Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ 1. Обзор литературы
1.1. История синтеза и первые исследования ДМХ 9
1.2. Влияние химической структуры молекулы халкоиов на электронные спектры поглощения 9
1.3. Влияние химической структуры молекулы на флуоресцентные свойства халкоиов 12
1.4. Структура моле культ ДМХ 12
1.5. Спектральные характеристики ДМХ 13
1.6. Квантовый выход флуоресценции ДМХ 14
1.7. ДМХ как люминесцентный индикатор 15
1.8. ДМХ как флуоресцентный зонд для исследования биологических объектов 16
1.9. Исследования структуры мембран с помощью флуоресцентных зондов 17
1.9.1. Модель гетерогенных мест связывания зонда в мембране
"Кластерная модель" структуры мембран 17
1.9.2. "Релаксационная модель" структуры липидного бислоя 18
1.9.3. Модель "TWICT" 19
1.10. Локализация зондов в лнпндпом бислое.
Физико-химическая структура мембаны 22
1.11. Флуоресцентный зонд ДМХ в исследованиях липопротеинов и клеток 25
1.12. Клеточный состав крови 26 1.12. Лнпидный состав клеток крови 27
1.14. Способность клеток крови к синтезу липидов 29
1.15. Внутриклеточные липндные частицы клеток крови 30
ЧАСТЬ 2. Результаты исследований
Глава 1. Материалы и методы исследований 34
2.1. Реактивы и среды 34
2.2. Приготовление липосом и липидпых шаров 34
2.3. Выделение лппопротеппов 35
2.4. Выделение клеток 36
2.4.1. Лимфоциты из тимуса крыс 36
2.4.2. Лимфоциты из периферической крови человека 36
2.4.3. Гранулоциты из периферической крови человека 37
2.5. Субклеточное фракционирование 37
2.5.1. Сканирующая электронная микроскопия 38
2.5.2. Трансмиссионная электронная микроскопия 38
2.6. Аналитические методы 39
2.6.1. Определение белка
2.6.2. Определение нуклеиновых кислот
2.6.3. Определение фосфолипида
2.7. Флуоресцентные зонды 39
2.8. Флуоресцентные измерения 41
2.8.1. Флуоресцентная микроскопия 41
2.8.2. Регистрация стационарных спектров флуоресценции 41
2.8.3. Регистрация безызлучателыюго переноса энергии 41
2.8.4. Проточная цитофлуорометрия клеток 41
2.8.5. Регистрация кинетики затухания флуоресценции 42
2.9. Спектрофотометрические измерения 42
2.10. Измерение фосфоресценции 43
2.11. Фемтосекундная абсорбционная спектрофотометрів 43
2.12. Измерение кондуктометрнческого объёма клеток 43
2.13. Квантовохнмические расчеты 44
Глава 2. Создание экспериментальных установок для исследования клеток крови
2.2.1. Установка для разрушения цитоплазматическоГі мембраны лейкоцитов 44
2.2.2. Проточный цктофлуориметр для исследования клеток мембранными флуоресцентными зондами 46
Глава 3. Исследование оптических свойств ЛМХ
3.1. Квантово-химнческие расчеты свойств молекулы ДМХ 50
3.1.1. .Квантово-химическне расчёты и кристаллографическое исследование конформации молекулы ДМХ в основном состоянии 51
3.1.2. Квантово-химичсскне расчеты электронных переходов в молекуле ДМХ 58
3.1.3. Дипольный момент молекулы ДМХ в основном состоянии (jig) 62
3.2. Оптические свойства зонда ДМХ в органических растворителях 63
3.2.1. Влияние растворителя на положение максимумов спектров
поглощения и флуоресценции зонда ДМХ 63
3.2.2. Дипольный момент возбужденного состояния молекулы ДМХ (jie) 66
3.2.3. Квантовый выход флуоресценции ДМХ в
органических растворителях 67
3.2.4. Влияние вязкости я дипольного момента молекулы растворителя на флуоресценцию ДМХ 70
3.2.5. Влияние полярности среды на динамику процессов релаксации в возбужденном состоянии. Фемтосекундная спектроскопия 72
3.2.6. Фосфоресценция ДМХ в неполярної! и полярной средах 78
3.2.7. Барьер перехода ДМХ из флуоресцирующего в нефлуоресцирующее состояние 79
3.2.8. Влияние температуры и полярности среды
на спектр поглощения ДМХ 83
Глава 4, Использование ЛМХ для исследования мицеллярных и ламмелярных липидных структур R лимфоцитах кропи
4.1. Флуоресценция зонда ДМХ в модельных липидных мембранах (лнпосомах) 89
4.1.1. Спектры флуоресценции ДМХ в мебранах различного липидного состава 89
4.1.2. Определение параметров связывания ДМХ с липосомами 90
4.1.3. Коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции ДМХ в лнпосомах 94
4.2. Флуоресценция зонда ДМХ в субклеточных арганеллах лимфоцитов 96
4.2.1. Субклеточное фракционирование 96
4.2.2, Разделение и биохимическая характеристика субклеточных фракций 99
4.2.3. Морфологическая характеристика выделенных фракций 101
4.2.4, Связь между интенсивностью флуоресценции ДМХ и биохимическим составом субклеточных фракций 104
4.3. Флуоресценция ДМХ в лейкоцитах периферической крови человека 106
