр в целом близок к спектрам КД ингибиторов типа ингибитора Баумана-Еирк /78,94,113,207/.
Ингибитор из картофеля имеет невыразительный спектр Щ в ближней УФ-области, хотя нативная молекула содержит 14 дисуль-фидных связей и 16 остатков тирозина. Обращает на себя внимание положительная полоса около 230 нм ( [8] 230= 2500+250) (рис.8, кривая I). Наличие этого максимума может быть связано с тем, что остатки тирозина и фенилаланина, присутствующие в белке, образуют -структуру. По имеющимся данным, остатки ароматических аминокислот имеют тенденцию встраиваться в jt -структуру, которая обуславливает положительный дихроизм при 231 нм /3/.
В соответствии с методом Стрикланда /180,181/, позволяющим выявить вклад остатков тирозина, было показано, что сдвиг рН в щелочную сторону сопровождается изменениями спектра Щ ингибитора из фасоли. Наблюдается уменьшение максимума при 234 нм, который практически полностью исчезает при рН 11,4 (рис.7 Б, кривые 2,3,4). Одновременно происходит увеличение интенсивности полосы при 248 нм. Такие изменения в спектре Щ ингибитора из фасоли свидетельствуют об ионизации остатков тирозина. Полное исчезновение максимума при 234 нм (рН 11,4) указывает на поверхностное расположение остатка тирозина в молекуле ингибитора из фасоли. Кратковременная инкубация ингибитора в щелочной среде (рис.7 А, кривая 3) не вызывает каких-либо заметных изменений его спектров КД. В то же время продолжительное выдерживание (24 ч) при рН 12,4 приводит к денатурации белка (рис.7 Б, кривая 5). Как показали измерения спектров КД, конформация ингибитора не претерпевает серьезных изменений в кислых условиях (рН 2). Подобно многим ингибиторам протеаз из растений ингибитор из фасоли устойчив в кислой среде.
В присутствии іуанидинхлорида (3,5 М и 5 М) наблюдается увеличение интенсивности полосы при 234 нм и некоторое снижение интенсивности максимума в области 280 нм (рис.10). Аналогичный характер изменений спектров КД имел место при действии мочевины и гуанидинхлорида на ингибитор Баумана-Бирк /ИЗ/. Эти изменения, возможно, являются следствием локальных изменений в окружении остатка тирозина в белке. Не наблюдалось существенных изменений конформации ингибитора также в присутствии DS-Na вплоть до концентрации детергента, равной 3% (0,1 М) (рис.7 А, кривая 6). Таким образом, полученные данные согласуются с предположением о сходстве пространственной организации ингибитора из фасоли, выделенного в лаборатории и низкомолекулярных ингибиторов из семян других бобовых. Для всех белков этой группы характерна особенно высокая устойчивость к различного рода де-натурационным воздействиям.
Взаимодействие химотрипсина с нативными ингибиторами из фасоли и картофеля
Полученные данные согласуются с представлением о том, что комплекс состоит из одной недиссоциированной молекулы ингибитора и одной молекулы фермента (трипсина, химотрипсина или оубтилизина). Однако ранее было показано, что одна весовая часть ингибитора способна подавить активность двух весовых частей каждого из вышеупомянутых ферментов (приблизительно соответствует молярному отношению ингибитор/фермент 1:2) /23/. Видимое противоречие между стехиометрией реакции ингибирования и величиной молекулярной массы образующегося комплекса может быть обусловлено двумя причинами. Во-первых, возможно образование наряду с преобладающим эквимолекулярным комплексом, состоящим из одной молекулы ингибитора и одной молекулы фермента, дополнительных комплексов, содержащих более одной связанной молекулы фермента.
Действительно, при гель-хроматографии смесей ингибитора с каждым из трех изученных ферментов всегда обнаруживается некоторое количество материала с более высокой молекулярной массой, чем у эквимолекулярного комплекса (рис,19), Точно также при скоростной седиментации смесей ингибитор/фермент, взятых в отношении 1:2, наряду с основным компонентом, молекулярная масса которого определяется методом седиментационного равновесия, присутствует некоторое количество высокомолекулярного материала.
