Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Полисахариды: классификация, общая характеристика, применение 9
1.1.1. Полисахариды растений 9
1.1.2. Полисахариды животных 26
1.1.3. Экзополисахариды микроорганизмов 28
1.2. Функции экзополисахаридов микроорганизмов 46
2. Экспериментальная часть 49
2.1. Объект, материалы и методы исследований 49
2.1.1. Объект исследований 49
2.1.2. Среды и условия культивирования 52
2.1.3. Получение вариантов Xanthomonas campestris В - 610 по продукции экзополисахаридов 53
2.1.4. Общие микробиологические методы 53
2.1.5. Выделение и очистка экзополисахаридов 54
2.1.6. Методы определения физико-химических свойств экзополисахаридов 54
2.1.7. Определение биологических свойств экзополисахаридов... 55
2.1.8. Методы определения качества продуктов питания 56
2.1.9. Методы создания пленочных покрытий и нанесение их на поверхность продуктов питания 56
2.1.10. Методы статистической обработки результатов 56
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 57
2.2.1. Выбор штамма и оптимальных условий культивирования X. campestris для продуцирования экзополисахаридов 57
2.2.2. Подбор оптимальных условий для выращивания Klebsiella pneumoniae К - 2 для продуцирования экзополисахаридов.. 67
2.2.3. Физико-химические свойства и моносахаридный состав экзополисахаридов ксантомонад и клебсиелл 72
2.2.4. Изучение биологических свойств экзополисахаридов X. campestris В — 610/1, В — 610/4 и pneumoniae К -2 79
2.2.5. Изучение влияния бактериальных экзополисахаридов на качество хлебобулочных изделий и создание пищевых пленочных покрытий на их основе 99
Заключение 117
Выводы 122
Список использованных литературных источников 123
- Экзополисахариды микроорганизмов
- Методы определения физико-химических свойств экзополисахаридов
- Выбор штамма и оптимальных условий культивирования X. campestris для продуцирования экзополисахаридов
- Изучение биологических свойств экзополисахаридов X. campestris В — 610/1, В — 610/4 и pneumoniae К -2
Введение к работе
Актуальность темы
Полисахариды являются важнейшими компонентами клеток микроорганизмов. Многие физиологические, биохимические и иммунохимические особенности полисахаридов определяются их распределением в клетке: наружная и цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, выделение в виде внеклеточных слизей в окружающую среду (экзополисахариды) (Захарова, 1982; Мальцева, 1981; Sutherland, 1979; Гринберг, 1992). Экзополисахариды (ЭПС) выполняют ряд важных биологических функций: защитную, резервную и др. В настоящее время экзополисахариды широко применяются во многих отраслях промышленности, благодаря своим уникальным свойствам – загущения, студнеобразования, эмульгирования, влагоудержания и стабилизации. В нашей стране в основном применяются полисахариды растительного происхождения – крахмал, пектин, агар. Индустриальные потребности в биополимерах данного класса все более возрастают. Полисахариды, полученные из микроорганизмов, обладают рядом преимуществ (климатическая независимость, простота и экономичность производства, регулирование свойств) и занимают все более лидирующие позиции. Поэтому во многих развитых странах производству полисахаридов микробного происхождения, а среди них и бактериальным, уделяют большое внимание. При получении ЭПС используют разные способы, как традиционные, так и принципиально новые. Сфера применения полисахаридов определяется с учетом их свойств, как функциональных – способность растворяться в воде, создавать высоковязкие растворы, студни, гели, так и биологических. В настоящее время получение и применение бактериальных полисахаридов очень развито за рубежом, выпускаются такие полисахариды как ксантан, геллан, курдлан и другие.
В нашей стране разные отрасли индустрии нуждаются в полисахаридах и их в большом количестве закупают в таких странах, как Великобритания, США, Франция и Китай. В силу этого изучение экзополисахаридов бактериального происхождения и разработка их получения имеет важное научное и практическое значение.
Цель работы – выделение ЭПС Xanthomonas campestris и Кlebsiella pneumoniaе, изучение их физико-химических и биологических свойств.
