Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Фотосинтетического метаболизм. 13
1.1.1. Типы фотосинтетического метаболизма 13
1.1.1.1. Фотосинтез у с3-растений 13
1.1.1.2. Фотосинтез у сз-растений 14
1.1.1.3. Фотосинтез по типу толстянковых, сам - метаболизм 17
1.1.1.4. Фотосинтез у растений с переходными типами метаболизма 18
1.2. Фотодыхание у растений с с3- и с4- типом метаболизма 19
1.2.1. Гликолатный путь характерный сз-растениям 22
1.2.2. Гликолатный путь характерный с-растениям 25
1.3. Связь восстановительного пентозофосфатного пути с фотодыханием 26
1.4. Гликолатоксидаза 27
1.4.1. Ферментативная реакция и ее механизм 27
1.4.2. Распространение гликолатоксидазы 28
1.4.3. Физико-химические и кинетические свойства гликолатоксидазы 31
1.4.4 Выделение и очистка гликолатоксидазы 35
1.4.5 Характеристика структуры гена и пространственной организации белка гликолатоксидазы 37
1.5. Энергетика процесса фотодыхания 41
1.5.1. Роль фотодыхания в метаболизме растений 43
1.5.2. Роль пероксисомального метаболизма у с4-растений. 50
Глава 2. Материалы и методы исследования. 58
2.1. Объекты исследования 58
2.2. Методы исследования 58
2.2.1. Выделение ферментов из растительных объектов 58
2.2.2. Разделение клеток обкладки и мезофилла с4- растений 59
2.2.3. Определение перекрестного загрязнения тканей 59
2.2.4. Методы определения активности ферментов 60
2.2.4.1. Определение активности го 60
2.2.4.2. Определение активности феп карбоксилазы 60
2.2.4.3. Определение активности надф-зависимой глицеральдегидфосфатдегидрогеназы 60
2.2.5.методы очистки изучаемого фермента 61
2.2.5.1. Очистка го из целых листьев 61
2.2.5.2. Очистка го из клеток обкладки и мезофилла с4 - растений 63
2.2.6. Исследование кинетических характеристик и регуляции ферментов 64
2.2.7. Определение количества белка 64
2.2.8. Определение содержания хлорофилла 64
2.2.9. Определение молекулярной массы нативного фермента 65
2.2.10. Электрофоретические исследования. 65
2.2.11. Определение массы субъединиц фермента 66
2.2.12. Статистическая обработка данных 67
Глава 3. Особенности тканевой специфичности и физико- химических свойств гликолатоксидазы у с4 - растениий 69
3.1. Распространение го в растениях с различным типом метаболизма 69
3.2. Распределение активности го между тканями листа в растениях с, -группы 70
3.3. Определение величин перекрестного загрязнения между изучаемыми тканями 72
3.4.Очистка го из с3 - и с4 - растений 74
3.4.1. Очистка го из с3-растения пшеницы 74
3.4.2. Очистка го из с3 - с4- растения табака 76
3.4.3. Очистка го из целых листьев, мезофилла и клеток обкладки проводящих пучков растений с4 - группы... 80
3.5. Электрофоретические исследования 93
3.6. Изучение каталитических свойств го из листьев пшеницы и клеток обкладки и мезофилла амаранта, сорго, табака, кукурузы 98
3.7. Определение температурного оптимума для го из листьев с4-растений 104
3.8. Изучение влияния метаболитов на активность го 106
3.8.1. Изучение влияния цитрата, изоцитрата сукцината и малата на активность го из с3 - и с4 - растений 106
3.8.2. Изучение влияния глицина и серина на активность го из сз-и с4-растений 117
3.8.3. Изучение влияния ионов кальция, магния, марганца на активность го из с4-растений 123
3.9. Изменение динамики активности гликолатоксидазы в процессе зеленения этиолированных проростков с4- растений 129
Заключение 132
Выводы. 135
Источники литературы. 137
- Физико-химические и кинетические свойства гликолатоксидазы
- Характеристика структуры гена и пространственной организации белка гликолатоксидазы
- Определение активности надф-зависимой глицеральдегидфосфатдегидрогеназы
- Изучение влияния цитрата, изоцитрата сукцината и малата на активность го из с3 - и с4 - растений