4.3.1. Спектры флуоресценции ДМХ в лимфоцитах и гранулоцитах 106
4.3.2. Проточная цитофлуорометрия лейкоцитов, окрашенных зондом ДМХ 107
4.3.3. Флуоресценция зонда ДМХ в выделенных фракциях лимфоцитов и гранулоцитов 108
4.3.4. Разложение гистограмм клеток крови на составляющие. Сравнение результатов разложения сданными гематологического анализа мазков крови 109
4.3.5. Вклад эритроцитов и тромбоцитов в гистограмму распределения клеток крови по флуоресценции зонда ДМХ 112
4.3.6. Флуоресценция ДМХ в лейкоцитах крови здоровых доноров 114
4.4. Исследование пространственной структуры липида в лейкоцитах крови человека методом безызлучателыюго переноса энергии 114
4.4.1. Перенос энергии между молекулами флуоресцентных зондов К-68 и ДСП-12 в лимфоцитах 116
4.4.2. Влияние трансмембрапных полей лимфоцита на распределение зондов К-68 и ДСП-12 в клетке 118
4.4.3. Влияние зонда К-68 на катионаккумулирующую способность митохондрий лимфоцитов 119
4.4.4. Исследование пространственной струтуры липида в лейкоцитах по результатам переноса энергии между молекулами флуоресцентных зондов К-68, ДМХ и ДСП-12 121
4.5. Возможные причины различий флуоресценции ДМХ в лимфоцитах и гранулоцитах 126
Заключение 128
Выводы 130
Литература
- Влияние химической структуры молекулы на флуоресцентные свойства халкоиов
- Приготовление липосом и липидпых шаров
- Проточный цктофлуориметр для исследования клеток мембранными флуоресцентными зондами
- Коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции ДМХ в лнпосомах
Введение к работе
Актуальность темы. Среди физических методов, применяемых для исследования структуры и свойств биомембран, лппопротешюв и белков, важное место занимает метод флуоресцентных зондов. Его достоинством является техническая простота, высокая чувствительность, а также возможность изучения очень маленьких количеств (порядка 1СГ14 г) и объемов (порядка 10"п см ) биологического объекта. Небольшие изменения в свойствах объекта могут сдвинуть спектр флуоресценции зонда на десятки им и изменить интенсивность его флуоресценции в сотни раз. При этом из-за малого размера молекул и невысокой концентрации зонд вызывает минимальные нарушения натпвнон структуры исследуемого объекта.
4-диметиламшгохалкон (ДМХ) является одним из самых чувствительных зондов. Однако флуоресценция ДМХ (как и других зондов), указывая на происходящие изменения биологического объекта, тем не менее, очень часто не позволяла понять, что именно изменилось, какова физическая сущность перестроек окружения зонда в мембране или липопротеине. Вместе с тем в последние годы появились методы, позволяющие существенно продвинуться вперед в понимании этого вопроса. К ним относятся квантово-хнмичеекпе расчеты в сочетании с современной мощной компьютерной базой, а также методы наблюдения за возбужденными состояниями молекул в реальном масштабе времени с разрешением 10"!0 - Ю п сек. Поэтому появилась возможность сделать ДМХ более ясным физическим инструментом исследования мембран и лппопротешюв, тем самым, расширив диапазон его потенциальных применении в качестве зонда.
Поскольку в результате проведенной работы понимание оптических свойств ДМХ в липидах значительно возросло, была предпринята попытка использовать ДМХ для обнаружения внутриклеточных мпцеллярпых липидсодержащих структур непосредственно в живых клетках крови. Как известно, атеросклероз выражается в накоплении лппопротешюв (мпцеллярпых форм лнпида) клетками стенки сосудов, однако было неясно, происходят ли подобные процессы накопления в белых клетках крови. Предполагалось, что ДМХ может быть использован для решения такой задачи.
Цель и задачи работы. Основная цель работы - изучить оптические свойства флуоресцентного зонда ДМХ и использовать его для выяснения структуры внутриклеточных белок-лнпндпых комплексов в лейкоцитах крови человека. Исходя из этой цели, были сформулированы и решались следующие задачи:
(1) исследовать оптические свойства молекулы ДМХ, привлекая для этого квантово-хнмические расчеты, разрешенную во времени флуоресцентную спектроскопию, фемтосскуидные измерения спектров поглощения,
(2) исследовать свойства ДМХ как флуоресцентного зонда для изучения липидов и белково-лппидных комплексов,
(3) изготовить установку для разрыва клеточной мембраны лейкоцитов с целью последующего выделения субклеточных фракций,
(4) изготовить проточный цнтофлуориметр для измерения флуоресценции единичных клеток,
(6) исследовать структуру внутриклеточных белок-липидных комплексов лейкоцитов крови человека.