Задачи исследования:
1. Подобрать оптимальные условия культивирования (состав питательной сре-
ды, температура, время культивирования) для повышения продукции ЭПС X. cam-
pestris В – 610, X. campestris В – 611 и К. pneumoniae K – 2 в лабораторных условиях.
2. Получить варианты X. campestris В – 610 с повышенной продукцией экзополисахаридов.
3. Выделить и очистить экзополисахариды X. campestris В – 610/1, В – 610/4,
В – 610/11, В – 610/16, В – 610/23 и К. pneumoniae K – 2 из культуральной жидкости.
4. Определить молекулярную массу, моносахаридный состав и вязкость раст-воров полученных экзополисахаридов X. campestris В – 610/1, В – 610/4, В– 610/11,
В – 610/16, В – 610/23 и К. pneumoniae K – 2.
5. Исследовать острую токсичность ЭПС ксантомонад и клебсиелл методом биопроб на инфузориях и лабораторных животных (мыши, крысы, кролики).
6. Изучить влияние ЭПС ксантомонад на качество хлебобулочных изделий и возможность создания пищевых пленочных покрытий на их основе.
Научная новизна
Впервые получены варианты X. campestris В – 610: X. campestris В – 610/1,
В – 610/4, В – 610/11, В – 610/16, В – 610/23, продуцирующие в 3 – 3,5 раза больше экзополисахаридов, чем исходный штамм, изучены их молекулярная масса, моносахаридный состав и вязкость растворов.
Подобраны оптимальные условия культивирования X. campestris В – 610 и его вариантов, X. campestris В – 611 и К. pneumoniae K – 2 для продуцирования ими максимального количества экзополисахаридов (время культивирования 44 – 50 ч, температура 27 С, встряхивание на шуттель-аппарате при 200 об/мин, в качестве источника углерода – сахароза).
На биотест – объектах (инфузории, лабораторные животные) показано отсутствие токсичности ЭПС X. campestris В – 610/1, В – 610/4 и слабая токсичность ЭПС К. pneumoniae K – 2 в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках
0,06 – 3 г/кг живой массы для лабораторных животных.
Установлено, что добавление ЭПС X. campestris В – 610/1 в хлебобулочные изделия способствует улучшению их качества. Впервые показана возможность применения данного биополимера в качестве основы для пищевых пленочных покрытий.
Практическая значимость работы
Способность нетоксичных ЭПС ксантомонад улучшать органолептические и физико-химические показатели хлебобулочных изделий и создавать пищевые пленочные покрытия открывает перспективы их дальнейшего изучения для использования в пищевой промышленности.
По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации по выделению и очистке экзополисахаридов бактериального происхождения» (в соавторстве с Е.В. Полукаровым, Е.Н. Бухаровой, Д.А. Жемеричкиным,
Л.В. Карпуниной) для студентов старших курсов, аспирантов, специалистов микробиологических, биотехнологических лабораторий, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобреные Ученым советом факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 58 от 23 июня 2009 г). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, проведении лабораторно-практических занятий и написании курсовых и дипломных работ в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Полученные варианты X. campestris В – 610: X. campestris В – 610/1,
В – 610/4, В – 610/11, В – 610/16, В – 610/23 с повышенной продукцией ЭПС и ЭПС К. pneumoniae K – 2 имеют молекулярные массы в пределах 1106 – 10106 Да, вязкость растворов в пределах 160 – 490 мПас и 150 мПас соответственно. ЭПС ксантомонад содержат в составе глюкозу, маннозу, галактуроновую кислоту, а ЭПС клебсиелл –маннозу, глюкозу, галактозу, глюкуроновую и галактуроновую кислоты, следы фукозы, арабинозы.
2. Оптимальными условиями культивирования ксантомонад и клебсиелл для бльшей продукции ЭПС являются: время культивирования 44 – 50 ч, температура 27 С, встряхивание на шуттель-аппарате при 200 об/мин, среда с сахарозой.