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма является одной из важнейших задач современной биологии. Оно имеет как теоретическое, так и практическое значение, поскольку позволяет приблизиться к пониманию функционирования растительного организма, как целостной системы и, благодаря этому, создает условия для решения проблем, связанных с повышением продуктивности и урожайности. Растительная клетка представляет собой совокупность взаимосвязанных органелл, выполняющих разнообразные функции и тесно взаимодействующих между собой. Одним из метаболических звеньев функционирования растительного организма является фотодыхание связывающее такие процессы как фотосинтез и дыхание. Этот процесс имеет важнейшее значение для существования растительного организма и объединяет комплекс клеточных органелл таких как хлоропласты, митохондрии, пероксисомы. Процесс фотодыхания представляет собой стимулируемое светом поглощение О2 и вызванное этим окисление промежуточных продуктов фотосинтеза с выделением СО2 ( при этом не имеет ничего общего с типичным митохондриальным дыханием в привычном понимании этого слова). В процессе фотодыхания первичным продуктом является гликолевая кислота, и его дальнейшая метаболизация связана с гликолатным путем. Этот путь получил название гликолатного. У Сграстений для защиты от фотодыхательных потерь существует функциональное разделение фото синтетических процессов между клетками обкладки и мезофилла. В клетках обкладки достигается уменьшение
8 содержания Ог, что приводит к снижению оксигеназной активности РУБФ-
карбоксилазы. Оксидаза L-2-гидроксикислот (гликолат: Ог-оксидоредуктаза,
КФ 1.1.3.15) (ГО) распространена в пероксисомах фотосинтетических тканей
и является ключевым ферментом фотодыхания. Она окисляет различные 2-
гидрокислоты, но более специфична к гликолату. В ГО-реакции электронный
перенос с гликолата связан с флавином (FMN) - акцептором, с которого
электроны далее переходят на Ог с образованием пероксида водорода,
который затем разлагается каталазой. Помимо флавиновой ГО, сообщалось о
присутствии в этиолированных и зеленых листьях пшеницы альтернативной
формы ГО, акцептором электронов для которой служит ферредоксин. Она
локализована в цитозоле и является очень нестабильной. Фермент ГО был
выделен преимущественно из широкого ряда Сз-растений и некоторых Сг
растений. Представители d- растений обладают высокой биологической
продуктивностью, так как в результате эволюционных адаптации хорошо
приспособлены к современной окружающей среде. Главной отличительной
особенностью их является отсутствие или очень низкая интенсивность
фотодыхательного метаболизма. Эти отличия у Са — растений напрямую
связаны с наличием кранц-анатомии листа. Сравнение свойств ГО из
растений с различными типами фотосинтеза (Сз, Сз-4, С^) показало, что
различные виды гликолатоксидазы из Сз и Сз-гпромежуточных растений
похожи, но очень отличаются от ГО из Сграстений. Из литературных
данных известно, что ключевой фермент фотодыхания гликолатоксидаза у С4
-растений обнаружена как в клетках обкладки, так и в мезофилле. В связи с
этим возникает вопрос о функциональной роли мезофильной ГО. В
настоящее время считается, что фотодьтхательный метаболизм,
9 локализованный в клетках обкладки, обеспечивается С2-кислотой
(гликолатом), благодаря оксигеназной реакции РУБИСКО, а гликолатный
путь в мезофилле преимущественно использует гликолат, источником
которого является взаимодействие кетокислот с перекисью.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы было исследование каталитических и регуляторных особенностей изоформ ГО из клеток мезофилла и обкладки Сграстений.
В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:
Разработать методику разделения различных тканей листа (паренхимной обкладки и мезофилла) различных видов С4 -растений и исследовать распределение ключевого фермента гликолатного пути - гликолатоксидазы - в них. Провести анализ закономерностей распространенности гликолатоксидазы у растений с различным типом метаболизма.
Выполнить разделение изоформ гликолатоксидазы с различной тканевой специфичностью из листьев С4 - растений: кукурузы, амаранта, сорго, табака.
Провести очистку изоформ гликолатоксидазы из различных тканей листьев кукурузы, амаранта, сорго, табака и сравнить их физико-химические и каталитические свойства. Провести электрофоретические исследования очищенных препаратов выделенных изоформ.
Исследовать механизмы регуляции различно локализованных форм ГО из нескольких видов С4-растений.
Изучить возможное изменение активности гликолатоксидазы в листьях этиолированных растений при зеленении. Установить взаимосвязь изменения активности изоформ ГО с динамикой накопления хлорофилла у исследуемых растений.
Научная новизна работы.
