Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
1. Внутриклеточный транспорт 11
1.1 Экзоцитоз 13
1.2 Эндоциоз 20
1.3 Регуляция внутриклеточного транспорта 21
1.4 Внутриклеточный транспорт к плазмодесмам . 25
2. Межклеточный транспорт 28
2.1 Типы плазмодесм 30
2.2 Структура плазмодесм 33
2.3 Транспорт через плазмодесмы
2.3.1 Заякоривание около ПД 37
2.3.2 Транслокация через плазмодесмы 47
2.3.3 Высвобождение из плазмодесмы в соседней клетке 41
2.4 Регуляция межклеточного транспорта.
2.4.1. Предельная пропускная способность плазмодесм. 42
2.4.2 Роль цитоскелета в регуляции межклеточного транспорта
2.4.3 Роль посттранскрипционных модификаций в регуляции транспорта белков
2.5 Специфичность транспорта макромолекул в растениях и его регуляция
3. Белок 4/1 Arabidopsis thaliana. 50
Материалы и методы 51
Результаты 72
1 Поиск гомологов белка 4/1 Arabidopsis thaliana in silico 72
2 Иммунодетекция белка 4/1 Arabidopsis thaliana и его гомологов.
3 Клонирование кДНК гомологов белка 4/1 из растений Nicotiana benthamiana и Nicotiana tabacum методом RACE-PCR
4 Клонирование полных копий генов гомологов белка 4/1 из растений Nicotiana benthamiana и Nicotiana tabacum
5 Изучение внутриклеточной локализации белка 4/1 82
5.1 Внутриклеточная локализация белка 4/1, слитого с GFP. 82
5.2. Ко-локализация белка 4/1 с маркером ЭПР. 85
5.3. Ко-локалзация белка 4/1 с актиновыми филаментами. 88
5.4. Ко-локализация белка 4/1 с маркером аппарата Гольджи. 89
5.5. Мутационное картирование участков белка 4/1, ответственных за его внутриклеточную локализацию.
6. Поиск белков-партнеров белка 4/1 с помощью дрожжевой двугибридной системы
Выводы 105
Список литературы
- Регуляция внутриклеточного транспорта
- Внутриклеточный транспорт к плазмодесмам
- Высвобождение из плазмодесмы в соседней клетке
- Клонирование кДНК гомологов белка 4/1 из растений Nicotiana benthamiana и Nicotiana tabacum методом RACE-PCR
Введение к работе
Изучение молекулярных механизмов внутриклеточного и межклеточного транспорта в растениях является одним из наиболее актуальных направлений молекулярной биологии растений.
Функционирование любого многоклеточного организма предполагает наличие тесного контакта между отдельными клетками. В растениях клетки соединены между собой специализированными межклеточными контактами -плазмодесмами (ПД), которые представляют собой поры, пронизывающие клеточные стенки соседних клеток. Через плазмодесмы осуществляется транспорт питательных веществ, гормонов, при участии этих межклеточных контактов происходит распространение сигналов дифференцировки, посттранскрипционного умолкания генов, апоптоза (Lucas et ah, 1993). Известно также, что через плазмодесмы происходит распространение вирусной инфекции из первично зараженной клетки (Atabekov and Dorokhov, 1984).
Необходимой стадией, предваряющей межклеточный транспорт, является доставка транспортируемых частиц на периферию клеток к плазмодесмам. (Ding et al, 1998; Lazarowitz and Beachy, 1999). Несмотря на общие черты в организации транспортных систем, механизм внутриклеточного транспорта растительных и животных клеток имеет ряд существенных отличий. На данный момент, выявлены некоторые пути регуляции внутриклеточного транспорта растений, показана роль в этом процессе цитоскелета и эндомембранных структур, но для полного понимания функционирования системы требуются дальнейшие исследования.
Удобной моделью для изучения молекулярных механизмов межклеточного и внутриклеточного транспорта в растениях являются транспортные белки вирусов растений (ТБ). Транспортные белки обеспечивают перемещение генома вируса внутри клетки, перенос его в соседние клетки и распространение вирусной инфекции по всему организму растения (Atabekov and Dorokhov, 1984). Известно, что ТБ вирусов растений используют систему транспорта клеток хозяина (Lucas et al, 1995; Carrington et al, 1996; Ghoshroy et al, 1997). Большое разнообразие транспортных белков делает их удобными моделями для изучения молекулярных механизмов внутриклеточного и межклеточного транспорта растений (Mushegian et al.,1993; Lazaromtz and Beachy, 1999).