3. ЭПС X. campestris В – 610/1, В – 610/4 не являются токсичными в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках 0,06 – 3 г/кг живой массы для лабораторных животных, а ЭПС К. pneumoniae K – 2 – слаботоксичен в тех же концентрациях.
4. Введение ЭПС X. campestris В – 610/1 в хлебобулочные изделия улучшают органолептические и физико-химические показатели выпеченных изделий. ЭПС
X. campestris В – 610/1 могут являться основой для пищевых пленочных покрытий.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».
Апробация работы:
Материалы диссертации были представлены на: международной научной конференции «Пути повышения качества услуг общественного питания» (Саратов, Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова, 2005); научно-практических конференциях профессорско-реподавательского состава и аспирантов Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова (Саратов, 2005; 2006; 2007); международных научно-практических конференциях «Вавиловские чтения – 2005, 2006, 2007» (Саратов, 2005; 2006; 2007); 10-й международной Пущинской школе – конференции молодых ученых (Пущино, 2006); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных» (Саратов, 2007); 4 Московском международном конгрессе «Биотехнология: перспективы, состояние, развитие» (Москва, 2007); X международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2008); международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); 5 Московском международном конгрессе «Биотехнология: перспективы, состояние, развитие» (Москва, 2009); конкурсе научных проектов молодых ученых Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова “Инновационная наука – молодой взгляд в будущее” (Саратов, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Экзополисахариды микроорганизмов
В настоящее время существуют различные продукты модификации целлюлозы, одна из которых - карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) или натриевая соль КМЦ, используемая как стабилизатор консистенции в пищевой промышленности [148, 181, 206, 262]. Чистый препарат представляет собой белые или кремовые волокнистые гранулы или порошок, которые гигроскопичны, не имеют запаха, устойчивы, растворимы в воде и нерастворимы в кислоте и органических растворителях [135, 247]. Благодаря таким своим характеристикам, как легкая растворимость в воде, устойчивые стабилизирующие и связывающие свойства [77, 164, 203, 232], карбоксиметилцеллюлоза применяется в основном при производстве мороженого, кондитерских изделий (желе, мусс, мармелад, джемы, фруктово-ягодные начинки, крем), пасты, выпечки, макаронных изделиях, соусах и мясных продуктах [42, 50]. Кроме того, так как КМЦ физиологически безвредна, то она входит в состав средств фармацевтической промышленности для капсулирова- ния и таблетирования [148]. В нашей стране производятся различные препараты с использованием КМЦ: «Бланоза», «Стабилан СМ», «Аквасорб А - 500» [16,77].
Одной из известных и эффективных добавок к пище служит микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) — неволокнистая порошкообразная модификация природной целлюлозы, ее отличает легкая текучесть, высокая гигроскопичность [16, 51, 80, 164, 262]. Вследствие этого она не только снижает калорийность пищи, но и является ее загустителем и диспергатором, улучшающим товарный вид и качество блюд. Введение МКЦ в продукты питания способствует более длительному сохранению пищи [62]. Основными поставщиками этого препарата являются фирмы США и Японии [16, 49, 77].
Целлюлоза и целлюлозосодержащие продукты используются во многих отраслях промышленности: бумажной, текстильной, химической, строительстве, медицине и т.д. Например, карбоксиметилцеллюлоза, ДЭАЭ- целлюлоза и сефадексы — нерастворимые сшитые декстраны — используются в технике разделения различных полимерных веществ. Также в настоящее время на основе целлюлозы разрабатываются пленочные и упаковочные материалы, обладающие фунгистатическими свойствами, которые рекомендованы в качестве антибактериального перевязочного материала, гигиенических и противоожоговых салфеток [22, 202, 208, 234]. Кроме того, применяется комплексный подход к созданию полифункциональных съедобных покрытий на основе природных полимеров (простых эфиров целлюлозы) [100, 105].
