Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Обзор литературы 11
2.1. Современные представления о строении прокариотической клетки и химической композиции основных структурных элементов клетки 11
2.2. Структура бактериальных эндоспор 42
2.3. Дезинфектанты. Антимикробные и физико - химические свойства дезин- 45 фицирующих препаратов
2.4. Химические основы взаимодействия перекиси водорода с микроорганизмами 51
3. Материалы и методы 64
4. Собственные результаты 69
4.1. Разработка методов качественного и количественного цитологического анализа бактерий и микробной биомассы после воздействия дезинфектанта-ми 69
4.2. Электронно-микроскопическое изучение тонкой структуры бактерий и спор последействия перекиси водорода 72
4.3. Особенности действия перекисного дезинфектанта ПВК-2 на микробные клетки и споры 83
4.4. Физико - химические и антимикробные свойства перекисных композиций Грилен и Дезоксон-4 100
4.5. Антимикробные свойства нового класса перекисных дезинфектантов -пероксогидратов 117
4.6. Особенности действия перекисных дезинфектантов 127
5. Заключение 130
6. Выводы 132
7. Список литературы 134
- Современные представления о строении прокариотической клетки и химической композиции основных структурных элементов клетки
- Химические основы взаимодействия перекиси водорода с микроорганизмами
- Электронно-микроскопическое изучение тонкой структуры бактерий и спор последействия перекиси водорода
- Антимикробные свойства нового класса перекисных дезинфектантов -пероксогидратов
Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы
Дезинфекция является обязательным и важнейшим мероприятием в очагах инфекционных заболеваний и на этапах медицинской эвакуации, а также при профилактике для предотвращения микробиологического загрязнения помещений, приборов, оборудования, белья и т.д.
В медицине, ветеринарии, сельскохозяйственной и агрономической практике и в других отраслях народного хозяйства активно применяется текущая и профилактическая дезинфекция.
Обеспечение надежных санитарно-гигиенических условий в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях медицинской и микробиологической промышленности, занятых получением лекарственных форм, энтомоцидных и вакцинных препаратов, определяется системой мер неспецифической профилактики -дезинфекцией и стерилизацией. За последние десятилетия для дезинфекции предложено огромное количество химических соединений. Однако, жесткие требования, предъявляемые к дезинфектантам, прежде всего такие, как обеспечение высокой эффективности устранения патогенных микроорганизмов и отсутствие неблагоприятного действия на людей, животных и растения, позволяют использовать на практике лишь ограниченное число препаратов [14, 77, 117].
В связи с этим важное место в дезинфектологии занимают вопросы поиска, разработки и внедрения в медицинскую и микробиологическую практику новых высокоэффективных и безвредных для окружающей среды дезинфекционных средств.
Для решения этой задачи требуется проведение исследований по установлению и расшифровке механизмов действия дезинфектантов на возбудителей инфекционных
заболеваний, оценки характера и степени влияния различных физических, химических и биологических факторов на качество и надежность дезинфекции [14, 117].
Широко применяемая на протяжении многих десятилетий перекись водорода наряду с уникальными качествами, такими как высокая бактерицидная и спороцидная активность, стабильность при хранении, безвредность продуктов распада, обладает и существенными недостатками: вызывает коррозию металлов, повреждает различные материалы, при попадании на кожу вызывает ожоги и дерматит, и т.д.
Поэтому в последние десятилетия в Российской Федерации и других странах активно ведутся исследования по созданию композиций на основе перекиси водорода - сочетаний активно действующего вещества с полезными добавками к ним с целью получения высокоэффективных и безвредных препаратов [25]. В процессе этого поиска различные научные школы страны создали ряд новых, уникальных перекисных композиций - таких как перекись водорода-катамин (ПВК-2), Грилен, Дезоксон-4, пе-роксогидраты фторида калия (ПФК-1, ПФК-2, ПФК-3) [59; 76; 83; 104; 113].
Часть этих композиций уже успешно применяются в ветеринарной и медицинской практике, другие находятся на стадии внедрения.
Однако вопросы применения этих новых дезинфектантов в очагах особо опасных инфекционных заболеваний и на этапах медицинской эвакуации остаются открытыми. Это связано с тем, что до настоящего времени не исследованы достаточно полно антимикробные свойства этих композиций, не раскрыт механизм действия этих дезинфектантов на бактериальные клетки и споры, не исследованы физико-химические свойства рабочих растворов препаратов, нет сведений о дезинфицирующих свойствах этих композиций в натурных условиях.