Белок 4/1 A. thaliana был обнаружен как фактор, способный взаимодействовать с транспортным белком вируса бронзовости томата, что позволило предположить его участие в процессе внутри- и межклеточного транспорта в растениях. Данная работа посвящена изучению свойств белка 4/1 и его гомологов из других растений.
Регуляция внутриклеточного транспорта
Для узнавания, заякоривания и слияния везикул с акцепторными компартментами необходимы белки SNARE (Chen and Scheller, 2001; Jahn et al, 2003; Sollner et al, 1993). Белки SNARE заякорены на мембранах транспортных везикул (v-SNARE) и акцепторных компартментов (t-SNARE) и способны взаимодействовать друг с другом с образованием coiled-coil структур, состоящих из четырех суперскрученных спиралей. Формирование таких комплексов способствует сближению акцепторной и донорной мембран и их последующему слиянию. Белки SNARE различаются по структуре и размеру, и были выделены в одну функциональную группу по наличию специфического мотива, который представляет собой основу для формирования coiled-coil структуры (Pratelli et al, 2004).
SNARE белки способны взаимодействовать как с СОР I и СОР II коатомерами, так и с клатрином (Hirst et al, 2004; Rein et al, 2002) Транспортная везикула транспортируется к месту своего назначения по цитоскелету при помощи соответствующих молекулярных моторов. «Прикрепляющие» рецепторы везикулы обеспечивают ее дальнее взаимодействие с компартментом назначения, что в свою очередь создает условия для ближних взаимодействий v- и t-SNARE и более прочного «заякоривания». v- и t-SNARE взаимодействуют между собой с образованием coiled-coil структуры из четырех суперскрученных спиралей (Hong, 2005). Происходит «застегивание молнии», т.е. coiled-coil комплекс последовательно образуется в направлении от N- к С-концам белков SNARE, а образующаяся в результате этого энергия идет на сближение мембран транспортной везикулы и акцепторного компартмента, а именно на преодоление отталкивания между отрицательно заряженными фосфолипидами обеих мембран (Hong, 2005; Ungermann and Langosch, 2005).
Большое число типов белков SNARE, участвующих в везикулярном транспорте в клетках растений, отражает разнообразие возможных вариантов слияния эндомембранных компартментов. Различают симметричный тип слияния, когда происходит объединение раздробленных органелл после клеточного деления или слияние эндосом (Shorter and Warren, 2002, Wickner and Haas, 2000), и ассиметричный, когда происходит слияние разных по составу и структуре компартментов, как в случае секреторного везикулярного транспорта к плазматической мембране (Sudhof, 2004). При помаши временной экспрессии белков SNARE, слитых с зеленым флуоресцирующим белком (GFP), была показана внутриклеточная локализация всех 54 SNARE в клетках A. thaliana (Uemura et al, 2004). Было обнаружено, что 6 белков SNARE локализованы в ЭПР, 9 - в аппарате Гольджи, 4 - в сети транс-Гольджи, 2 - в эндосомах, 17 - в плазматической мембране, 7 - в ПВК/вакуоли, 2 - СТГ/ПВК/вакуоли, 1 - в СТГ/ПВК/плазматическая мембрана. Локализация SNARE более чем в одном компартменте означает, что данные белки курсируют между несколькими эндомембранными компартментами. Очевидно, что они участвуют в везикулярном транспорте между этими компартментами, при этом одни и те же белки могут обеспечивать транспорт как в одном, так и в обоих направлениях.
Белков SNARE недостаточно, чтобы обеспечивать специфичность слияния мембран. Принято выделять дополнительный класс белков, которые обеспечивают специфичность узнавания транспортной везикулой определенного акцепторного компартмента, которые обеспечивают «дальние» взаимодействия, контакт с мембраной в тот момент, когда SNARE белки еще не начали функционировать. Эти белки принято называть стыковочными белками (tethering факторы). Выделяют две подгруппы tethering факторов: coiled-coil и мульти-субъединичные (Sztul and Lupashin, 2006). Первые содержат множество гептадных повторов для формирования coiled-coil структур, функционируют обычно в составе димеров и имеют вытянутую палочкообразную структуру (Lupas, 1997; Sapperstein et al, 1995). Например, белок pi 15, участвующий в транспорте из ЭПР в АГ, представляет собой параллельный гомодимер, состоящий из двух глобулярных головок и длинных хвостовых участков с четырьмя coiled-coil мотивами, которые разделены между собой пролин-богатыми линкерными районами, что придает этому белку структурное сходство с миозином II.