Нами модернизированы методы разделения клеток паренхимной обкладки и мезофилла Ci-растений, и разработана схема очистки ГО из различных тканей Сз-, Сграстений, а также из растений с переходным типом метаболизма (Сз-С^-типом). Впервые нами были параллельно очищены ферментные препараты ГО из клеток мезофилла и клеток паренхимной обкладки амаранта, кукурузы и сорго, а также изучены каталитические свойства этих изоформ, в сравнении с ГО из клеток обкладки и мезофилла Сз-С.4-типа растения - табака и листьев Сз - растения - пшеницы. Ферментный препарат ГО из клеток обкладки и мезофилла С4-группы растений получен в гомогенном состоянии, для этого фермента были определены показатели молекулярной массы полученных изоформ, а также молекулярные массы и количество отдельных субъединиц фермента. Проведена работа по исследованию регуляции активности различных изоформ ГО из Сз, С3-С4, С* - растений: пшеницы, табака, амаранта, сорго, кукурузы отдельными метаболитами дыхания и гликолатного пути. Выявлены показатели температурного оптимума для данного фермента из вышеуказанных групп растений. Определены константы активации для изоформ ГО при воздействии некоторых метаболитов дыхания и гликолатного пути. Выявлена роль ионов двухвалентных металлов в регуляции активности ГО из различных типов клеток.
Практическая значимость исследования.
Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о механизмах сопряжения анаболических и катаболических процессов в клетках высших растений, представляют целостную картину для понимания процессов функционирования комплекса органелл клеток (пероксисом, митохондрий, хлоропластов) в системе биохимических механизмов фотосинтеза и фотодыхателыюго метаболизма. Мнение о том, что фотодыхание снижает
урожайность и продуктивность сельскохозяйственных культур, наталкивается на противоречие при наличии факта нежизнеспособности искусственнополученных мутантных растительных форм дефицитных по ферментам фотодыхательного метаболизма,(Вlackwell R. D., 1990; Leegoon R. С. [at al.],1995; Igamberdiev A. U., 2001). В данной работе показана высокая активность ГО - ключевого фермента гликолатного пути - у Cj-растений, что подтверждает важность этого процесса у всех групп высших растений.
В результате исследований были получены гомогенные
препаратыизоформ ГО, что дает возможность для аналитического определения гликолата посредством применения полученных гомогенных препаратов гликолатоксидазы. Гомогенные препараты изоформ ГО, полученные из ряда растений, могут также найти применение в биохимических исследованиях. Материалы по результатам работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета. Результаты исследований вошли в курсы лекций по физиологии растений, биохимии, спецкурсы «Фотосинтез» и «Дыхание растений», кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях. Они были представлены на 6— ,1Ш и 9Ш международных Путинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002, 2003, 2005), V-ом съезде общества физиологов растений России, международной конференции «Физиологов растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза 2003), годичном собрании общества физиологов растений России и международной научной конференции "Проблемы физиологии растений севера" (Петрозоводск 2004), межрегиональной конференции «ИОНИТЫ-2004» (Воронеж, 2004), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005),
ежегодной научной секции отчётной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (2004, 2005).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 16 публикациях - 11 статьях и 5 тезисах.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (257 источников). Иллюстрационный материал включает 45 рисунков, 21 таблицу.
Физико-химические и кинетические свойства гликолатоксидазы
Этот цикл впервые описали австралийские ученые М.Д. Хетч и К.Р. Слек в 1966 году (отсюда - цикл Хетча и Слека), а также Л. Клечковский в своих работах осветил ряд исследований по проблематике фотосинтеза С4-типа. С4- фотосинтез присущ только таким покрытосеменным растениям, у которых есть фотосинтезиругопше клетки двух типов: клетки мезофилла и кранц-клетки (клетки обкладки проводящих пучков). Главными первичными продуктами Сгфотосинтеза являются С4-дикарбоновые кислоты: оксалоацетат, малат и аспартат. С4 - фотосинтез включает в себя, так называемый, челночный механизм переноса СОг из атмосферы в ВПФП, протекающий в клетках обкладки проводящих пучков, для функционирования которого необходим быстрый перенос определенных метаболитов между клетками мезофилла и клетками обкладки проводящих пучков. Этот механизм создает относительно высокую концентрацию С02 в клетках обкладки, значительно превышающую нормальную концентрацию С02, которая устанавливается в результате диффузии СОг в лист из окружающей среды с низким содержанием С02 (0,03%), В результате чего СОг становится нелимитирующим субстратом фотосинтеза, а это приводит к подавлению фотодыхания (Black С. С, 1973).