Пектиновые вещества представляют собой группу высокомолекулярных полисахаридов, входящих в состав клеточных стенок и межклеточных образований, содержащихся как в наземных, так и в водных растениях [51, 232]. В понятие «пектиновые вещества» входят протопектин (нерастворимый в холодной воде пектин), гидратопектин (растворимый), пектиновые кислоты и пектинаты, пектовые кислоты и пектанаты. В растительной клетке пектин выполняет функцию структурирующего агента в центральном слое клеточной стенки, а также, из-за своих способностей к набуханию и образованию коллоидов, регулирует водный обмен растений. Количество пектина различно в разных растениях и зависит от многих факторов, в том числе климатических. Основную массу пектиновых веществ в растениях составляет протопектин (до 75 %) [109, 135, 242]. Молекула протопектина - гетерополимер со сложной разветвленной структурой. Главная цепь протопектина — рамно- галактуронан, который состоит из остатков молекул галактуроновой и поли- галактуроновой кислот, частично этерифицированных метиловым спиртом и рамнозой. Рамногалактуронан состоит из а - 1,4 — связанного галактуронана, соединенного — 1,2 — связью с рамнозой. Таким образом, цепочки рамнога- лактуронана, содержащие 20 и более остатков галактуроновой кислоты, образуют молекулы пектина.
Молекула рамногалактуронана содержит два вида функциональных групп: гидроксильные и карбоксильные. Карбоксильные группы обычно могут быть этерифицированы метанолом и частично связаны с катионами металлов. Часть карбоксильных групп остается свободной, этим обуславливая их кислотные свойства. Вследствие этого степенью этерификации пектиновых веществ называют отношение количества этерифицированных карбоксильных групп к общему количеству карбоксильных групп. В зависимости от степени этерификации пектиновые вещества подразделяют на высоко- и низкоэтирифицированные (соответственно более 70 и менее 50 %) [16, 109, 148, 181, 243, 289]. Пектиновые вещества имеют молекулярную массу от 20 до 200 кДа.
Гелеобразующая способность пектина зависит от молекулярной массы, а также от количества метальных групп, входящих в состав молекулы, содержания свободных карбоксильных групп и замещения их металлами. Например, пектины с молекулярной массой от 150 до 200 кДа характеризуются высокими желирую- щими способностями. Пектины с меньшей молекулярной массой и высокой степенью этерификации легче растворяются в воде [115,148, 230].
Пектины для пищевой промышленности получают путем кислотной или щелочной экстракции, либо ферментативного расщепления из яблочных выжимок, свекловичного жома и корзинок подсолнечника [32]. Цитрусовые пектины вырабатывают из выжимок цитрусовых плодов: апельсинов, лимонов и т. п. [16, 29, 133, 150, 246].
В нашей стране значительное количество пектина как сырьевого продукта для пищевой промышленности закупают у иностранных фирм- производителей [77, 109, 208]. При этом около 80% зарубежного пектина составляет пектин из крупноплодных цитрусовых. Основным производителем пектина из цитрусовых является американская фирма Gercules Inc., имеющая около 150 дочерних предприятий в разных странах мира. Крупнейшее предприятие Kopenhagen pectin fabric (Дания) вырабатывает около 20 типов пектинов с торговой маркой «GENU» для различных областей пищевой промышленности. Яблочный пектин производится в основном в Англии, Франции, Австрии, Швейцарии, Германии, Мексике, Италии. Крупнейшими фирмами по выработке пектина из сушеных яблочных выжимок являются Grill & Grossman, Grinstedt, Herbsrtreit & Fox KG, Cesalpina [77, 232, 284].
Пектины - пищевые растительные волокна, которые сорбируют и выводят из организма человека токсичные продукты обмена, радионуклиды, тяжелые металлы, шлаки; нормализируют работу желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой системы; снижают уровень глюкозы в крови [20,58, 103, 119,210, 287].
Низкоэтерифицированный пектин используют при изготовлении овощных и фруктовых желе, паштетов и студней, а так как при низких концентрациях он может придавать кондитерским начинкам тиксотропную текстуру, его применяют для получения желейных изделий и начинок (например, желейных изделий с мятным или коричным вкусом).