В связи с этим особую актуальность имеют исследования механизма действия новых перекисных композиций на микробные клетки и споры, исследование дезин
б фицирующих свойств препаратов в модельных условиях очагов особо опасных инфекций и на этапах медицинской эвакуации.
1.2. Цели и задачи исследования.
Целью настоящего исследования явилось изучение физико-химических свойств новых перекисных композиций перекись водорода-катамин (ПВК-2), Грилен, Де-зоксон-4, пероксогидраты фторида калия (ПФК-1 и ПФК-2) и их дезинфицирующее действие на возбудителей особо опасных инфекций.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Разработать методический подход для качественного и количественного цитологического анализа клеток, спор и их популяций после воздействия дезинфектан-тами при электронно-микроскопических исследованиях.
Изучить дезинфицирующее действие новых перекисных композиций ПВК-2, Грилен, Дезоксон-4, ПФК-1 и ПФК-2 на возбудителей особо опасных инфекций.
Провести морфологический анализ изменения тонких структур микробных клеток и бактериальных спор под воздействием перекисных дезинфектантов.
Предложить объяснение механизма действия перекисных дезинфектантов на бактерии и споры.
1.3. Научная новизна и практическое значение работы.
Исследуемые дезинфектанты имеют ряд преимуществ по сравнению с перекисью водорода. Препараты ПВК-2, Грилен и Дезоксон-4 в качестве активно действующего вещества содержат не только перекись водорода. При сочетании нескольких дезинфектантов наблюдается синергизм, что позволяет уменьшить концентрации активных веществ, снизить повреждающее действие дезинфектантов на материалы и оборудование, уменьшить их токсичность. Используемые в композициях ПВК-2 и Грилен четвертичные аммониевые соединения обладают помимо антимикробных и
моющими свойствами. Пероксогидраты фторида калия являются твердыми веществами, что облегчает их хранение и транспортировку.
В ходе выполнения проведенных нами исследований разработан метод качественного и количественного цитологического анализа клеток, спор и их популяций после воздействия дезинфектантами, позволяющего с большой степенью достоверности оценивать жизнеспособность микроорганизмов при электронно-микроскопических исследованиях. Клетки разделяют на 3 группы по признаку морфологической целостности:
-интактные или неповрежденные клетки;
-клетки, имеющие обратимые повреждения;
- клетки, имеющие необратимые повреждения, или разрушенные клетки.
На основании полученных данных можно определить состояние как отдельной клетки, так и соотношение интактных и поврежденных клеток в биомассе.
Исследованы физико-химические, антимикробные и коррозионные свойства новых перекисных дезинфектантов.
Установлены специфические изменения в тонкой структуре бактерий и спор на самых ранних стадиях их обработки дезинфектантами. Первичные специфические изменения под действием перекисных дезинфектантов на бактериальную клетку происходят в структуре цитоплазматической мембраны в виде плазмолиза, разрыва мембраны или фрагментации, в бактериальных спорах выявляются поры, дыры или разрывы в наружном слое или во всех слоях споровой оболочки.
Подробно исследована динамика вторичных альтераций и разрушения микробов в процессе обработки препаратами. Специфические повреждения в структуре цитоплазматической мембраны бактерий и споровых оболочек у спор сопровождаются
нарушениями барьерной, транспортной, дыхательной, репликационной и других функций бактерий и спор. Далее начинается деструкция цитоплазмы и нуклеоида бактерий, кортекса и сердцевины спор. Конечный этап - лизис и гибель клеток и спор.
Установлены концентрационно - временные параметры дезинфекции и динамика ультраструктурных повреждения микробов, спор и их популяций в процессе обработки новыми перекисными препаратами.
На основе этих данных предложена гипотеза механизма действия этой новой группы дезинфектантов на микроорганизмы, которая заключается в том, что в системах, содержащих перекись водорода и ионы металлов переменной валентности происходит образование гидроксильных радикалов, которые инициируют свободноради-кальное окисление жизненно-важных биополимеров, вызывающее быстрые, необратимые структурно-функциональные изменения в мембранном аппарате бактерий и спор, в результате которых наступает гибель клеток и их распад.
Расширены представления о механизмах действия новых перекисных дезинфектантов на бактерии и споры.
Получен обширный иллюстративный материал по воздействию перекисных дезинфектантов на различные ультраструктурные элементы клеток и спор, который может быть рекомендован для использования в учебных целях для студентов, врачей, биологов, работающих в области дезинфектологии.
1.4. Внедрение результатов работы.