Внутриклеточный транспорт к плазмодесмам
Транспорт макромолекул через плазмодесмы является сложным многоэтапным процессом, в котором задействовано множество факторов. Условно процесс межклеточного транспорта в растениях можно разделить на три стадий: закрепление транспортируемой молекулы у плазмодесмы, транслокация через плазмодесму и высвобождение транспортируемой молекулы по другую сторону клеточной стенки. Очевидно, каждый из этапов находится под контролем клеток, участвующих в транспорте, тем самым обеспечивается селективность и направленность транспорта.
Впервые способность белков растений перемещаться при участии плазмодесм была показана на примере белка KNOTTED 1 (KN1) -транскрипционного фактора растений, определяющего дифференцировку клеток меристемы (Jackson and Hake, 1997). Интересно, что белок KN1 по своим свойствам схож с транспортными белками вирусов растений. Так же как и ТБ, KN1 способен перемещаться из клетки в клетку через плазмодесмы, при этом увеличивая их пропускную способность. Более того, подобно ТБ вирусов растений, KN1 способен транспортировать из клетки в клетку РНК, но в отличие от многих транспортных белков вирусов растений KN1 взаимодействует со специфичной последовательностью РНК и поэтому осуществляет транспорт лишь собственной мРНК (Lucas et al, 1995; Jackson, 2002; Kim et al, 2003, 2005).
На данный момент известен уже целый ряд белков растений, способных транспортировать собственную мРНК из клетки в клетку. Это так называемые белки NCAP (non-cell-autonomous proteins, не клеточные автономные белки). Белки NCAP обладают различной специфичностью к транспортируемой ими РНК, от высокоспецифичного взаимодействия, как в случае белка PSRP1 (Yoo et al, 2004), до неспецифичного связывания любой молекулы РНК, что например, свойственно белку CmPP16 (Xoconostle-Ca zares et al, 1999), который участвует в образовании рибонуклеиновых комплексов транскриптов, перемещающихся по флоэме (Ruiz-Medrano et al, 1999)
Исследование свойств белков NCAP свидетельствует о том, что в ходе эволюции растения создали сложную систему транспортировки этих белков через плазмодесмы, которая успешно используется транспортными белками вирусов растений (Cilia and Jackson, 2004; Haywood et al, 2002; Lucas and Lee, 2004). Внесение искусственных мутаций в последовательность белков NCAP или ТБ вирусов растений приводило к нарушению их транспорта (Haywood et al.,2002). Этот факт позволяет предположить, что для эффективного транспорта этих белков необходимо наличие специфичного белок-белкового взаимодействия с некими факторами клеток растений. Подробное изучение такого рода взаимодействий позволит понять механизм межклеточного транспорта в растениях.
Принято выделять два типа плазмодесм, основываясь на различиях в структуре: простые и сложные. Простые ПД состоят из одиночной поры, пронизывающей клеточную стенку. Сложные же ПД имеют центральную полость, которая открывается в цитоплазму соседних клеток несколькими каналами (Cook et.al, 1997, Dinget. ah, 1998).
В клетках недифференцированной ткани растения простые ПД преимущественно объединяются в группы, "поля" или "бляшки". Если простые ПД характерны для низших растений, то сложные - для зрелых тканей, и являются более прогрессивными структурами с точки зрения эволюции (Орагка et.al, 1999).
В опытах по изучению траенпорта слитого с GFP белка За - ТБ вируса огуречной мозаики (ВОМ), было показано, что этот белок не способен перемещаться по простым плазмодесмам. Транспорт белка GFP:3a становился возможным, только когда клетки листа достигали определенной стадии развития, во время которой происходит образование сложных плазмодесм (Itaya et ah, 1998). Можно предположить, что простые и сложные плазмодесмы ассоциированы с разными клеточными факторами, определяющими специфичность транспорта макромолекул через данный тип ПД. Таким образом, функции простых и сложных плазмодесм отличаются.
Существует также классификация плазмодесм, основанная на особенностях их образования. Согласно ей, различают два других типа ПД: первичные и вторичные.
Высвобождение из плазмодесмы в соседней клетке
Высвобождение транспортируемой молекулы в клетке-реципиенте процесс не менее важный, чем транспорт к плазмодесме и транслокация. Регуляция этого процесса - один из этапов контроля межклеточного транспорта. Хотя на данный момент не известно достоверных подтверждений существования контроля высвобождения из ПД, логично предположить, что он существует.