Методы определения физико-химических свойств экзополисахаридов
Аубазидан - отечественный полисахарид, полученный в 1980 г. при выращивании А. ри11и1ат, который представляет собой высокомолекулярный глюкан с разветвленной структурой: основная цепь содержит (3 — 1,3 — связанные остатки глюкозы (21%), боковые цепи содержат а — 1,4 - гликозидные цепи (52 %), присоединенные к основной цепи (3 — 1,6 гликозидными связей (27 %). Молекулярная масса составляет около 6-Ю6- 10-106Да. Используется как стабилизатор суспензий и эмульсий в фармакологии при приготовлении лекарственных форм, пищевой промышленности, при добыче нефти, а также как пленкообразующее средство [4, 5, 8]. Лиофильно высушенный препарат полисахарида представляет собой волокнисто-пористый материал. На его основе созданы ранозаживляющие препарат «Аубазипор» и вагинальная губка - контрацептив с противовирусной и противовоспалительной активностью «Спемикол» [86].
Пуллулан, также экзополисахарид гриба А. риШйат, является зарубежным аналогом аубазидана. Пуллулан — нейтральный линейный полимер, состоящий из остатков О — глюкозы, соединенных между собой а - (1 — 6) гликозидными связями и а — (1 — 4) гликозидными связями [184]. Молекулярная масса пуллулана от 50 до 4000 кДа. Он легко растворим в воде, образует бесцветные вязкие и клейкие растворы, не растворим в метаноле и ацетоне. Полимер имеет хорошую адгезию к стеклу, металлам, древесине и пищевым продуктам. В США разработан способ производства хлеба с использованием пуллулана, входящего совместно с аскорбиновой кислотой и цистеином или глютатионом в состав комплекса улучшителей, который вносится при замесе теста [114, 271]. В медицине используется при получении плазмы крови и для пролонгирования действия лекарственных средств путем заключения их в оболочку из полимера, так как пленки на его основе малопроницаемы для кислорода. Кроме того, сформованный в форме пластика, пуллулан по свойствам подобен полистиролу, но является более эластичным. Гибкость пленок может быть улучшена добавлением пластификатора (до 20 %); в качестве пластификатора рекомендуются сорбит, мальтит или глицерин [126, 131].
Склероглюкан (политран) — натуральный гомополимер, получаемый из Sclerotium glucanicum. Склероглюкан — линейный полимер, состоящий из остатков D-глюкозы, соединенных между собой —(1 — 3) и —(1 — 6)-гликозидными связями [184]. Склероглюкан образует гели, обладающие псевдопластичностью в широком диапазоне температур и pH среды в концентрации 1,5 %. Обладает устойчивыми показателями вязкости при температуре от 15 до 90 С. Благодаря этому, широко используется в нефтедобывающей промышленности, а также в керамических глазурях, чернилах, типографских красках, для приготовления препаратов пестицидов [184].
Схизофиллан - гомополимер, синтезируемый грибами Schizophyllum commune и состоящий из остатков D — глюкозы, соединенных между собой - (1 — 3) гликозидными связями [184].
Два последних полимера, — глюканы склероглюкан и схизофиллан перспективно применять в медицине, так как они прошли клинические испытания в Японии, доказав свою эффективность в подавлении некоторых видов опухолей и стимуляции иммунитета [273].
Среди дрожжевых полисахаридов наиболее полно изучен зимозан. Зи- мозан не оказывает прямого цитотоксического действия на опухолевые клетки, но угнетает рост опухолей, снижает метастазирование. Одновременное применение иммуностимуляторов и химиотерапии показало, что глюкан повышает противоопухолевое действие циклофосфана, при этом увеличивается эффективность химиотерапии и уменьшается ее токсичность [60,184].
Эльсинан - является нейтральным экстрацеллюлярным линейным а — D — глюканом, содержащим 1,4 — и 1,3 — связи с молярным соотношением 2,0 - 2,5:1,0. Примерно 1 из 140 связей является а - 1,6 - связью. Синтезируется грибом Elsinol leucospila. В основном используется для получения пленок и покрытий вследствие его низкой проницаемости по отношению к кислороду и относительной устойчивости к кислотам [184].