Полученные результаты по изучению влияния новых перекисных дезинфектантов на ультраструктуру возбудителей особо опасных инфекций бактерий и спор в различных концентрационных и временных параметрах и условиях воздействия послужили основой для разработки Методических указаний по применению препаратов
9 грилен, дезоксон-4, ЦИАРЭФ, полисент (метацид), ПВК-2, усовершенствованный
(стабилизированный) гипохлорит натрия (УГН) и двуосновная соль гипохлорита кальция (ДСГК) для целей дезинфекции в микробиологической промышленности.
Метод качественного и количественного цитологического контроля качества клеток, спор и их популяций после воздействия дезинфектантами, разработанный диссертантом, используется с 1995 года в Государственном Научном Центре прикладной микробиологии при исследовании состояния микроорганизмов после различных стрессовых воздействий.
1.5. На защиту выносятся следующие положения.
Новые методические подходы качественного и количественного цитологического анализа клеток, спор и их популяций после стрессового воздействия, позволяющего с большой степенью достоверности оценивать жизнеспособность микроорганизмов при электронно-микроскопических исследованиях.
Сведения о специфических изменениях в ультраструктуре бактерий и спор под влиянием новых перекисных композиций ПВК-2, Грилен, Дезоксон-4, ПФК-1 и ПФК-2: первоначальное повреждение мембранного аппарата бактерий и спор, последующая деструкция цитоплазмы и нуклеоида бактерий и кортекса и сердцевины спор, лизис и гибель клеток и спор.
Подробная динамика изменения качества популяций бактерий и спор в процессе воздействия перекисными дезинфектантами.
1.6. Апробация материалов диссертации.
Основные результаты работы были представлены на 2-ой международной научной конференции по туляремии в Праге в 1997 году и на Российской конференции
10 "Биоповреждения в промышленности" в Пензе в 1994 году.
1.7. Публикации
По теме диссертации опубликовано пять научных работ.
Герасимов В.Н., Голов Е.А., Бабич И.В. Исследование в электронном микроскопе действия перекисных биоцидов на тонкую структуру бактерий. //Тезисы докладов конференции "Биоповреждения в промышленности", Пенза. - 1994. - 25-26 октября. - часть 2. - с. 42-44.
Gerasimov V., Golov Е., Lushchikov S., Babich I. Bactericidal and Desinfcctional Properties of New Preparations in Regard to Francisella tularensis. //Thesis of Second International Conference on Tularemia. Czech Republic, Praga- 1997.- p. 26 .
Герасимов B.H., Голов E.A., Бабич И.В. и др. Особенности механизма действия перекисного дезинфектанта ПВК-2 на микробные клетки и споры. //Дезинфекционное дело. - 1998.- №1.- с. 12-19.
Герасимов В.Н., Голов Е.А., Бабич И.В. и др. Физикохимические и антимикробные свойства перекисных композиций Грилен и Дезоксон-4. //Дезинфекционное дело.-1998.-№2.-с. 10-18.
Герасимов В.Н., Голов Е.А., Бабич И.В. и др. Антимикробные свойства нового класса перекисных дезинфектантов - пероксогидратов. //Дезинфекционное дело. -1999.-№1.-с. 14-18.
Диссертация написана на 162 машинописных страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, методы исследования, описание полученных результатов исследования, заключение, выводы, список использованной литературы.
2. Обзор литературы
Современные представления о строении прокариотической клетки и химической композиции основных структурных элементов клетки
Бактерии относятся к организмам с прокариотическим типом организации клетки, что определяется особенностями ультраструктуры этих организмов, а также строением и функцией ряда макромолекул.
К прокариотам принадлежат два царства живых организмов: собственно бактерии или царство эубактерий и царство архебактерий.
В соответствии с современными представлениями об эволюции бактерий эубактерий и архебактерий произошли от общего предка, однако обособление этих линий эволюции произошло очень давно [107; 185; 208; 241].
Первоначально основным маркером при дифференциации бактерий являлась окраска по Граму, согласно которой и появились названия грамположительные и гра-мотрицательные бактерии. Позднее выяснилось, что различия в окраске связаны с существенными различиями в строении клеточной стенки двух типов бактерий. Для ультраструктуры клеточной стенки грамположительных бактерий характерно наличие одного толстого и более или менее гомогенного слоя (многослойного пепти-догликана муреина), в то время как в клеточной стенке грамотрицательных бактерий присутствует несколько слоев различной природы, лишь один из которых является монослойным пептидогликаном. Существуют также значительные различия в химическом составе клеточных стенок двух типов бактерий [231].