Научная новизна работы.
1. Впервые проведен квантово-химнческин расчет молекулы ДМХ и оценены возможности тепловых конформациоцных изменений молекулы. Результаты верифицированы кристаллографическим анализом.
2. Проведено подробное систематическое исследование оптических свойств ДМХ.
Впервые получены данные о синглет-триплетных переходах в возбужденной молекуле ДМХ как причине тушения его флуоресценции в неполярных средах. Высказана гипотеза, объясняющая совокупность оптических свойств ДМХ: предполагается, что они определяются конформацнонной лабильностью молекулы; причём полярные среды стабилизируют плоскую копформацню молекулы (с которой связан высокий выход флуоресценции), тогда как в неполярных средах молекула не является плоской, испытывает вращения вокруг одинарных связей, что облегчает безызлучательные переходы и снижает выход флуоресценции в сотни раз.
3. С помощью проточного цитофлуориметра, специально изготовленного для решения этой задачи, впервые удалось исследовать флуоресценцию ДМХ в единичных клетках крови: лейкоцитах, эритроцитах и тромбоцитах.
4. Использование специально сконструированного пресса, позволяющего проводить субклеточное фракционирование без химических агентов и нарушения целостности основных внутриклеточных органелл, показало5 что флуоресценция ДМХ в лейкоцитах связана, прежде всего, с липидными компонентами клеточных органелл.
5. Данные, полученные с помощью этих двух установок, а также опыты по бсзызлучательному переносу энергии между зондами указывают на возможность существования в гранулоцитах крови человека лнпопротеиноподобных частиц. ДМХ использован для оценки их количества, размеров и липндного состава,
Практическое значение работы.
1. Изготовлена уникальная установка для разрушения плазматической мембраны лейкоцитов крови человека.
2. Изготовлен проточный цитофлуориметр, позвляющий исследовать липидные компоненты клеток крови с помощью зонда ДМХ.
3. Проделанная работа позволила:
- показать, что по флуоресцентным параметрам зонда ДМХ можно различить мицеллярные и ламеллярные липидные структуры,
- обнаружить и количественно оценить внутриклеточные липопротешюподобные частицы в клетках крови,
- на основе безызлучатслыюго переноса энергии разработать тест для определения внутриклеточных липопротешюв.
Влияние химической структуры молекулы на флуоресцентные свойства халкоиов
Весьма важным свойством ДМХ как флуоресцентного зонда является его высокая чувствительность к свойствам окружающей среды. В работах [53;85;158;194] было показано, что при изменении полярности растворителя максимум спектра поглощения ДМХ может сдвигаться от 383 до 430 им, а максимум спектра флуоресценции - от 460 до 530 им. Для описания сдвигов спектров поглощения ДМХ было предложено использовать эмпирический параметр Кемлета-Тафта [158; 194]. Величина этого параметра характеризует индекс поляризуемости молекул растворителя, т.е. является мерой способности растворителя стабилизировать заряд или диполь молекулы растворенного вещества за счет своих диэлектрических свойств, а также специфических взаимодействий с данной молекулой. Его значение близко к нулю у таких нсполярных растворителей как гексан (-0.0S) или циклогексан (0.00) и приближается к единице у таких полярных ратворптелен как ацетофенон (0.90), фенилацетошггрил (0.99) и нитробензол (1.01) [124]. Аналогичный подход использовался для описания Стоксова сдвига (то есть разницы между положением максимума спектров поглощения и флуоресценции). Вместе с тем, использование эмпирических параметров, которые, в общем, неплохо описывали экспериментальные данные, не объясняет, какие физические механизмы формируют эти сдвиги спектров. Между тем понимание этого вопроса необходимо, если мы хотим понять свойства окружения молекулы ДМХ в мембране: то есть мы должны понимать, как по спектрам зонда можно определить свойства мембраны. Этому важному вопросу п диссертации посвящен соответствующий раздел.
Уже в первых работах по использованию ДМХ как зонда было замечено, что выход флуоресценции ДМХ изменяется в сотни раз при изменении среды [53;85]. Это делает зонд весьма полезным для применения, однако не существовало никаких физических объяснений такой высокой чувствительности. Поэтому в диссертации этому вопросу было уделено большое внимание.
