Содержание к диссертации
Введение
1. Мембранотропные эффекты 7
1.1. Типы мембранотропного влияния веществ 7
1.2. Мембранотропные соединения 9
1.2.1. Редокс-агенты 9
1.2.2. Ионы тяжелых металлов 19
1.2.3. Протекторные соединения 20
1.2.4. Детергенты 25
1.2.5. Активаторы и ингибиторы слияния мембран 30
1.2.6. Ионофоры и каналоформеры 33
1.2.7. Полимерные соединения 39
2. Подходы к исследованию мембранотропного действия веществ 45
2.1. Объекты для исследований реакции биологических мембран на действие веществ 45
2.2. Методы исследования мембранотропных эффектов 47
2.2.1. Электрофизиологические методы 47
2.2.2. Физические методы 52
2.3. Постановка задач диссертационной работы 57
3. Объект и методы исследования 59
3.1. Растительный материал 59
3.2. Выделение вакуолей 59
3.3. Растворы 59
3.4. Компьютерная цейтрафферная видеосъемка микроскопических образцов 60
3.4.1. Экспериментальная установка 61
3.4.2. Схемы экспериментов 67
3.5. Пэтч-кламп измерения 68
3.5.1. Приготовление микропипеток для пэтч-кламп измерений 68
3.5.2. Система регистрации 69
3.5.3. Методика пэтч-кламп измерений 71
3.5.4. Обработка результатов измерений 73
3.6. Статистический анализ 73
3.7. Использованные реактивы 73
4. Влияние мембранотропных соединений на стабильность изолированных вакуолей 75
4.1. Редокс-агенты 80
4.1.1. Пероксид водорода 80
4.1.2. Аскорбиновая кислота 82
4.1.3. Редокс-пара глутатиона 84
4.1.4. Дитиотреитол 84
4.1.5. Диметилсульфоксид 87
4.1.6. Дигидрокверцетин 87
4.2. Полимерные соединения 89
4.2.1. Поливинилпирролидон 89
4.2.2. Арабиногалактан 93
4.2.3. Альбумины 93
4.3. Стимуляторы роста растений: амбиол, фонк, бихол 95
4.4. Сравнительный анализ влияния биологически активных веществ на стабильность мембраны изолированной вакуоли 97
5. Действие диметил сульфоксид а на электропроводность мембраны изолированной вакуоли 104
Общее обсуждение 115
Выводы 121
- Мембранотропные соединения
- Методы исследования мембранотропных эффектов
- Выделение вакуолей
- Полимерные соединения
Введение к работе
Биологические мембраны являются универсальным поли функциональным образованием клетки, обеспечивающим компартментацию метаболизма и нормальное протекание биохимических реакций, как на самих мембранах, так и в примембранном пространстве. Исследование мембран растительных клеток и их реакции на физико-химические факторы различной природы составляет одно из важнейших направлений физиологии растений. Общеизвестно, что мембраны состоят из жидкокристаллического би слоя определенным образом ориентированных фосфолипидных молекул, в который погружены интегральные белки. Основные функции клеточных мембран заключаются в отделении содержимого клеток от внешней среды, в создании внутренней структуры клетки, поддержании электрохимического градиента, осуществлении транспорта веществ (барьерная, транспортная, осмотическая, структурная, энергетическая, биосинтетическая, секреторная, рецепторно-регуляторная и другие функции). Лабильность структурной организации мембраны определяет ее динамические свойства. Молекулярные изменения и структурные перестройки в молекулах мембранных компонентов оказывают влияние на все формы функциональной активности биологических мембран.
Многие из естественных и синтезированных химических соединений способны при взаимодействии с мембранами изменять их структурные и функциональные характеристики, т.е. обладают мембранотропными свойствами. Химические вещества могут способствовать или нарушению функциональной активности мембраны, или стабилизации ее свойств и повышению устойчивости в неблагоприятных условиях. Изучение механизмов реакции мембран на химические воздействия необходимо как для понимания принципов функционирования мембранных систем, так и для осуществления направленного поиска новых биологически активных соединений важных во многих областях практической деятельности.