Однако тип строения клеточной стенки не всегда может выявляться с помощью окраски по Граму, а только более специфическими способами, в том числе, с помощью исследования ультраструктуры и химического состава клеточной стенки. Гра-мотрицательный тип окраски и характерную для грамположительного типа строения ультраструктуру и химический состав клеточной стенки имеют бактерии родов Mobilincus [195], Filibacter [148], Desulfotomaculum [73], Heliobacterium [212], Acetogenium, Butirivibrio, Lachnospira [107].
Бактерии родов Sporomusa, Selenomonas, Megasphaera, Pectinatus, Zymophilus, Acetonema, Roseburia [107], Syntrophomonas [203], по строению клеточной стенки относящиеся к грамотрицательным бактериям, согласно анализу 16S рРНК принадлежат к филетической линии грамположительных бактерий. В эту же группу включают и род Termobacteroides, характеризующийся грамотрицательным типом окраски и атипичным строением клеточной стенки [107].
В 1978 г. Гиббоне и Муррей [168] предложили грам отрицательные эубактерии выделить в отдел Грациликутных (Gracilicutes), а грамположительные - в отдел Фир-макутных (Firmacutes).
Всякая живая клетка состоит из цитоплазмы и ядерного материала, отграниченных плазматической мембраной (протопласт). У большинства прокариотов мембрана окружена клеточной стенкой. Осмотическим барьером служит плазматическая мембрана: она полупроницаема и контролирует проникновение в клетку и выход из нее растворенных веществ. В отличие от плазматической мембраны клеточная стенка проницаема для солей и других низкомолекулярных соединений.
Основу стенки бактериальной клетки составляет пептидогликан муреин. Это гетерополимер, в котором чередуются производные глюкозы - N-ацетилглюкозамин и N-ацетилмурамовая кислота (N-ацетилглюкозаминлактат), соединенные между собой Р-1,4-гликозидными связями. Остатки мурамовой кислоты через лактильные группы соединены пептидной связью с аминокислотами. Пептид, входящий в состав муреина, включает 3-6 различных аминокислот. Аминокислоты с разветвленной цепью, ароматические и серосодержащие, а также гистидин, аргинин и пролин никогда не встречаются в составе муреина.
Основу пептидной части муреина составляют тетрапептиды, образованные чередующимися L- и D-аминокислотами. В состав тетрапептида часто входит также необычная аминокислота - диаминопимелиновая (ДАП), находящаяся в мезоформе. В составе пептида ДАП обычно связана своим L-асимметричным центром.
С карбоксильной группой мурамовой кислоты соединена аминогруппа крайней аминокислоты пептида. Обычно это L-аланин, но иногда - глицин или L-серин. За L-аланином следует D-глутаминовая кислота, которая связана у-карбоксильной группой (иногда а-карбоксильной группой) с диаминокислотой, находящейся в 3-м положении. Вторая карбоксильная группа может быть амидирована или к ней могут быть присоединены дополнительные аминокислоты.
У всех грамотрицательных и многих грамположительных бактерий в 3-м положении находится мезо-диаминопимелиновая кислота, свободная карбоксильная группа которой иногда амидирована. У некоторых бактерий вместо мезо-ДАП обнаруживается Ь,Ь-ДАП или L-лизин, реже L- или D-орнитин, мезо-2,6-диамино-3-гидрокси-Р-пимелиновая или 2,4-диаминомасляная кислоты, гидроксилизин или гомосерин. Четвертой аминокислотой тетрапептида является D-аланин, карбоксильная группа которого свободна или участвует в образовании межпептидной связи. Некоторые пептидные цепочки содержат два терминальных D-аланина, другие - только три аминокислоты или менее. Диаминокислоты образуют пептидные связи с участием обеих аминогрупп и, таким образом, могут связать две гетерополимерные цепи между собой [216; 232]. Пептидными мостиками гетерополимерные цепи связаны между собой в трехмерную оболочку - муреиновый мешок. Длина молекул гликана оболочек, например у Bacillus subtilis, варьирует от 30 до 590 дисахаридных звеньев [235]. Наличие в клеточных стенках пептидогликанового слоя - характерная особенность прокариот. Исключение составляют только архебактерии и немногие другие группы и виды [107].
Аминокислотный состав и строение пептидной части муреина грамотрицательных бактерий стабильны. У грамположительных, напротив, аминокислоты, входящие в состав тетрапептида, могут различаться, так же, как строение и состав аминокислотных мостиков, соединяющих соседние тетрапептиды. В соответствии со схемой, предложенной в 1972 г. Шлайфером и Кандлером [231], различные хемотипы муреина подразделяются на группы А и В в зависимости от положения сшивки пептидов - у третьего или второго аминокислотного остатка тетрапептида и на подгруппы - в зависимости от аминокислотного состава пептидов и соединяющих их мостиков.