В результате поглощения кванта света молекула ДМХ переходит в возбужденное состояние. В отсутствие других процессов дезактивации электронно-возбужденные молекулы переходят в «начальное», т.е. основное состояние путем излучения флуоресценции. Это излучение, будучи случайным процессом, подчиняется кинетике первого порядка с константой скорости, равной коэффициенту Эйнштейна Аи/. Излучательное время жизни можно определить как: т0 = (в секундах на переход), 1.1 т.е. время, за которое заселенность возбужденного состояния уменьшится в е раз. Величину Аи; можно определить из экспериментальных данных с помощью спектров поглощения и флуоресценции согласно [186]: где Л А— число Лвогадро (моль 1), с - скорость света в вакууме (см/сек), и - показатель преломления среды, \ ji - среднее значение волнового числа в спектре флуоресценции (см"1), г(у) - спектральная зависимость коэффициента молярной экстинкции (л/моль)-см"\
Если по этой формуле рассчитать значение натурального (излучатслыюго) времени жизни (тд) ДМХ, то оно получится около 5 нс. Теоретически это значение может изменяться в зависимости от положения максимума спектра поглощения и от коэффициента молярной экстннкцпн ДМХ в различных средах, однако обычно не более чем в 2 раза [ 186].
В то же время, в экспериментах квантовый выход флуоресценции ДМХ различается в сотни раз в зависимости от полярности растворителя. Более того, максимальные значения квантовых выходов, которые наблюдались для ДМХ в экспериментах, составляют всего 0,22 в ацетоне и 0,25 в диметилформаміще [26]. Что же является причиной тушения флуоресценции ДМХ? Причины этих процессов никем не были объяснены и поэтому стали предметом нашего исследования.
Впервые зависимость квантового выхода флуоресценции ДМХ от свойств мнкроо кружения исследовалась в начале 70-х годов [48;53] одновременно двумя коллективами ученых. Было показано, что гидроксилыше группы спиртов и воды тушат флуоресценцию ДМХ [86;87], Авторы [86] доказали, что тушение носит динамический характер и обуслойлено, по-видимому, образованием водородной связи между гидрокенльными группами спиртов или воды и карбонильной группой молекулы ДМХ в возбужденном состоянии. Однако причины тушения флуоресценции ДМХ в неполярных средах так и не были выяснены.
Таким образом, природа спектральных свойств ДМХ довольно сложна, и хотя общие закономерности исследованы очень подробно, ясной связи спектральных сдвигов поглощения и флуоресценции, а особенно квантового выхода флуоресценции с микро свойствами среды ранее не было выявлено.
СВ. Цукерман, впервые обнаруживший люминесценцию ДМХ, заметил, что это свойство молекулы пропадает в присутствии кислот [59]. Тогда же он предложил использовать ДМХ как люминесцентный индикатор. В дальнейшем также высказывались идеи использования 4-диметиламинохалкона и его производных как молекулы флуоресцентных хсмосенсоров. В [84] было показано, что флуоресценция молекулы ДМХ, модифицированной бором, обладает селективной чувствительностью к D-фруктозс. Флуоресценция ковалентного комплекса ДМХ - р-циклодекстрин в водной среде обладает избирательной чувствительностью к нонам Си \ по сравнению с ионами Со +, Ni и Zn + [117].
Впервые молекула 4-днмстиламіінохалкона была использована для исследований биологического объекта в 1972 году [53]. Было показано, что молекула ДМХ связывается с молекулой сывороточного альбумина человека; при этом ее флуоресцентные характеристики (спектр флуоресценции и квантовый выход) оказываются весьма чувствительными к конформацнонным перестройкам в белке, индуцируемым изменениями рН. В дальнейших исследованиях было показано, что такие свойства молекулы ДМХ как отсутствие заряда и гидрофобность делают ее очень удобным инструментом в исследовании мембран. Коэффициент распределения молекулы ДМХ в двухфазной системе вода-гептан составляет порядка 1:1000 [85], Более того, как было показано в [24], избирательность для гидрофобных областей биологических объектов не самое важное свойство нового флуоресцентного зонда. Оказалось, что при связывании с липидными мембранами флуоресценция ДМХ возрастает более чем в 50 раз [25]. Таким образом, наблюдая за флуоресценцией зонда, добавленного к суспензии мембран, мы наблюдаем лишь за теми молекулами, которые благодаря гидрофобным взаимодействиям проникли внутрь мембраны. И хотя перечисленные свойства не являлись уникальными (аналогичные данные к этому времени были получены и для многих других люминесцирующих индикаторов), основным преимуществом ДМХ являлась чрезвычайно высокая чувствительность его флуоресцентных параметров к свойствам микроокружения.
Приготовление липосом и липидпых шаров
Фосфолнппдные липосомы получали по методу Батцри и Корна [14]. Для приготовления использовали фосфатиднлхолин из куриных яичных желтков (Харьковский завод бактерийных препаратов, Украина) в виде раствора в этаноле (0,1 г/мл), лиофплизированный лецитин из куриного яйца (99%, "Sigma", США) и холестерин (98%, "Sigma", США). Фосфатиднлхолин растворяли в 95% этаноле до концентрации 28 мг/мл и впрыскивали 1 мл этого раствора через тонкую иглу в 13-кратный объем трис-буфера (0,15 M NaCI, 0,01 М трис-НСІ, рН 7,4), который быстро перемешивался магнитной мешалкой. Полученные таким образом лнпосомы образованы одним бнслоем фосфолппида и имеют диаметр 40-50 им.