В состав клеточных стенок гриба A. niger входит биополимерный хи- тин-глюкановый комплекс (ХГК), представляющий собой разветвленный полиаминосахарид, основная цепь которого макромолекула — хитин, а боковые цепи - глюкан [228]. По функциональным свойствам он близок к экзополи- сахаридам микроорганизмов, модифицированным крахмалам и микрокристаллической целлюлозе [149]. ХГК эффективно поглощает радионуклиды, тяжелые металлы и токсины химической природы. Он не токсичен, не оказывает сенсибилизирующего и мутагенного действия, устойчив в кислых средах. Используется как добавка в хлебобулочные изделия [133]. Разработаны способы получения полисахаридных комплексов из микроскопических грибов грибов семейства Aspergillaceae, состоящих из хитина с различной степенью деацитилирования, глюкана и полиаминосахаридов [107].
К бактериям, продуцирующим экзополисахариды, относятся следующие: Azotobacter, Pseudomonas, Arthrobacter, Xanthomonas, Diplococcus, Aerobacter Alcaligenes, Klebsiella, Agrobacterium, Rhizobium, Leuconostoc, Streptococcus и др. [41, 65, 114, 129, 159, 173, 190, 191, 195, 196, 212, 222, 239, 266, 277].
Значительный практический интерес представляют функциональные свойства бактериальных экзополисахаридов, главные среди которых: способность давать стабильные эмульсии; загущать водные растворы и дисперсии, в том числе с высокой концентрацией солей; стабилизировать суспензии [2], придавая им необходимые реологические свойства; образовывать гели при взаимодействии с трехвалентными ионами металлов или же с галакто- и глюкоманнанами [225]. Бактериальные полисахариды хорошо совместимы с другими полисахаридами и различными низкомолекулярными соединениями [41,56].
В 70 годы в СССР велись разработки по получению экзополисахарида, производимого ассоциациями дрожжей Candida tropycalis и бактерий Acinetobacter species. Данный биополимер применяли в качестве улучшителя муки в хлебопечении [3, 114].
Выбор штамма и оптимальных условий культивирования X. campestris для продуцирования экзополисахаридов
Исследование токсичности веществ в опыте проводили для оценки степени опасности однократного воздействия относительно высоких доз (3 г на 1 кг массы тела животного) [30, 114]. Исследовали клинически здоровых лабораторных животных, 40 самцов белых мышей массой 19-21 г. Лабораторных животных содержали по общепринятым методикам [12]. До постановки эксперимента был выдержан период карантина - 21 день. Животные были разбиты на 4 группы по 10 белых мышей: 1 группа — контрольная, 2 группа получала клебсилан, 3 группа - ксантомонан 610/1 и 4 группа — ксантомонан В-610/4. ЭПС вводили перорально через катетер в количестве 1 мл; контрольной группе вводили физиологический раствор (0,85 % №С1) в том же количестве. ЭПС разводили в физиологическом растворе [39, 40, 84] и вводили натощак.
Наблюдения за животными проводили в течение 3 суток. По окончании периода наблюдений всех животных контрольной и опытных групп подвергли эвтаназии, произвели вскрытие и оценку состояния внутренних органов и системы пищеварения [63, 73, 84]. Для макроскопических и гистологических исследований были взяты внутренние органы — сердце, почки, селезенка, печень, легкие, желудок, тонкий и толстый кишечники, согласно общепринятым методам [81].
Гибели экспериментальных животных ни в одной группе отмечено не было. Поведение животных в разных группах после введения препарата было различным. Через час наблюдений мыши контрольной группы активно поглощали корм и пили воду, движения их были спокойными. Мыши 3 и 4 групп, получившие препараты ксантомонанов 610/1 и 610/4, стали проявлять интерес к корму и воде лишь через 6 часов. Передвижения их были спокойными, отличия от поведения мышей контрольной группы было лишь в повышенной жажде, увеличению поглощения воды и снижению аппетита. Частота диуреза у мышей в третьей и четвертой группах сохранилась на уровне контрольной группы. Поведение мышей второй группы, получивших клебси- лан, резко отличалось от поведения контрольных животных. Мыши проявляли беспокойство, повышение двигательной активности; наблюдалась повышенная жажда с сокращением диуреза, корм оставался нетронутым. Через 12 часов после внутрижелудочного введения отличие в поведенческих и физиологических характеристиках в сравнении с животными контрольной группой сохранилось лишь у мышей второй подопытной группы.