другая возможная причина может заключаться в частичном про-теолизе ингибитора, сопутствующем образованию комплекса с фермен-том. Подобное явление наблюдалось, например, при образовании комплексов -ингибитора из плазмы крови с трипсином и эласта-зой /136,146/. В этом случае молекулярная масса комплекса может быть существенно снижена, что может привести к ошибочным заклкь чениям относительно его состава. Для проверки этой возможности комплекс ингибитора с химотрипсином подвергали диссоциации в кислой среде и после этого определяли молекулярную массу полученного свободного ингибитора в состоянии димера и мономера. Как следует из данных, представленных на рис.20 молекулярная масса ингибитора, освобожденного в результате диссоциации комплекса с ферментом, практически не отличается от молекулярной массы исходного ингибитора (31000 для димера при рН 8 и 14600 для мономера при рН 2). Кроме того, было показано, что ингибитор, выделенный из комплекса с химотрипсином, сохраняет способность образовывать устойчивые комплексы с ферментом. Таким образом, предположение о том, что образование комплекса с ферментом может сопровождаться существенным изменением молекулярной массы ингибитора не получило экспериментального подтверждения.
Далее была предпринята попытка подробно исследовать образование комплексов ингибитор-фермент с помощью метода электрофореза в полиакриламвдном геле в присутствии DS-Na. С этой целью электрофорезу подвергали смеси с различным соотношением химотрипсин/ ингибитор. При весовом отношении, равном фермент/ ингибитор 1:1 наряду со свободным ингибитором присутствует более тяжелый компонент с мол.м. 59000, который, очевидно, соответствует комплексу, содержащему недиссопиированнуго молекулу ингибитора и одну молекулу химотрипсина (рис.21 В). В то же время при более высоком относительном содержании химотрипсина в смеси обнаруживается дополнительный компонент с более высокой молекулярной массой (100000). При этом содержание последнего тем больше, чем выше относительное содержание фермента в смеси (рис,21 Г,Д). Легкий компонент с мол.м. 25000, присутствувхций во всех смесях ингибитора с химотрипсином, соответствует свободному ферменту. Интересно отметить, что продукты автолиза фермента, отчетливо видимые при разделении свободного химотрипсина, отсутствуют в гелевых электро-фореграммах фермента и ингибитора в весовом отношении 1:1 и 2:1. Это показывает, что в этих условиях практически весь активный фермент связан в комплексе с ингибитором. В то же время продукты автолиза обнаруживаются при электрофорезе смеси химотрипсина и ингибитора в отношении 3:1. Этот результат является дополнительным подтверждением того, что ингибитор полностью подавляет активность фермента при соотношении 1:2.
По данным Морои и Ямасаки /146/ комплексы трипсина с о(-1-ингибитором из плазмы крови не диссоциируют в присутствии 1% Ds-Na и 1% jS-меркаптоэтанола. На этом основании ими было высказано предположение о наличии ковалентной связи между гидрокси-лом серина активного центра фермента и аминокислотным остатком, расположенным в реактивном центре ингибитора, В случае ингибитора из картофеля при электрофорезе в условиях, описанных Морои и Ямасаки, комплексы с ферментом не были обнаружены. Более того, в этих условиях молекула ингибитора ведет себя как мономер с мол.м, 15000.
Таким образом, полученные данные показывают, что в результате взаимодействия ингибитора из картофеля с ферментом образуются комплексы различного состава. Наряду с комплексом, содержащим одну димерную молекулу ингибитора и одну молекулу фермента образуются комплексы, содержащие несколько молекул фермента.
Модификация остатков основных аминокислот -аргинина и лизина
Особенностью белковых ингибиторов протеаз является устойчивость к денатурации и протеолитическому расщеплению. Как известно, биологические функции белков определяются пространственным строением их молекул. Изучение трехмерной структуры белков-ингибиторов, с одной стороны, важно для понимания общей устойчивости белков к денатурирующим воздействиям и протеолизу, а с другой стороны, может служить ключом к познанию их конкретной физиологической функции.
В настоящей работе исследованы конформационные свойства двух белков-ингибиторов протеаз и особенности их взаимодействия с про-теиназами. Оба ингибитора выделены в лаборатории: один из клубней картофеля, а другой из семян фасоли. По ряду физико-химических свойств исследуемые ингибиторы отличаются от других известных ингибиторов, поэтому их следует рассматривать как новые белки.