Для приготовления липосом из смесей фосфатидилхолина и холестерина ("Sigma", США) лнпиды растворяли в 95% этаноле, и полученную смесь впрыскивали, как в предыдущем случае.
Липпдные шары, моделирующие лппопротеины, готовили по методу [177]. Для этого смесь фосфатидилхолина и триоленна ("Sigma", США) растворяли в изопропаноле (55 С) в молярном соотношении 1:2 (концентрация ФХ около 15 мг/мл) и быстро впрыскивали через тонкую иглу в 9-кратный объем трис-буфера, охлажденного до 8-12С. Полученные таким образом липпдные шары имеют следующую структуру: поверхностный слои образован монослоем фосфолппида, а трнглицериды находятся в ядре частицы. Диаметр шаров около 30 им.
Этанол и изопропанол удаляли из суспензии липосом и липидных шаров диализом против трис-буфера при 6 С в течение 10-12 часов.
Лппопротеины выделяли из сыворотки крови здоровых допоров. Для получения сыворотки кровь забирали в 50 мл пластиковые пробирки, через 30-45 мин тромбовый сгусток, образовавшийся в пробирке, обводили стеклянной палочкой по стенке пробирки. Кровь центрифугировали при 100 g в течение 10 мин для разделения сыворотки и тромбового сгустка. На 6,6 мл сыворотки, помещенные в 10мл пробирку, наслаивали 3,4 мл солевого раствора плотностью 1,006 г/мл (0,18 М NaCI, 0,01% ЭДТА, 0,05% NaN3) и центрифугировали при 6 С и 41000 об/мин в течение 18 часов [114]. Лппопротеины очень низкой плотности (ЛОНП), содержащиеся в 3,4 мл верхнего слоя, отсасывали пипеткой. Для выделения липопротеннов низкой плотности (ЛНП) в сыворотку, оставшуюся после отбора ЛОНП, добавляли 523 мг NaBr и 3,4 мл раствора плотностью 1,006 г/мл и перемешивали, Пробирки центрифугировали при 6 С и 41000 об/мин в течение 18 часов. ЛНП, содержащиеся в 3,4 мл верхнего слоя, отсасывали пипеткой. Избыток солей в суспензии липопротеннов удаляли диализом против трис-буфера при 6 С в течение 10-12 часов.
Лимфоциты из тимуса крысы. Крыс забивали декапитацией, вскрывали грудную клетку, выделяли тимус и помещали его в чашку Петри с охлажденным раствором Хснкса. Тимус фрагментировалп с помощью препаровальной иглы до получения гомогенной взвеси. Полученную суспензию фильтровали через 4 слоя капроновой ткани. Лимфоциты отделяли от обрывков мембран и поврежденных клеток путем двукратного осаждения центрифугированием в растворе Хснкса при 4 С н 100 g в течение 10 мин [77].
Лимфоциты из периферической крови человека. Фракцию мононуклеарных клеток выделяли центрифугированием периферической крови допоров на градиенте плотности [170]. Для удаления тромбоцитов кровь предварительно дефибрипизировали при помощи стеклянных шариков [145]. Для создания градиента плотности под 4 мл крови, разбавленной вдвое раствором Хенкса, подслаивали 4 мл раствора ф и колл-веро графина (плотность 1,077 г/мл). Пробирки центрифугировали при 400g в течение 30 мин. Фракцию мононуклеарных клеток отбирали шприцем с границы раздела фаз плазма/раствор фиколл-верографина. Клетки "промывали" дважды в среде 199 путем центрифугирования при 200g и 4 С в течение 10 мин. Осадок содержал около 76% лимфоцитов и 24% моноцитов [101]. Для получения гомогенной фракции лимфоцитов использовали методику, описанную в работе [136]: осадок суспендировали в среде 199, содержащей 25% эмбриональной телячьей сыворотки, до конечной концентрации 105 клеток/мл. Полученную суспензию разливали по 1 мл в пенициллшювыс флаконы и инкубировали 45-60 мни при 37С. Затем суспензию не прилипших к стенкам флакона клеток осторожно отсасывали пипеткой. Лимфоциты отделяли от обрывков мембран и поврежденных клеток путем двукратного осаждения центрифугированием в растворе Хенкса при 4 С и 100g в течение Юмин. Долю лимфоцитов (в процентах), содержащихся в выделенной фракции "не прилипших клеток11, определяли при микроскопии мазка, окрашенного по Паппенхейму [58]. Во всех экспериментах содержание лимфоцитов в исследуемой суспензии составляло 94-96%. Конечный выход в результате проведения всех этапов выделения составил около 0,5 106 лимфоцитов из 1 мл крови.