Сгцикл можно разделить на 2 стадии: карбоксилирование в клетках мезофилла и декарбоксилироваяие в клетках обкладки. Эти реакции происходят на свету. На стадии карбоксилирования СОг фиксируется при участии ФЕП-карбоксилазы, что является общим для всех С4 -растений. В зависимости от фермента, осуществляющего реакцию декарбоксилирования,Сграстения подразделяются на 3 группы: 1) НАДФ-МДГ-тип (малатный тип) характерен для кукурузы, сорго, сахарного тростника. НАДФ-МДГ, с помощью которой происходит декарбоксилирование, локализована в хлоропластах клеток обкладки. Главными метаболитами, вовлеченными в обмен между клетками, являются малат и пируват. У растений этой подгруппы транспортировка малата обеспечивает передачу восстановительной силы из мезофилла в клетки обкладки проводящих пучков. Хлоропласты в клетках обкладки проводящих пучков смещены в направлении от проводящего пучка и в подавляющем большинстве лишены гран. Клетки обкладки не имеют фотосистемы II, и они могут за счет челночного механизма обмена передавать свыше половины всей ФГК в клетки мезофилла, где этот метаболит восстанавливается. То есть, именно в клетках мезофилла у растений этого типа первично образуется НАДФН (Walker G. Н., Izawa S., 1979). 2) НАД-МДГ-тип (аспартатный тип) присущ портулаку огородному, просу южному. Главные метаболиты, мигрирующие между клетками мезофилла и обкладки это аспартат и аланин. НАД-МДГ находится в митохондриях клеток обкладки. У данного типа растений во всех типах клеток наблюдается повышеная активность аспартатаминотрансфераз и аланинаминотрансфераз. У этих растений хлоропласты обкладки проводящих пучков имеют оформленные граны и смещены по направлению к проводящему пучку. 3) ФЕП-карбоксилазный тип характерен для хлориса, проса крупного. Самым ранним из первичных продуктов фотосинтеза обычно является аспартат, который служит и главным метаболитом, транспортируемым из клеток мезофилла в клетки обкладки. Декарбоксилирующий фермент- ФЕП-КК, локализована в цитоплазме клеток обкладки. Хлоропласты клеток обкладки проводящих пучков имеют также оформленные граны, которые расположены по периферии клеток обкладки. Для синтеза аспартата у двух последних подгрупп необходим лишь АТФ. У растений в данных подгруппах местом первичного образования НАДФН, используемого для восстановления ФГК, являются хлоропласты обкладки проводящих пучков. У растений аспартатного и ФЕП - карбоксикиназного типа от 60 до 75% хлорофилла листа находится в хлоропластах обкладки проводящих пучков, это отличает их от растений малатного типа, у которых большая доля хлорофилла листа находится в клетках мезофилла. Фотосистема И активна в хлоропластах как одного, так и другого типов клеток. Необходимая потребность в источнике энергии для связывания 0( у растений всех вышеуказанных групп одинакова. Источником дополнительной энергии, более чем та, что требуется длявосстановительного пентозофосфатного пути, служит АТФ, необходимый для снабжения энергией С - цикла (Gutierrez М., Gracen V. Е., Edwards G. Е., 1974). В случае, когда исходным продуктом С - фотосинтеза является аспартат, для протекания С.( - цикла необходимо наличие фондов аспартата и аланина. Такие фонды могут поддерживаться за счет восстановления азота (восстановление нитратов до солей аммония и образование аминокислот). При этом восстановление азота не связано непосредственно с синтезом аспартата в ходе фиксации СОг в С.) - цикле, т. к. аминогруппа аспартата постоянно обменивается в процессе реакций переаминирования, катализируемых аспартатаминотрансферазами и аланинаминотрансферазами; У ФЕП - карбоксикиназных растений для поддержания азотного обмена используется челночный:обмен пирувата и аланина или 2 - оксоглутарата и глутамата, в результате которого аминный азот переносится из клеток обкладки в клетки мезофилла.
Несмотря на то, что различные типы С4-фотосинтеза, по-видимому, имеют конвергентное происхождение, наиболее эволгоционно продвинутым считается: НАДФ-МДГ-тип. В данном случае декарбоксилирование: не связано с митохондриями, а происходит при участии хлоропласте в; В результате чего наблюдается их дальнейшая: специализация в пределах: клетки обкладки и возникают 3 типа структурной организации хлоропласте в: содержащие редуцированные граны, содержащие нормальные граны и не имеющие гран (Мокроносов AT., 1983). Кроме общеизвестных признаков кранц-анатомии у Сграстений наблюдается плотная упаковка мезофилла, что способствует предотвращению потери1 внутреннего COj. Мезофилл тесно связан с обкладкой множеством плазмодесм, что обеспечивает транспорт веществ.