Были предложены две модели, описывающие возможный механизм этого процесса (Ding, 1998). Первая заключается в том, что помимо PTS, транспортируемый белок должен содержать сигнал высвобождения из ПД (PRS -plasmodesmata releasing signal). PRS может совпадать с PTS если в транспорте к ПД и высвобождении из нее участвуют одни и те же клеточные рецепторы; или же отличаться от PTS, если рецепторы разные. Согласно второй гипотезе считается, что, если транслокация белка сопряжена с активностью шаперона, то, возможно, в результате взаимодействия последнего с клеточными рецепторами происходит высвобождение транспортируемого белка.
Как было показано в опытах по экспрессии белков в клетках растений, дефектный белок KN1 (транскрипционный фактор растений, относящийся к группе NCAP) способен блокировать перемещение из клетки в клетку транспортного белка вируса огуречной мозаики (ВОМ). И наоборот, дефектный транспортный белок ВМО блокировал транслокацию KN1. Очевидно такой эффект связан с конкуренцией этих белков за некие клеточные факторы, необходимые для межклеточного транспорта (Kragler et al, 1998).
Интересно, что в трансгенных растениях, экспрессирующих мутантный белок NCAPP1 полностью блокировался транспорт другого NCAP белка СтРРІб и белка ЗОК вируса табачной мозаики, а транспорт белка KN1 и ТБ ВМО не нарушался (Lee et al.,2003). Следовательно, существуют несколько альтернативных путей транспортировки через плазмодесмы, находящихся под контролем различных клеточных факторов.
Основной характеристикой плазмодесм является их предельная пропускная способность (ППС), выражающаяся в размерах молекул, способных транспортироваться через ПД.
Базальным принято считать уровень предельной пропускной способности плазмодесм между клетками зрелой ткани растения, где ПД не подвергались воздействию модифицирующих факторов, к которым относят химический и природный стресс, а так же вирусные транспортные белки. Считается, что для молекул, чей размер не превышает ППС плазмодесм, процесс транспорта является пассивным. Сахара, метаболиты, ионы и аминокислоты свободно передвигаются через ГТД за счет диффузии. Молекулы, размеры которых превышают базальный диаметр плазмодесм, нуждаются в селективном транспорте, при котором конформационным изменениям подвергаются и ПД и сами молекулы (Lucas, 1993). Пропускная способность плазмодесм может изменяться параллельно с развитием растения, различаясь также в зависимости от типа ткани и вида растения. Плазмодесмы клеток мезофилла табака способны пропускать декстраны молекулярной массой 0,8-1 кДа (Wolf et. al, 1989), что примерно соответствует диаметру микроканалов Знм (Ding et.al, 1992). Другие данные показывают, что ППС может быть гораздо больше, например, для клеток трихом табака она составляет 7кДа (Waigman and Zambryski, 1995). Следует отметить, что ключевым фактором, определяющим возможность прохождения через канал, является не молекулярная масса, а диаметр молекулы, Стоксовский радиус (Terry andRobards, 1987).
Известно несколько факторов, влияющих на ППС плазмодесм. Некоторые двухвалентные катионы (Ca2+,Mn2+,Sr2+), ароматические аминокислоты, фосфоинозитиды и каллоза способны понижать предельную пропускную способность плазмодесм. В области «шеи» плазмодесмы были найдены сократительные белки, соединяющие плазмалемму с десмотрубочкой. Предполагается, что это молекулы центрина - Са2+-связывающего фосфопротеина. Центрин - фибриллярный белок, его сокращение происходит при повышении концентрации иопов Са2+, а релаксация АТФ-зависима и сопряжена с фосфорилированием (Blackman et al., 1999). Кроме того, были идентифицированы две протеинкипазы, ассоциироваппые с плазмодесмой, одна из которых является кальций-зависимой, (Citovsky et al.,1993; Yahalom et. al, 1998). В районе плазмодесмы локализуется и белок кальретикулин, обладающий буферной активностью для ионов кальция (Baluska et.al, 2001). Такая система может принимать участие в модификации компонентов транслокационной машины ПД и самих транспортируемых молекул. Каллоза ((1-3)- р-глюкан) откладывается вокруг ПД, и таким образом уменьшает ее проводимость. В норме закупорка пор каллозой является преимущественно ответом на стрессорные факторы (Rinne et. al, 2001), в частности на вирусную инфекцию. В опытах с использованием дрожжевой двугибридной системы было показано, что транспортный белок ТБГ2 X вируса картофеля (ХВК) способен взаимодействовать с ферментом клеток растений р-1,3-глюканазой (Fridborg et al, 2003), что предположительно позволяет предотвратить закупорку плазмодесм каллозой при вирусной инфекции и тем самым обеспечивает распространение вируса из клетки в клетку.