Фракцию полиморфнонуклсарных лейкоцитов выделяли по методу [57]. К 12 мл гепаршшзированной крови (концентрация гепарина 20 ед.д./мл) добавляли 1 мл 6% раствора дскстрана в растворе Хенкса. Кровь отстаивалась при комнатной температуре 30-40 мин для оседания эритроцитов. 2 мл лейкоцитарной суспензии помещали в силиконизированную центрифужную пробирку. Для создания градиента плотности подслаивали 2 мл раствора фигалл-верографин (плотность 1,077 г/мл) и центрифугировали при 4 С и 400g в течение 30 мин. К осадку, содержащему смесь гранулоцитов и эритроцитов, добавляли 0,4 мл дистиллированной воды и ресуспендировали при температуре 4 С. Через 45 сек добавляли раствор Хенкса, не содержащий солей Са + и Mg + , до 10 мл и центрифугировали при 4 С и 200g в течение 10 мин. Для полного разрушения эритроцитов процедуру гипоосмотического лизиса повторяли.
Степень "чистоты" выделенной фракции полиморфнонуклсарных лейкоцитов определяли окраской мазка по Паппенхейму. Для этого предметное стекло предварительно обрабатывали 30-40 мкл эмбриональной телячьей сыворотки. Во всех экспериментах содержание гранулоцитов в исследуемой суспензии составляло 94-97%. Перед каждым экспериментом с клетками проводили оценку доли (в процентах) живых клеток. Целостность цптошшматическон мембраны клеток оценивали по проникновению красителя трипанового синего ("Serva", США) внутрь клетки [98]. Долю окрашенных клеток подсчитывали в камере Горяева. Во всех случаях содержание неокрашенных (целых) клеток составляло 94-96%.
Проточный цктофлуориметр для исследования клеток мембранными флуоресцентными зондами
Для исследования флуоресценции зондов в клетках крови был изготовлен проточный цитофлуориметр [16,20] (совместно с ВЛО. Светличным).
Оптическая схема прибора приведена на рис. 2.3. В качестве источника света использовалась ртутная лампа постоянного тока ДРШ 250-2 ("МЭЛЗ", РФ) со стабилизированным источником питания (пульсации потоку-0,1%). Для подачи клеток в фотометрируемый участок используется специальное устройство -проточная камера. В установке использована система проточной камеры (рис. 2.3), предложенная в работе [111] и модифицированная в [180;181;183]. Через стальную трубку (1) с внутренним диаметром около 100 мкм в камеру подается суспензия исследуемых частиц. Через патрубок (2) в камеру подается фильтрованная дистиллированная вода, которая используется как жидкость, сжимающая клеточный поток. Сетчатый фильтр (3) служит для дополнительной стабилизации потока [95], Суспензия клеток и обжимающая жидкость подаются в проточную камеру за счет положительного давления, создаваемого системой вентилей и газовых редукторов. Источником давления служит мнкрокомпрессор. Канал для обжимающей жидкости V-образно сужается, заканчиваясь отверстием (4) с диаметром 100 мкм. За счет соблюдений условий ламинарного потока и закона постоянства потока массы, на выходе из отверстия (4) получается коаксиальная струя с диаметром клеточного потока около 10 мкм. При ударе о покровное стекло (5) струя распластывается по нему, а клеточный поток приближается к внутренней поверхности покровного стекла.
Объектив (7) микроскопа (65 АПО ВИ А=1,1; "ЛОМО", РФ) имеет рабочее расстояние 0,19 мм [49]. При толщине покровного стекла 0,15 мм фокус объектива может располагаться на 40 мкм ниже внутренней поверхности покровного стекла и, таким образом, может быть достаточно точно сфокусирован на центр клеточной струн, так как от точности фокусировки зависит точность измерений [182]. Таким образом, главным достоинством описанной выше проточной камеры является возможность использования высокоапертурного объектива, а это, в свою очередь, позволяет увеличить эффективность светосбора флуоресцентного сигнала, т.е. чувствительность установки. Чувствительность проточного цитофлуориметра зависит также от времени накопления сигнала - времени прохождения клетки через фотометрируемый участок [181]. В нашей установке клетка проходит фотометрируемый участок за 10 мкс. Фотометрируемый участок имеет прямоугольную форму: 30 мкм вдоль направления течения струи и 60 мкм - поперек. Эти величины определяются размером полевой диафрагмы (6) (рис.3.1). Диафрагма расположена в плоскости изображения, создаваемого объективом микроскопа (2). Дихропческое зеркало (7) разделяет флуоресцентный сигнал клетки на две спектральные компоненты: "зеленую" и "красную". Светофильтры (9) служат для дополнительной селекции флуоресцентного сигнала. Линзы (8) проецируют изображение светящейся клетки из плоскости диафрагмы (6) в плоскость фотокатодов ФЭУ-136 ("МЭЛЗ", РФ).