Характеристика структуры гена и пространственной организации белка гликолатоксидазы
Имеются данные о наличии гена, кодирующего гликолатоксидазоподобный белок в организме человека. Так в клетках печени человека изолирована с - ДНК, кодирующая белок со свойствами ГО. 370 аминокислотных остатков этого белка сходны с последовательностью АК в ГО из печени мыши на 89% и на 53% - со свойствами фермента из шпината и арабидопсиса (Williams Е., Cregeen D., Rumsby G., 2000).
Было проведено исследование ферментов гликолатного пути в этиолированных семядолях культурной сои и двух линий дикой уссурийской сои. Активность ГО в этиолированных семядолях была значительной и существенно возрастала у культурного вида (Игамбердиев А.У., Лавлинский А.В., 1989). Роль ГО в этиолированных семядолях представляется неясной, однако есть предположение о том, что она может участвовать в реокислении глиоксисомального НАДН, когда другие врзможные механизмы оказываются недостаточными (Toibert N.E., 1971). При этом глиоксилат восстанавливается до гликолата, что сопровождается окислением НАДН (процесс генерируется изоцитратлиазой), а затем гликолат окисляется ГО до глиоксилата, который далее конденсируется с ацетилСоА в малат. Быстрое реокисление глиоксисомального НАДН является главным условием работы глиоксилатного цикла. Таким образом здесь прослеживается прямая связь циклов - гликолатного и глиоксилатного (Сіопі М., Pinzauti G.s Vanni P., 1981).
У большинства водорослей пероксисомы не связаны с гликолатным путем, ферменты которого локализованы в митохондриях (Frederick S.E., Gruber P.J., Toibert N.E., 1973). Вместо ГО у них присутствует только ГДГ, а гликолат выделяется в окружающую среду. У некоторых водорослей, например, Rhodophyceae (группа красных водорослей) в пероксисомах обнаруживается ГО - активность. У вольфии также обнаружено наличие гликолатного пути, хотя активность ее ферментов, включая ГО, очень низка (Bykova N. V., Popova I. V., Igamberdiev A. U.,1998).
Так ранее была показана возможность существования нескольких изоформ ГО, обладающих различными свойствами и имеющих разную локализацию (Havir Е.А., 1983). Гликолатоксидаза — является сильнощелочным белком с изоэлектрической точкой 8.0-9.6 (Ernes M.J., Erismann К.Н., 1984). ГО обычно состоит из нескольких субъединиц с молекулярной массой от 37 до 48 кДа у разных видов растений (Hall N.P., Regiani R., Lea P.J., 1985). У человека белок, обладающий гликолатоксидазной активностью, имеет молекулярную массу 43 кДа (Williams Е., Cregeen D.} Rumsby G., 2000). Были описаны формы фермента, содержащего от 2 до 16 субъединиц, однако, имеется точка зрения, что фермент существует в форме тетромера, а формы с большим количеством субъединиц образуются в результате агрегации в ходе очистки (Игамбердиев 1985). Фермент из Сз - растений пшеницы, ячменя, гороха, шпината является гомотетрамером с молекулярной массой 160 - 180 кДа (Frigerio N. A., Harbury Н. А., 1958; Kerr M.W., Groves D., 1975), а фермент из кукурузы и сахарного тростника (Сграстения) имеет молекулярную массу 290 - 310 кДа, и, вероятно, существует в клетке в виде октамера (Hall N.P., Regiani R., Lea P.J., 1985). Гликолатоксидаза присутствует не только в листьях зеленых растений, но и в этиолированных и альбиносных тканях в присутствии экзогенного гликолата обнаруживается активность ГО, которая значительно возрастает при зеленении и это связано как с активацией самого фермента светом, так и возрастанием содержания матричной РНК (Tsugeki R,, et al.,1993).
Обнаружено, что в растениях ряски, растущей на NFL/, молекулярная масса ГО вдвое больше, чем в растущих на NO3" (Roch-Bejerano N., Lius S.H., 1973; Тищенко Н.Н., Белоног Н.П., 1985). Поэтому, хотя в ряде случаев изменения агрегации субъединиц могут быть связаны с процедурой очистки, они, очевидно, имеют место и in vivo, благодаря чему достигается регуляция активности фермента.