Изучение конформации этих белков методом КД показало, что спектр ингибитора из фасоли близок к спектрам ингибитора Баумана-Еирк и других низкомолекулярных ингибиторов из бобовых растений. Особенно ярко сходство спектров проявляется в ближней УФ-области. Анализ полученных данных позволил заключить, что ингибитор из фасоли гомологичен ингибитору Баумана-Еирк и, таким образом, является еще одним представителем этого семейства ингибиторов.
Инигибитор из картофеля в дальней УФ-области имеет спектр, сходный со спектром ингибитора из фасоли, но в ближней УФ-области их спектры сильно различаются.
Ранее было показано, что исследуемые ингибиторы имеют аминокислотный состав, типичный для большинства ингибиторов протеаз растительного происхождения. Оба белка характеризуются отсутствием триптофана, высоким содержанием дисульфидных связей и остатков пролина. Видимо, поэтому в их структуре преобладают участки неупорядоченной полипептидной цепи. Расчеты показывают, что в состоянии статистического клубка находится более 60$ аминокислотных остатков. На долю /-структуры приходится около 30$, а dL-спиральные участки практически отсутствуют.
Белки различаются по содержанию остатков гидрофобных аминокислот: ингибитор из картофеля более гидрофобный, чем ингибитор из фасоли (HPS =0,27 для ингибитора из картофеля, NPS =0,15 для ингибитора из фасоли), Нто касается остатков ароматических аминокислот, вносящих основной вклад в спектр Щ в ближней УФ-области, то в ингибиторе из фасоли (мол.м. 12000) содержится 2 остатка фенилаланина и I остаток тирозина, тогда как в нативной молекуле ингибитора из картофеля (мол.м. 32500) имеется 6 остатков фенилаланина и 16 остатков тирозина.
Несмотря на высокое содержание основных хромофоров, ингибитор из картофеля имеет невыразительный спектр в ближней УФ-области. Сравнение со спектрами других ингибиторов показало, что в ближней УФ-области спектр этого ингибитора не имеет аналогий. Более того, характер спектра дает основание полагать, что ингибитор из картофеля не принадлежит ни к одному из семейств ингибиторов, предложенных Ласковским.
Исследование влияния денатурирующих агентов на конформацию белков-ингибиторов, а также результаты опытов по химической модификации функциональных групп и опытов с флуоресцентным зондом показали, что важная роль в стабилизации нативной структуры принадлежит дисульфидным связям, а гидрофобные взаимодействия играют большую роль в формировании нативной структуры ингибитора из картофеля по сравнению с ингибитором из фасоли.
Из двух исследуемых ингибиторов четвертичной структурой обладает ингибитор из картофеля. По имеющимся данным, остатки тирозина могут играть важную роль в образовании олигомерной структуры белков, представляющей собой либо фермент-ингибиторный комплекс, либо четвертичную структуру нативного белка. Например, при участии остатков тирозина протекает процесс агрегации инсулина /109/. По имеющимся данным ацетилирование остатка тирозина, локализованного вблизи химотрипсинсвязывающего центра в ингибиторе из лимской фасоли, сопровождается потерей антихимотриптичес-кой активности ингибитора /115/.
В настоящей работе возможность участия остатков тирозина в ассоциации субъединиц ингибитора из картофеля, а также во взаимодействии с протеиназами была исследована методом химической модификации. Обработка белка тетранитрометаном показала, что на поверхности молекулы локализовано 6 остатков тирозина, В присутствии DS-Na нитруются практически все (I3+I) остатки тирозина, хотя ингибитор из картофеля в этих условиях сохраняет четвертичную структуру. Модификация поверхностных тирозинов не влияет на его способность ингибировать химотрипсин, но снижает его антитрип-тическую активность. Изменение стехиометрии ингибирования трипсина в результа/те нитрования косвенно свидетельствует о большей степени комплементарности трипсинсвязывакщего центра ингибитора области активного центра трипсина.
Подтверждением тому служат данные, полученные при изучении взаимодействия ингибитора из картофеля с протеиназами методом Щ9 Этот ингибитор эффективно подавляет трипсин, образуя прочный комплекс, при этом не было обнаружено заметной разницы между спектром комплекса и суммой спектров компонентов. Это означает, что в процессе комплексообразования конформационные изменения не происходят.