На аноде ФЭУ (1) (рис. 2.4) формируется токовый импульс с амплитудой, пропорциональной интенсивности флуоресценции прошедшей клетки и длительностью, равной времени прохождения клетки через фотометрпруемый участок (около 10 мке), Импульс поступает на входной усилитель (2), который для улучшения помехоустойчивости смонтирован в одном блоке с ФЭУ и представляет собой усилитель тока с крутизиой 0,05 В/мкА. Усиленный импульс (около 500 мВ) поступает на схему выделения и обработки сигнала (3). Полезный сигнал выделяется на интеграторе (За) с постоянной времени около 5 мкс. Низкочастотный шум и постоянная составляющая сигнала выделяются на интеграторе (36) с постоянной времени около 500 мкс и вычитаются из полезного сигнала на сумматоре (4). Далее для усиления сигнала можно использовать линейный усилитель (6), а для увеличения динамического диапазона измеряемых сигналов - логарифмический усилитель (5) с диапазоном перекрытия около трех декад. При превышении сигналом заданного порогового уровня на выходе компаратора (7) вырабатывается строб, инициализирующий работу блока синхронизации (10) и открывающий схему выборки и хранения (8). По окончании строба на выходе схемы выборки и хранения вырабатывается сигнал, равный максимальной амплитуде прошедшего импульса, и запускается 16-ти битовый аналого-цифровой преобразователь (9). После аналого-цифрового преобразования сигнал поступает на ЭВМ (11). Результаты исследования клеток крови с помощью созданной установки описаны ниже (раздел 3.5).
Как было показано в обзоре литературы, оптические свойства зонда ДМХ очень чувствительны к свойствам окружения: в нсполярных средах на 20-30 % снижается сила осциллятора (коэффициент молярной экстиикцнн), в сотни раз падает квантовый выход флуоресценции. До настоящего времени причины этих изменений флуоресцентных параметров ДМХ не получили объяснения (что можно отнести также и к подавляющему большиству других флуоресцентных зондов, высоко чувствительных к свойствам окружения). Один из путей внести ясность в эту ситуацию - квантово-химический расчёт. Методы квантовой химии используют постулаты квантовой механики и оперируют с конкретной молекулой на основании известной химической формулы. Алгоритмы квантово-химических методов реализованы в виде программных пакетов, а мощности современных компьютеров позволяют рассчитывать конформеры молекулы, днпольный момент, а также свойства возбуждённого состояния. Перечисленные параметры принципиально важны для понимания связи между оптическими свойствами молекулы зонда и её структурой. Определить их экспериментально весьма сложно (или иногда невозможно).
Коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции ДМХ в лнпосомах
На левом участке гистограммы, расположены слабо флуоресцирующие шістки. Как было показано выше, флуоресценция зонда ДМХ обусловлена липидной компонентой клеток. Эритроциты и тромбоциты содержат примерно в 40 раз меньше липида, чем гранулоцити [105]. Следовательно, левый участок гистограммы может быть представлен именно этими клетками.
Чтобы убедиться в этом, а также оценить относительный вклад эритроцитов и тромбоцитов в распределение, был проведен следующий эксперимент. Клеточную флуоресценцию зонда ДМХ регистрировали в трех различных образцах аутологичнои донорской крови: - в крови, содержащей нормальное количество эритроцитов и тромбоцитов (кровь с антикоагулянтом); - в образце дефибринизированной крови (концентрация тромбоцитов понижена примерно в 10 раз); в лейкоцитарной суспензии, полученной в результате осаждения эритроцитов декстраном в гепаршшзировашюй крови (концентрация эритроцитов снижена примерно в 100 раз).
Гистограммы раскладывали на составляющие как описано выше (формула 4.3). Кривые 1,2,3 (рис. 4.16) - результат аппроксимации левого участка гистограмм, полученных при регистрации крови с антикоагулянтом, дефибринизнрованнои крови и лейкомассы соответственно. Относительные величины площадей под аппроксимирующими кривыми позволяют оценить вклад тромбоцитов п эритроцитов в гистограмму распределения клеток по флуоресценции ДМХ. Если площадь под кривой 1, аппроксимирующей распределение клеток крови с антикоагулянтом, принять за 100%, то площади под кривыми 2 и 3 равны 41 и 9,7% соответственно. Приведенные результаты показывают, что удельный вклад тромбоцитов в левый участок гистограммы выше, чем эритроцитов. Так как по содержанию общего липида эритроциты и тромбоциты практически не отличаются [105], то различия во флуоресценции ДМХ, по-видимому, обусловлены тем, что ДМХ связывается с мембраной эритроцита и там тушится - скорее всего - гемоглобином, который, как известно, адсорбирован на внутренней стороне мембраны эритроцита. Возможно также, что при регистрации флуоресценции клеток в зоне измерения могут находиться агрегаты, состоящие из нескольких тромбоцитов.