Полученные данные коррелируют с результатами испытаний препаратов ЭПС на инфузориях. После проведения вскрытия мышей были обнаружены следующие изменения внутренних органов (табл. 8): - 1 группа - контрольная - при вскрытии визуально не были выявлены патологические изменения со стороны внутренних органов. Желудок был слабо наполнен содержимым бежевого цвета кашицеобразной консистенции. Фекалии слабо сформированы полужидкой консистенции. Желчный пузырь наполнен желто-зеленым содержимым. - 2 группа - при вскрытии были выявлены визуально патологические изменения со стороны внутренних органов. В легких наблюдались кровоизлияния и уплотнения диаметром 0,4 — 0,6 см; печень имела белые пятна диаметром 0,1 — 0,2 см, края округлые; селезенка увеличена, края округлые; почки — на разрезе, рисунок не дифференцирован; в тонком и толстом отделе кишечника наблюдалось скопление газов, стенки кишечника серо-белого цвета, содержимое кишечника и желудка жидкое желто-зеленого цвета, слабое наполнение желудка и кишечника с жидкой консистенцией их содержимого. - 3 группа - клинические признаки интоксикации отсутствовали. При вскрытии визуально не были выявлены патологические изменения со стороны внутренних органов. Стенки толстого и тонкого отдела кишечника, по сравнению с протоколами вскрытия мышей контрольной группы, были розового цвета, более эластичны. Тонкий отдел частично наполнен тестоватым светло-зеленым содержимым, а толстый отдел кишечника обильного наполнения тестовым содержимым зеленого цвета, фекалии сформированы и увеличены в объеме, по сравнению с контролем. - 4 группа - клинические признаки интоксикации отсутствовали. При вскрытии визуально не были выявлены патологические изменения со стороны внутренних органов. Тонкий отдел кишечника был розового цвета, по сравнению с аналогичным органом мышей контрольной группы более эластичен, наполнен тестоватым светло-зеленым содержимым.Толстый отдел кишечника частично наполнен сформированными фекалиями, которые увеличены в объеме по сравнению с контролем.
Изучение биологических свойств экзополисахаридов X. campestris В — 610/1, В — 610/4 и pneumoniae К -2
Производимые в России ЭПС обладают ограниченным спектром действия, в основном применяются в технических отраслях народного хозяйства [71, 99]. Микробные ЭПС, необходимые при производстве пищевых продуктов и лекарственных средств, закупаются за рубежом (Франция, США, Китай).
Российскими учеными [18, 30, 78] было получено несколько штаммов РаетЬасШш ро1утуха и ВеуеппсЫа Бр. с повышенной продукцией ЭПС, обладающих высокой вязкостью, солеустойчивостью и другими потенциально полезными для применения свойствами.
В настоящее время ведется поиск микроорганизмов, в частности бактерий, перспективных с точки зрения продукции ЭПС, а также разрабатываются методы получения штаммов с повышенной продуктивностью по данному признаку и методы культивирования микроорганизмов-продуцентов ЭПС.
Целью настоящего исследования явилось выделение ЭПС Xanthomonas campestris В — 610иВ - 611 и Klebsiella pneumoniae К - 2, изучение их физико-химических и биологических свойств. Одной из первостепенных задач было получение вариантов ксантомонад, ЭПС которых могут найти приме- нениие в пищевой отрасли и ветеринарной медицине.