В ряде работ отмечена прямая зависимость активности ГО от интенсивности света (Zelitch J., Ochoa S., 1977) и температуры (Игамбердиев А.У., 1990). Однако в литературных источниках не достаточно данных о динамике активности ГО связанной с возрастными изменениями организмов. По данным К.Н. Самина и В. Норманна, в ювенильных листьях табака и цитрусовых растений активность ГО была очень слабой (Salin MX., Norman P.H., 1971). Активность же данного фермента в онтогенезе значительно увеличивалась (в 2 - 7 раз). Есть данные, что максимальные значения активности ГО, выделенные из листьев пшеницы, проявляются в период цветения растений, а минимальные - в период кущения - в начале выхода в трубку (Есюнина А.И., 1959). Высокие различия активности ГО в онтогенезе яровой пшеницы обусловлены потенциальной возможностью фермента окислять гликолат с разной скоростью, в зависимости от возраста растений (Ганс В.К., Пискунова Н.П., 1985).
Важнейшим свойством ГО является ее широкая специфичность. Фермент может окислять разнообразные L-2-гидроксики слоты и далее проявлять некоторую специфичность к D-2-гидроксикислотам. Следует отметить высокую активность ГО в присутствии в качестве субстрата глиоксилата. Это связано с тем, что в растворах глиоксилат находится в гидратированной форме и по структуре является 2-гидроксикислотой. При окислении глиоксилата образуется оксалат (Chang С. - С, Beevers Н., 1968). В растениях, накапливающих оксалат, ГО слабо ингибируется оксалатом, что облегчает данный процесс (Игамбердиев А.У., Землянухин А.А., Родионова Л.Г., 1988).
Определение активности надф-зависимой глицеральдегидфосфатдегидрогеназы
На сегоднешний день нет единого мнения, почему одни растения способны к фотодыханию, а другие нет. Одно из объяснений заключается в том, что фотодыхание устраняет избыточную энергию, возникающую за счет фотохимических процессов, и таким образом предотвращает фотоингибирование фиксации СОг, которое может вызываться фотоокислением и разрушение фотохимического аппарата. Фотодыхание защищает растение от фотодеструкции в тех случаях, когда ограничение доступа СОг выражено особенно сильно во время недостатка воды и при высокой температуре. Так, например, при очень низкой концентрации СОг энергия рассеивается без реальной фиксации СО2 (Krause G. Y. at al, 1978).
В окислительной ветви фотодыхания (гликолатном пути) энергия рассеивается в фосфогликолатфосфотазной и гликолатоксидазной реакциях, а в восстановительной (глицератный путь) - энергия затрачивается на восстановление гилроксипирувата в пероксисомах и фосфорилирование глицерата в хлоропластах (Маслов А. И., Кузьмин А. Н., Романова А. К., 1991). Образующийся при окислении рибулозо-1,5-бисфосфата фосфогликолат превращается в хлоропластах в гликолат, который мигрирует в пероксисомы, где в присутствии Оз окисляется до глиоксилата гликолатоксидазой.
Еще один источник образования гликолата - транскетолазная реакция цикла Кальвина (когда скорость карбоксилирования РуБФ превышает потенциальные возможности использования триозофосфатов в биосинтетических реакциях и в реакции окисления органических кислот под действием 0{) (Кээрберг О.Ф., 1989). У С - растений основной путь фото дыхательного метаболизма осуществляется по ЩУК-оксидазному механизму с участием только восстановленных форм кислорода (Любимов В. Ю., 1985). Также показана возможность синтеза гликолиевой кислоты из пирувата с участием цитоплазматической ИЦЛ в листьях табака на свету (Zelitch I, 1988).
Образование гликолата служит началом фото дыхания. Дальнейшее его превращение происходит в хлоропластах, пероксисомах и митохондриях. Фото дыханию отводится некоторая положительная роль в обеспечении клеток промежуточными веществами (глутамат, у-глутаровая кислота, глицин, серии, глицерат и т.п.), важными для дальнейших синтезов (Leegood R. С. at al., 1995). Все это свидетельствует о том, что фотодыхание нельзя рассматривать как бесполезный или вредней процесс.
Интенсивность метаболизации гликолата может определяться не только регуляцией синтеза ГО, но и модуляцией ее активности соотношением ингибиторов, активаторов, в частности путем диссоциации и ассоциации субъединиц (Магомедов И. М., 1985). Путь окисления гликолата возможен и в цитоплазме: через ЛДГ, которая специфична и к гликолату, вероятно, существует и цитоплазматический пул ГО. Фотодыхание способствует поддержанию постоянства СОг внутри листа. У растений Сртипа существует другой механизм поддержания концентрации СОг (фиксация его ЩУК). Фотодыхание тесно связано с общим метаболизмом в зеленой клетке, оно часто усиливается при уменьшении потребности растений в продуктах фотосинтеза и, в принципе, направлено на поддержание активности ферментативных систем и функции хлоропластов и митохондрий (Мокроносов А.Т., 1983).