В группе здоровых доноров из 37 человек было измерено среднее значение интенсивности флуоресценции ДМХ в популяции лимфоцитов и гранулоцитов в цельной крови. Среднее значение различий между популяциями лейкоцитов №грачу,,№ш„ф) в этой группе доноров составило 3,5 раза. Таким образом, результаты, приведенные на рисунке 4.10, действительно отражают реальные различия во флуоресценции ДМХ в лимфоцитах и гранулоцитах.
Как видно из этого рисунка (рис. 4.10-1)), положение максимума спектров флуоресценции в гранулоцитах и лимфоцитах также различается. В лимфоцитах максимум приходится на 503 им, как в лнпосомах и во фракции "мембран", полученной при сублсточном фракционировании лимфоцитов. Поэтому можно полагать, что в лимфоцитах флуоресценция исходит в основном из клеточных мембран. Как уже указывалось выше, положение максимума флуоресценции ДМХ в мембранах зависит от соотношения холестерин/фосфолипид. В лимфоцитах оті равно 0,68 (моль/моль), а в гранулоцитах доля холестерина существенно ниже (соотношение 0,52) [105]. Поэтому следовало ожидать, что в гранулоцитах максимум флуо иценции будет несколько "краснее", однако наблюдается обратное: максимум нахо;с..ся в ещё более коротковолновой области (495 им).
В качестве причины коротковолнового цинга спектра ДМХ в гранулоцитах можно было бы предположить наличие внутриклеточных лнполротеиновых частиц. Действительно, максимум спектра флуоресценции ДМХ і. ЛОНП приходится на 495 нм.
Каким образом можно обнаружить шг. :риклсточные липопротеиновые частицы? Если их содержание невелико, то любые мск.::: фракционирования приведут к их потере или разрушению их структуры. Традиционные методы исследования структуры лнпндсодержащпх органелл клетки, каїс правило, не позволяют сохранить клетку живоП, повреждая и саму клетку, и исследуем:.и органеллы (см. обзор лит.). Между тем в последние годы был предложен метод І: .уіепия пространственной структуры липидпых органелл, основанный на безызлучатс; І мм переносе энергии между липофильными флуоресцентными зондами [33], которые -ч кет быть применен in situ. Идея этого метода проиллюстрирована нарис. 4.17.
Если зонд ДМХ связывается не только с поверхностью липидных структур, но и погружается в ядро лпгюпротеиновых частиц, как ото было показано для ЛОНП [40], то, используя безызлучательный перенос энергии на зонд-акцептор (Л), расположенный только на поверхности, можно обнаружить наличие липидных частиц в клетке. Когда безызлучательный перенос между зондами D и А осуществляется на небольшое расстояние (Ro), сравнимое с толщиной бнелоя, тогда в плоском бислое перенос происходит на две поверхности, и расстояние от донора до каждой из них не превышает R0, В мицеллярной же частице перенос идет только на одну поверхность, расстояние до которой может и превышать R0.
В этом методе представлялась уникальная возможность обнаружить внутриклеточные липопротеины прямо в живой клетке, и таким образом избежать артефактов, связанных с нарушением структуры клеток собственными литическими ферментами после её гибели. Для исследования клеток зонды можно использовать прижизненно, не внося радикальных повреждений [30]. Вместе с тем функционирование клеток может повлиять на распределение флуоресцентных зондов между внутриклеточными мембранными органеллами [157]. Дело в том, что для ДМХ удобным акцептором для безызлучателыюго переноса энергии мог бы быть зонд ДСП-12, который локализуется на поверхности лнпнда благодаря наличию положительного заряда. Однако этот положительный заряд мог бы повлиять на распределение ДСП-12 в клетке в соответствии со структурой трансмембранных электрических полей. Предстояло выяснить, влияют ли траисмембраниые потенциалы на проведение намеченного опыта с переносом энергии с ДМХ на ДСП-12.
По имеющимся на сегодняшний день данным, на плазматической н митохондриальных мембранах живого лимфоцита поддерживаются трансмембранные электрические поля. Для лимфоцита крысы их потенциалы соответственно равны -60 и -170 мВ [33]. Наличие трансмембранных полей приводит к тому, что концентрации зонда-катиона на внутренней поверхности плазматической мембраны в 10, а митохондрналыюй - в 5000 - 10000 раз выше его концентрации во внешней среде. Молекулы зондов, наиболее удобных для исследования поверхности липидных структур, имеют заряд +1 (пиридиновые кольца, входящие в состав К-68 и ДСП-12, положительно заряжены) [39]. Следовательно, если в случае электрофоретического переноса один или оба зонда окажутся на внутренней поверхности митохондрии, то результаты безызлучательиого переноса энергии будут ошибочными. В этом, в отличие от липосом и лнпопротеннов, заключается специфика использования этих зондов в исследованиях структуры липидных компонент клетки. Для того чтобы исследовать влияние трансмембранных электрических потенциалов на распределение зондов внутри живой клетки и, следовательно, на регистрируемое значение эффективности переноса энергии, были проведены специальные эксперименты [17], рассмотренные в следующем разделе