Для получения вариантов бактерий использовали метод облучения в высокочастотном электромагнитном поле и дальнейшего отбора наиболее слизистых колоний; дополнительно воздействовали низкими температурами. Из полученных 50 вариантов отобрано 5, дающих наиболее слизистые колонии: X campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23. Производимые ими ЭПС были названы ксантомонаны 610/1, 610/4, 610/11, 61016, 610/23. ЭПС Klebsiella pneumoniae К-2 получил название клебсилан.
Известно, что условия культивирования бактерий оказывают значительное влияние на биосинтез ими ЭПС. Были подобраны оптимальные условия для производства ксантомонадами и клебсиеллой экзополисахаридов. Сахароза оказалась лучшим источником углерода, чем глюкоза, как для клебсиелл, так и для ксантомонад; температура - 27 С была определена как оптимальная для продукции наибольшего количества ЭПС исследуемых бактерий; увеличение скорости встряхивания на шуттель-аппарате от 130 до 200 об/мин. положительно влияло на выход ЭПС; время культивирования, необходимое для достижения максимального количества ЭПС, составляло 44-50 ч. Следует отметить, что на среде 1, рекомендуемой для вы ращивания клебсиелл, продукция полисахаридов была меньшей, чем при выращивании их на среде 2 (рекомендуемой для ксантомонад). Далее среда 2 применялась с целью производства как ксантомонанов, так и клебсилана.
Следующим этапом исследований явилось изучение физико- химических и биологических свойств полученных нами полимеров с целью поиска путей возможного применения. С помощью ионообменной хроматографии была проведена дополнительная очистка ЭПС и разделение их на фракции. ЭПС ксантомонад были представлены следующими фракциями: X campestris В - 610 - 1 нейтральной и 1 кислой фракций; ксантомонан 610/1 - 1 нейтральной; ксантомонан 610/4 - 2 нейтральными и 1 кислой; ксантомонан 610/11 - 1 нейтральной и 2 кислыми; ксантомонан 610/16 — 1 кислой; ксантомонан 610/23 - 1 нейтральной и 1 кислой. ЭПС. Клебсилан был представлен только 1 нейтральной фракцией. Таким образом, нами было выделено 7 экзополисахаридов, состоящих из разных фракций. Как показали дальнейшие исследования, они обладали широким спектром физико- химических и биологических свойств.
Были изучены молекулярные массы, моносахаридный состав и динамическая вязкость растворов ЭПС. Молекулярная масса всех ЭПС ксантомонад и клебсиелл составила от Т106— ЮТ О6 Да. Динамическая вязкость 1 % растворов ЭПС X. campestris В — 610 и его вариантов: ксантомонана 610/1, 610/4, 610/11, 610/16 и 610/23, определяемая с помощью ротационного вискозиметра, была различна и составляла 270, 160, 490, 480, 340 и 480 мПа-с соответственно. Значения рН растворов ЭПС всех исследованных бактерий были в пределах 7,40 - 7,53. Растворы ЭПС К. pneumoniae К — 2 (1 %) обладали динамической вязкостью 150 мПа-с и значением рН 7,5. В состав всех ЭПС ксантомонад входят манноза, глюкоза и галактуроновая кислота, что согласуется с литературными данными [23, 27, 41, 170, 183, 222, 235, 245, 288]; ЭПС К. pneumoniae К — 2 состоит из маннозы, глюкозы, галактозы, галакту- роновой, глюкуроновой кислот и имеются следы фукозы и арабинозы. Интересно отметить, что проверка ЭПС вариантов ксантомонад на идентичность ксантану, принятому в Европейской фармакопее (ссылка), дала отрицательные результаты во всех случаях, то есть новые биополимеры близки к ксантану по свойствам и составу, но не идентичны.
Известно, что вещества, предлагаемые для использования в пищевой, медицинской и ветеринарной отраслях, должны проходить обязательную гигиеническую экспертизу, включающую ряд обязательных исследований в зависимости от предполагаемого направления применения. Первым этапом исследований является изучение возможного общетоксического действия препарата.
Похожие диссертации на Экзополисахариды ксантомонад и клебсиелл: физико-химические, биологические свойства и перспективы применения