Глиоксилат, образующийся из гликолата, может аминироваться до глицина, из двух молекул которого в митохондриях образуется серии, при этом выделяется ССЬ (HavirE. А., 1986).
В фотосинтезирующей растительной клетке глиоксилат, оксалат, формиат и другие фотодыхательные интермедиаты участвуют в регуляции метаболизма и механизме передачи информационных сигналов. Глиоксилат участвует в регуляции активности Рубиско как самого фермента так и процесса его активации (Hausier R. Е., 1996), он также регулирует активность митохондриальных ферментов, активирует альтернативную оксидазу как и пируватоксидазу (Day D. A., Wiskich J. Т., 1995), ингибирует ИДГ, особенно в сочетании с оксалоацетатом (Omran R. G.s Dennis D. Т., 1971) и глициндекарбоксилазны и комплекс (Peterson R. В., 1982). Глиоксилат также ингибирует перенос гликолат/глицерат через мембрану хлоропластов, который объединяет звенья фотодыхательного пути между хлоропластами и цитозолем (Robinson S. Р., 1982). Гидрокси пиру ват может вызывать сходные с глиоксилатом эффекты, но его концентрация в клетке значительно ниже из - за высокой эффективности работы НАДН/НАДФН зависимых редуктаз (Givan С. V., Kleczkowski L. А., 1992).
Образующийся в ходе фотодыхания глицерат оказывает влияние на активность хлоропластных ферментов: седогептулозы -1,7 бисфосфотазы и фруктозо - 1,6 бисфосфотазы ( Igamberdiev A. U., Kleczkowski L. А., 1997). А при снижении редокс - потенциала аккумуляция глицерата приводит к уменьшению скорости фотосинтеза. Т. е., фотодыхательные интермедиаты играют важную роль в регуляции фотосинтеза и митохондриального дыхания.
Накопление органических кислот растениями, связанное с фотодыханием, можно рассматривать как процесс, в некотором смысле аналогичный потере ССЬ. Так, при окислении глиоксилата перекисью образуется формиат и СОг. Несмотря на то, что значение этой реакции in vivo не велико, при торможении метаболизма глицина и синтеза глутамина ее интенсивность может возрастать (Мокроносов А.Т., 1983).
Очень многие растения накапливают оксалат - весьма инертное соединение, хотя и используемое в метаболизме клетки (Chang С. - С, В ее vers Н., 1968). Ряд авторов связывают образование оксалата с активностью ГО и ЛДГ, способных не только осуществлять основную реакцию, но и окислять глиоксилат до оксалата (Havir Е. А., 1984). В растениях, накапливающих оксалат, ГО слабо ингибируется оксалатом, что облегчает данный процесс. Имеется и другой путь образования оксалата -расщепление ОАА, однако он, вероятно, характерен преимущественно для нефотосинтезирующих тканей. Если оксалат не используется в метаболизме, его роль может сводиться только к формированию жесткого скелета растения. Оксалат вовлекается в метаболизм через оксалил-СоА, но не исключено, что он восстанавливается до гликолата при помощи ЛДГ или вступает в реакцию конденсации с малатом или сукцинатом (Землянухин А. А. и др., 1987).
Изучение влияния цитрата, изоцитрата сукцината и малата на активность го из с3 - и с4 - растений
По-видимому, роль фотодыхания наиболее велика в условиях постоянного обезвоживания клеток растений как механизма для предотвращения падения концентрации СОг и истощения субстрата дыхания путем стабилизации фотосинтеза.
Энергетически неэффективное пероксисомальное окисление, приводящее к образованию пула органических кислот и аминокислот, является важным условием объединения реакций энергетического и конструктивного обмена, протекающих в разных компартментах клетки, в единую целостную регулируемую систему. За счет реакций, надстраивающихся над реакциями флавин-зависимого окисления происходит интеграция метаболизма хлоропластов, цитозоля и митохондрий, при этом соединения, которые не могут быть окислены в митохондриях, подвергаются несопряженному с синтезом АТФ окислению в пероксисомах.