Модификации муреина иногда вызываются изменением аминокислотного состава среды, наличием ингибирующих количеств пенициллина, аминокислот, способами очистки муреина [230]. У Microb. lacticum глутаминовая кислота пептидной субъединицы заменяется трео-3-оксиглутаминовой кислотой в условиях избыточного снабжения организма кислородом [231].
В редких случаях тип пептидогликана определяется стадией жизненного цикла микроорганизма. В пептидогликане сферических клеток A. crystallopoietes поперечный мостик образован L-Ala, а палочковидных - L-Ala-Gly-Gly [190]. Доказано, что содержание пептидогликана в стенках N. asteroides значительно увеличивается с возрастом клеток [133].
Химические основы взаимодействия перекиси водорода с микроорганизмами
Для инактивации бактериальной клетки дезинфектант должен поразить жизненно важный органоид микроорганизма. При его определении необходимо учитывать следующие факторы: важность мишени с точки зрения обеспечения жизнедеятельности клетки; доступность мишени для химического дезинфектанта; наличие химически активных групп в мишени, способных взаимодействовать с молекулами де зинфектанта с образованием химических соединений, не способных выполнять биологические функции исходной мишени; минимальная концентрация активных групп мишени, взаимодействие которых с дезинфектантом привело бы к максимальной степени необратимой инактивации клетки.
Учитывая информацию о структуре грамположительных и грамотрицательных бактериальных клеток такими органоидами бактериальных клеток считают: нуклеоид, рибосомы (в комплексе с другими РНК) и цитоплазматическую мембрану, каждый из которых незаменим с точки зрения жизнедеятельности клетки и при поражении которых происходит инактивация клетки. Однако их доступность для дезинфектантов различна.
Нуклеоид - молекула ДНК содержит высокореакционные группы (фосфатные, кетогруппы, эндоциклические атомы азота), потенциально способные взаимодействовать с дезинфектантами, однако мало доступен для молекул и ионов дезинфектанта. Это связано как с наличием первичной гидратной оболочки на поверхности ДНК, непроницаемой для катионов [32], так и трудностью транспорта дезинфектанта из водного раствора в нуклеоид через внешнюю и цитоплазматическую мембраны бактериальной клетки и возникающими при этом непроизводительными потерями дезинфектанта. Наибольшая уязвимость ДНК по отношению к химическим дезинфектантам может проявляться в период протекания процессов репликации и транскрипции [70].
Рибосомы - содержащиеся в них рРНК, как и остальные РНК (тРНК и мРНК, находящиеся в цитоплазме клетки), схожи по своим химическим свойствам с ДНК. Однако их концентрация по сравнению с ДНК в бактериальной клетке больше, (105 только рРНК [26]), для их инактивации требуется значительное количество дезинфектанта, транспорт которого в цитоплазму бактериальной клетки затруднен. Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) - обеспечивает жизненно важные функции клетки - активный транспорт, перенос электронов и окислительное фосфорили-рование, барьерная функция, биосинтез материала клеточной стенки, фосфолипидов, прикрепление ДНК, и ее репликация. ЦПМ состоит из белков (от 41 до 75 % от всех компонентов мембраны), липидов (от 18 до 35 %), РНК (от 0,5 до 21,3 %) и углеводов (от 0 до 2,3 %) [70]. Наиболее функционально активными группами обладают молекулы РНК и белков. Для последних наиболее реакционноспособны сульфгидрильные группы, входящие в состав цистеина, и реакционноспособные практически в отношении всех окислителей, алкилирующих и многих ацилирующих агентов, катионов тяжелых металлов [70]. Хотя общее содержание цистеина в белках ЦПМ крайне незначительно - менее 1% [70], он входит в состав практически всех белков ЦПМ, образуя при окислении сульфгидрильных групп дисульфидные связи между аминокислотами и таким образом формируя вторичную и третичную структуру белков. Кроме того, сульфгидрильная группа является важнейшей составной частью кофермента А, выполняющего функцию переносчика ацильных групп в жизненно важном цикле три-карбоновых кислот (конечное окисление питательных веществ, синтез и обеспечение клетки основными структурными единицами) и участвующего в окислении пирувата, входит в состав цистеина железосерных белков, выполняющих функции переносчика электронов дыхательной цепи и фосфорилирования. Общее содержание сульфгидрильных групп в ЦПМ оценивается в 10"14 мг/клетка или менее 10"12 ммоль/клетка [70], что требует для инактивации небольших количеств дезинфектанта. Хотя транспорт молекул дезинфектанта в область ЦПМ намного проще, чем в нуклеоид или рибосомы, так как не требует преодоления самой ЦПМ, тем не менее возможно значительное снижение концентрации дезинфектанта на пути к ЦПМ вследствие взаимо действия с сульфгидрильными группами белков наружной мембраны бактерий, значительно обогащенных цистеином. Кроме того, химическая природа сульфгидриль-ной группы, с одной стороны, обеспечивая легкость ее окисления и превращения в дисульфидную, а с другой - легкость восстановления дисульфидной группы и превращения ее в сульфгидрильную, требует для инактивации этой группы (т.е. сдвига равновесия в сторону образования дисульфидной группы) присутствия избытка окисляющего дезинфектанта [70].