Клонирование кДНК гомологов белка 4/1 из растений Nicotiana benthamiana и Nicotiana tabacum методом RACE-PCR
Образование структур, фенотипически похожих на 4/1-содержащие везикулы, ранее наблюдалось при экспрессии в клетках растений транспортного белка ТБГЗ полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ) (Solovyev et al 2000; Zamyatnin et al. 2002). Белок ТБГЗ является одним из трёх транспортных белков, кодируемых тройным блоком генов (ТБГ) ПЛВМ. Все три белка ТБГ необходимы для распространения вирусной инфекции из первично зараженной клетки. Известно, что ТБГЗ играет роль в локализации комплекса вирусной РНК и двух других транспортных белков на периферии клетки возле плазмодесм. В опытах по иммунофлуоресцентной микроскопии клеток трансгенных растений N. benthamiana, экспрессирующих слитый с GFP белок ТБГЗ, было показано, этот белок локализуется возле плазмодесм в виде двойных точек по обе стороны клеточной стенки (Gorshkova et al, 2003).
Сходство в поведении белков 4/1 и ТБГЗ позволило предположить, что, вероятно, структуры, в которых эти белки локализуются, имеют общую природу. Для проверки этого предположения была проведена ко-экспрессия в клетках N. benthamiana слитого с GFP белка 4/1 A. thaliana и слитого с YFP белка ТБГЗ ПЛВМ. Было показано, что оба белка локализуются в одних и тех же структурах (рис. 11). На основе этих результатов было выдвинуто предположение, что белок 4/1 локализуется в структурах везикулярного типа, в составе которых происходит его доставка на периферию клетки, где белок каким-то образом оказывается связан с плазмодесмами и далее транспортируется через них в соседние клетки.
Ранее было показано, что при транспорте внутри клетки белок ТБГЗ, вероятно, ассоциирован с мембранами ЭПР (Solovyev et al, 2000). Чтобы проверить, являются ли 4/1-содержащие структуры производными эндоплазматического ретикулума, был поставлен опыт по колокализации белка 4/1 и маркера ЭПР.
В качестве маркера эндоплазматического ретикулума использовался белок YFP-ER, который представляет собой модифицированный белок YFP, несущий N-концевой отщепляемый сигнальный пептид хитиназы A. thaliana и С-концевой тетрапептид HDEL, являющийся сигналом ретроградного транспорта в ЭПР (Boevink et al, 1998, 1999). В эпидермальных клетках N. benthamiana такой белок локализован в структурах ЭПР (Zamyatnin et al, 2002).
При ко-экспрессии слитого с GFP белка 4/1 и белка YFP-ER наблюдалось наличие маркера ЭПР в 4/1-содержащих везикулах (рис.12).
Результаты данного опыта были также дополнительно подтверждены опытами по ко-экспрессии слитого с GFP белка 4/1 и слитого с YFP белка 30К вируса табачной мозаики (ВТМ). Белок ЗОК является транспортным белком ВТМ,
это один из наиболее изученных транспортных белков вирусов растений. Известно, что на поздних стадиях экспрессии белок ЗОК локализуется около плазмодесм, а затем транспортируется в соседние клетки (Waigmann et al 1994). Нами было показано, что на поздних стадиях экспрессии в клетках N. benthamiana наблюдается ко-локализация белка 4/1 и ЗОК возле плазмодесм (данные не приведены).
Результаты опытов по локализации белка 4/1 A. thaliana полностью подтвердились результатами аналогичных опытов с использованием слитых с GFP белков 4/1 N. benthamiana и N. tabacum.
Важной задачей являлось определение того, каким образом происходит доставка везикул, содержащих белок 4/1 на периферию клетки. В ранее проведенных экспериментах по флуоресцентной микроскопии нами наблюдалось активное движение 4/1-содержащих везикул по клетке, в которой происходит экспрессия белка. Подобное быстрое передвижение везикул обычно происходит при участии элементов цитоскелета клетки. Чтобы проверить эту гипотезу, нами были проведены опыты по ко-экспрессии слитого с GFP белков 4/1 A, thaliana, N. benthamiana, N. tabacum и белка YFPal. Флуоресцирующий белок-маркер YFPal, в котором в состав слитого с YFP белка входит актин-связывающий домен талина мыши (Kost et al, 199Н), использовался в данных экспериментах для визуализации актиновых филаментов.