Таким образом, на сегодняшний день доказано существование и функционирование гликолатного пути или отдельных его звеньев в различных живых организмах, в том числе водорослях, растениях и некоторых животных. И гликолатоксидаза - ключевой фермент фотодыхания, является универсальным белком для большинства изученных организмов (за исключением простейших и некоторых видов водорослей, у которых гликолат экскретируется во внешнюю среду и функции ГО выполняет ГДГ) (Yokota А., 1992). Этот фермент представлен во всех группах высших растений, но при этом слабо изучена его тканевая специфичность в растениях с неоднородной анатомической структурой листа, данные по этому вопросу противоречивы и неоднозначны. В условиях постоянно меняющихся факторов среды гликолатный путь играет ключевую роль в обеспечении растительной клетки промежуточными субстратами для поддержания нормальной интенсивности обменных процессов. Пероксисомальный метаболизм в целом и гликолатный путь в частности играет ключевую роль в формировании устойчивости растений к болезням и стрессам. Фотодыхание и ГО моделируются условиями среды, что связано с изменением интенсивности дыхания, работы фотосинтетического аппарата и разобщением электронного транспорта в условиях стресса. Но в имеющихся литературных источниках не представлены данные о том, как влияют факторы среды на активность ГО в различных по функциональной нагрузке тканях одного растения и растениях с различным типом метаболизма, в том числе и растениях, где существуют механизмы подавления оксигеназной функции Рубиско. Для Сд - растений на сегодняшний день доказано существование процессов фотодыхания. И не смотря на его малую интенсивность оно , по-видимому, имеет большое значение для представленной Сі группы.
Для Сд-растений СОг образуется в ответ на снижение концентрации СОг в воздухе, фотодыхательная активность ограничивается концентрацией СОг в ткани проводящих пучков, где она в 3-20 раз выше, чем в окружающем воздухе (Мароко и др. 2000). Однако во время активного фотосинтеза концентрация Ог в обкладке также возрастает в несколько раз, а образование фотодыхательных метаболитов достигает почти половины нормальной концентрации в Сз- растениях (Фариней и др. 1984). Ог также образуется в хлоропластах мезофилла для активного синтеза; АТФ, необходимой для поддержания работы Ct- цикла (Мароко и др. 2000). Такое равновесие в образовании Ог и фотодыхании детерминирует продуктивность Сг растений. В Сг растениях активность ферментов гликолатного пути не очень высока, ниже, чем в Сз- растениях, но ограничивается клетками обкладки, исключая глицерат киназу, которая присутствует в клетках мезофилла (Лью и Блэк 1972, Осмонд и Харрис 1971, Изуда и Эдварде 1980). С4- растения также имеют ферменты редуцирующие глиоксилат в гликолат (Клецковский и Эдварде 1989).
Ограничение фото дыхательного пути и окисления глицина в клетках обкладки заменяет выделение СОг в окружающую среду на его реассимиляцию. Гликолат может появляться в С - растениях через путь окисления органических кислот (таких как оксалоацетат и малонат) по типу Мэллера, супероксидными радикалами и НгОг (Карпилов и Любимов 1977, Гаудиллерре и др. 1983). Эта реакция также может быть активна в клетках мезофилла, где хлоропластами активно продуцируется Ог (Марокко и др. 2000).
Лаиск и Эдварде (1998) показали, что темп электронного транспорта, сверх нормы, необходимой для фиксации СО2 в С4- растениях, была очень чувствителен к присутствию Ог в газовой фазе, резкое возрастая от 0,01-0,1% ( и до 2% 02, это было примерно 2/3 от 21% (. Это показывает важность Мелеровской кислородной редукционной реакции как электронной воронки, по сравнению с фотодыханием в Сграстениях. Используя С -растения с дефицитом в Сз.С-гЦиклах, было показано, что вклад в Сз-,Сг циклы может быть сбалансирован для максимальной эффективности (Мароко и др. 1998). Ограничения в.С4- цикле из-за дефицита ФЕП-карбоксилазы приводит к появлению Сз- подобных свойств (повышенное фотодыхание) в то время как ограничение в Сз-цикле из-за дефицита Рубиско приводит к утечке СОг при функционировании Сгпути (Мароко и др. 1998).
Таким образом обзор литературных данных показывает, что фото дыхательный метаболизм является универсальным принципом для растений с различным типом метаболизма. Данный метаболический путь наиболее полно исследован для Сз-растений, тогда как роль этого процесса в различных тканях С4-растений остается неизученной. Обнаружение ключевого фермента гликолатного пути в клетках мезофилла и паренхимной обкладки Сграстений и специфичных для различных тканей изоформ этих ферментов (Popov at all 2005), ставит вопрос об изучении роли этих изоформ, выделенных в гомогенном виде из различных тканей. В частности, чрезвычайно интересным представляется изучение каталитических, физико-химических и регуляторных свойств изоформ ГО, выделенных ранее из мезофилла и клеток паренхимной обкладки кукурузы (Popov at all 2005). Это необходимо для сравнения свойств ГО из Сз и различных типов тканей СА-растений и может быть полезным для изучения для изучения физиологической роли изучаемого фермента.