Исходя из этого предполагают, что наиболее уязвимой мишенью с точки зрения как жизненной важности, так и доступности для транспорта дезинфектанта, наличия активных групп и минимальной концентрации необходимого для инактивации мишени дезинфектанта является цитоплазматическая мембрана [54; 70].
Большое значение для эффективного действия химических дезинфектантов имеет возможность их транспорта через клеточные структуры к мишени в клетке.
У грамотрицательных и грамположительных бактерий оболочки имеют различное строение, причем основное отличие заключается в наличии в оболочке грамотрицательных бактерий дополнительного наружного слоя, состоящего из фосфо-липидов, липопротеинов и белков.
Экспериментально установлено, что грамотрицательные и грамположительные бактерии обладают различной чувствительностью к неблагоприятным факторам внешней среды [155]. Грам-положительные бактерии и штаммы грам-отрицательных бактерий, имеющих дефекты липополисахаридного слоя обладают повышенной проницаемостью для экзогенных веществ. Липополисахаридная оболочка клеточной стенки (ЛПС) грамотрицательных бактерий обладает, таким образом, защитным эффектом против токсичного действия экзогенных агентов [228].
Электронно-микроскопическое изучение тонкой структуры бактерий и спор последействия перекиси водорода
Перекись водорода в целях дезинфекции используется с начала 20-го столетия. До настоящего времени накопилось огромное количество работ по действию ее на микробные клетки. Однако следует отметить, что в доступных нам работах нет информации о детальных электронно-микроскопических исследованиях действия перекиси водорода на ультраструктуру микробов. Поэтому, прежде чем исследовать взаимодействие новых дезинфектантов с микроорганизмами, представляло особый интерес изучить механизм действия перекиси водорода на микробные клетки.
Перекись водорода - бесцветная, прозрачная жидкость со специфическим запахом, сильный окислитель. В чистом виде - вязкая жидкость (d=l,45), с водой смешивается в любых соотношениях. Обладает выраженными бактерицидными, спороцид-ными, фунгицидными свойствами. Выпускается в виде 30-90% растворов с добавлением стабилизатора для предохранения от разложения. Хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре, закрытой пробками с отверстиями для выхода газа при температуру не выше 30С. Раствор перекиси водорода относится к 3 классу опасности по ГОСТ 12.1.007-76 (умеренно опасные вещества) Рабочие растворы неустойчивы, готовятся непосредственно перед применением.
Действие перекиси водорода на бактерии Escherichia coli, штамм К-12.
Для изучения воздействия перекиси водорода на тонкую структуру бактерий Е. coli использовали 18-часовую культуру, выращенную на МПБ при 37С. К суспензии в концентрации 2x108 кл/мл добавляли перекись водорода до концентрации 1,5% и инкубировали в течении 15-60 мин при комнатной температуре. После воздействия дезинфектанта на микроорганизмы перекись водорода неитрализовывали введением в суспензию гипосульфита в концентрации 1%. Часть биомассы высевали на плотную питательную среду для определения количества живых клеток в суспензии, а часть суспензии использовали в электронно-микроскопических исследованиях.
При исследовании в электронном микроскопе клеток Е. coli до воздействия препарата было обнаружено, что микробная популяция содержит примерно 93% клеток с интактной ультраструктурой, остальные микробы находятся на различных стадиях естественного старения, повреждения, гибели (Рис. 4.2.1а).
При кратковременном воздействии на клетки Е. coli 1,5% перекиси водорода в течении 15 мин около 80% микробной популяции получает различные обратимые и необратимые повреждения (Рис. 4.2.16). Около 10% клеток имеет интактную ультраструктуру. Примерно 5% клеток плазмолизированы, то есть наблюдается локальное или полное отслоение клеточной оболочки от цитоплазматической мембраны (ЦПМ). У 10-15% микробов наблюдаются разрывы или полное разрушение ЦПМ. По-видимому, первоначальное действие перекись водорода оказывает на ЦПМ, которое проявляется в расширении периплазматического пространства и/или разрушении ЦПМ. Затем в микробах начинаются вторичные структурные повреждения вследствие нарушения функций ЦПМ. Эти изменения проявляются в виде частичной или полной деструкции цитоплазмы и/или нуклеоида, которые на уровне ультраструктуры проявляются в виде фрагментации хроматина, разрушении и растворении рибосом и полисом, появлении в цитоплазме и на месте нуклеоида электронно-прозрачных зон (См. рис. 4.2.16).
. Действие 1,5%-ного раствора перекиси водорода на ультраструктуры клеток Е. coli; а - клетки до воздействия препаратом, увеличение х20000; б - клетки Е. coli после 15 мин экспозиции, увеличение х20000; в - клетки, обработанные де-зинфектантом в течение 60 мин, увеличение xSOOOO. Следует отметить, что полученные нами данные по степени повреждения ультраструктуры микроорганизмов после воздействия перекиси водорода полностью совпадают с данными микробиологического контроля живых микроорганизмов в образцах.
При более длительной обработке микробной популяции перекисью водорода (30-60 мин) все микробы популяции имеют обратимые или необратимые повреждения. Значительная часть клеток микроорганизмов автолизирована или полностью разрушена (Рис. 4.2.1 в).
Таким образом, при обработке микробных клеток Е. coli 1,5% перекисью водорода уже на самых ранних стадиях воздействия (до 15 мин) большая часть популяции (около 80%) повреждается или разрушается. Первичные повреждения, вызываемые дезинфектантом, которые выявляются при электронно-микроскопическом исследовании, происходят на уровне мембранного аппарата клетки.
Для грамотрицательных бактерий первое соприкосновение клетки с молекулами дезинфектанта происходит на поверхности ее наружной мембраны. Химически наиболее реакционноспособны при взаимодействии с перекисью водорода белки, особенно их сульфгидрильные группы, и нуклеиновые кислоты (отсутствующие во внешней мембране). Однако повреждение наружной мембраны не является летальным для бактериальной клетки. Непрореагировавшие молекулы дезинфектанта проникают сквозь гидрофильные поры внешней мембраны в периплазматическое пространство, где могут реагировать с пептидной частью муреинового каркаса и находящимися там же некоторыми ферментами. Повреждения этих компонентов так же не приводят к летальному исходу. Пройдя через периплазматическое пространство пере кись водорода достигает цитоплазматической мембраны, повреждение которой может оказаться гибельным для клетки. Белки составляют значительную часть ЦПМ и выполняют различные транспортные и ферментативные функции. С ЦПМ связана так же система репликации клетки. Окисление транспортных белков приводит к нарушению барьерных функций ЦПМ и утечке ее компонентов в периплазматическое пространство, что подтверждается биохимическими исследованиями [87; 109; 255], а так же делает возможным попадание перекиси водорода внутрь клетки. Взаимодействие перекиси водорода с ферментами приводит к их инактивации. Дальнейшее взаимодействие дезинфектанта с компонентами мембран, в частности, окисление ненасыщенных жирнокислотных компонентов липидов по двойным связям, вызывает ее деструкцию. Для прошедших сквозь ЦПМ молекул перекиси водорода становятся доступны цитоплазматические белки и нуклеиновые кислоты, РНК и ДНК. Взаимодействие с ними приводит к полной гибели клетки и видимым изменениям в ультраструктуре цитоплазмы и нуклеоида.
Антимикробные свойства нового класса перекисных дезинфектантов -пероксогидратов
Пероксогидрат фторида калия - белый кристаллический порошок, малогигроскопичный, хорошо растворимый в воде, при этом полностью диссоциирует на ионы
К , F и молекулы Н202. В зависимости от пропорции исходных компонентов KF и Н202 получают пероксогидраты фторида калия с различным содержанием перекиси водорода:
для KF H202 - 36,9% для KF 2H202 - 53,9% для KF 3H202 - 63,7%.
При отсутствии влаги пероксогидраты фторида калия стабильны в течение 2 лет. Пероксогидраты фторида калия наиболее перспективны в виде двух сольватов, содержащих различное количество перекиси водорода (ПФК-1 - 28-35% и ПФК-2 -40-45%).
Рабочие растворы ПФК (2,5-10% по перекиси водорода) стабильны в течение 2 недель. Препарат относится к умеренно токсичным веществам 3 класса опасности по ГОСТ 12.1.007-76 при введении в желудок, при нанесении на кожу - к 4 классу малоопасных веществ. Обладает местно-раздражающим и кожно-резорбтивным действием при повторном воздействии. При попадании рабочего раствора в глаза вызывает конъюктивит. Сенсибилизирующий эффект не выявлен. Ингаляционное воздействие методом орошения приводит к раздражению верхних дыхательных путей.
Результаты экспериментального изучения воздействия пероксогидратов на вегетативные и споровые формы бактерий [35] показали, что препараты ПФК-1 и ПФК-2 обладают высокой бактерицидной и спороцидной активностью. Препараты весьма
ш
активны при деконтаминации тест-поверхностей, обсемененных взвесями F. tularensis, В. anthracis, В. thuringiensis и В. anthracoides. Физико-химические свойства рабочих растворов пероксогидратов, низкая коррозионная активность препаратов, высокая бактерицидная и спороцидная препаратов позволяют использовать эту новую группу дезинфектантов в микробиологической промышленности вместо перекиси водорода.
Методами ультраструктурного анализа исследовали также характер действия сублетальных доз пероксогидратов на ультраструктуру бактериальных спор.
Электронно-микроскопический анализ спор В. anthracis до воздействия на них препаратом (в контроле) показал, что большая часть споровых клеток в биомассе (83,8% от общего пула) имеют интактную ультраструктуру, остальные споры повреждены {Рис. 4.5.1, 4.5.2а)
Электронные микрофотографии ультратонких срезов спор В. anthracis, обработанных препаратом ПФК-1; а - интактные споры, увеличение х 17000; б - споры, обработанные 10%-ным раствором дезинфектанта в течение 2 мин., увеличение х24000, стрелкой отмечено повреждение экзоспориума; в - споры после обработки препаратом в течение 7 мин, увеличение х40000, стрелка - повреждение споровых оболочек; г - повреждения спор, вызванные 15-ти минутной обработкой дезин-фектантом, увеличение х24000.
При кратковременной обработке В. anthracis 10%-ным раствором препарата ПФК-1 (2 мин) наблюдали снижение количества интактных спор в биомассе по сравнению с контролем примерно на 80%. В популяции обнаружили около 70% спор с разрыхленной споровой оболочкой или с многочисленными разрывами в ее мембранах (Рис. 4.5.1, 4.5.26). Эти повреждения возникают в результате прямого дестабилизирующего действия препарата на структуру мембран споровых оболочек. В популяции появляются также споры с разрывом споровых оболочек, кортекса и сердцевины или споровые клетки с глубокими деструктивными изменениями в сердцевине, кортексе (9%). Примерно столько же спор находится в состоянии автолиза.
С увеличением экспозиции действия препарата на В. anthracis (7 мин) число интактных спор снижается до 2,3% от общего пула. Остальные споры имеют первичные структурные нарушения, такие, как разрыхление и разрыв споровых оболочек (22,7% от общего пула), или находятся на разных стадиях деструкции и автолиза (Рис. 4.5.1, 4.5.2B).
Более длительное воздействие препаратом на В. anthracis (15 мин) приводит к инактивации и повреждению всех спор с интактной ультраструктурой в биомассе (Рис. 4.5.1, 4.5.2г). В микробной популяции обнаруживается не более 17% спор с первичными нарушениями споровых оболочек, остальные споровые клетки находятся на стадиях деструкции и автолиза.
Таким образом, при воздействии препаратом ПФК-1 на В. anthracis, наиболее чувствительными структурными элементами спор к дезинфектанту являются споровые оболочки. Контакт препарата с ними приводит к дестабилизации структуры мембран, а затем к нарушению их целостности. Контакт молекул препарата со структурами кортекса и сердцевины вызывает их деструкцию и лизис.
В биомассе В. thuringiensis до обработки препаратом содержится около 70% спор с интактной ультраструктурой, остальные микробы повреждены или автолизи-рованы. Интактные споры по своей ультраструктуре не отличаются от споровых клеток В. anthracis (Рис. 4.5.3,4.5.4а).
При воздействии 10%-ным раствором дезинфектанта на В. thuringiensis в течение 2 минут наблюдали снижение числа интактных спор в биомассе примерно на 40-50% от их исходного содержания. Примерно 15-16% спор популяции имела повреждения структуры споровой оболочки и кортекса. Остальная часть спор биомассы после нарушения целостности споровых оболочек приобрела глубокие дегенеративные изменения в кортексе и сердцевине (Рис. 4.5.3, 4.5.46).
Воздействие дезинфектантом на В. thuringiensis в течение 7 и 15 мин приводит к резкому снижению числа спор с интактной ультраструктурой в популяции или к их полной инактивации и повреждению споровых клеток (Рис. 4.5.3, 4.5.4в,г).