В настоящее время в мире синтезируется большое количество химических
5 соединений. Причем увеличение числа новых соединений значительно превышает возможность получения данных об их действии на биологические мембраны. Поэтому часть веществ, которые могут быть полезны или, наоборот, могут представлять опасность для природы и человека, остаются до сих пор слабо изученными. Таким образом, существует большая потребность в оценке действия веществ на различные функции мембран (Баренбойм и Маленков, 1986). Решение этой задачи затруднено отсутствием эффективных методов скрининга мембранотропной активности химических соединений (тестирования химических веществ на мембранотропность). Кроме того, выбор биологического объекта для исследований подобного рода должен быть обусловлен возможностями, прежде всего, тестирования (отбора) веществ на мембранотропную активность, а также детального исследования конкретных механизмов действия веществ. Как нам представляется, подходящим в этом отношении тест-объектом может быть мембрана изолированной вакуоли. На данный момент достаточно хорошо изучены структурные и биохимические параметры этой мембраны (Саляев и др., 1982; Саляев и др., 1983; Kaiser et al., 1986), исследованы ее основные транспортные системы: протонные насосы (t-АТФаза и Н^-пирофосфатаза), переносчики (Maeshima, 2001), ионные каналы (Тихонова, 1998), из которых наиболее подробно изучен медленный вакуолярный (MB) канал (Hedrich and Neher, 1987).
Целью настоящей работы явилось изучение физиологической реакции функциональных систем мембран изолированных вакуолей на воздействие веществ, потенциально обладающих мембранотропной активностью, из классов редокс-агентов, полимерных соединений и стимуляторов роста растений. В работе были поставлены следующие задачи: а) разработка методов тестирования мембранотропных соединений и исследования механизмов их действия; б) изучение влияния окислителей, восстановителей, протекторных соединений, полимеров и некоторых новых стимуляторов роста растений на барьерную функцию мембраны изолированных вакуолей; в) исследование
механизмов воздействия одного из широко известных мембранотропных соединений - диметилсульфоксида на транспортные характеристики мембраны изолированной вакуоли.
Одним из видов реакции мембраны на химические воздействия является изменение ее барьерной функции, которая тесно связана со стабильностью (механической прочностью) мембраны. Поэтому для выявления мембранотропной активности веществ разумно использовать подход, основанный на определении изменения стабильности мембран при воздействии. Для этой цели нами был разработан автоматизированный метод регистрации серии микроскопических изображений, отражающих процесс разрушения фракции изолированных вакуолей. Конкретные механизмы действия химических веществ на функциональные структуры мембраны, приводящего к изменению ее барьерной функции, на наш взгляд, наиболее детально можно изучать, применяя электрофизиологические методы исследования.
В результате проведенных исследований получены новые данные о влиянии химических соединений из классов окислителей-восстановителей, полимеров и стимуляторов роста растений на барьерные свойства мембраны и установлен ряд веществ, оказывающих хорошо выраженное протекторное действие на мембраны. Изучены электрофизиологические особенности взаимодействия с вакуолярной мембраной широко используемого в экспериментах и практике мембранотропного соединения -диметилсульфоксида.
Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).
Автор выражает благодарность руководителям работы члену-корреспонденту Р.К. Саляеву и к.б.н. A.M. Корзуну, ведущему инженеру-программисту СВ. Розинову а также всем сотрудникам лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР за поддержку и помощь в работе.
Мембранотропные соединения
Существует множество способов модификации фосфолипидного бислоя, в результате которых изменяются непрерывность бислоя, асимметрия, градиент гибкости, микровязкость, подвижность компонентов бислоя или его состав. Нарушение непрерывности бислоя связано с образованием в нем липидных гидрофильных пор - структурных дефектов типа сквозных отверстий, проницаемых для молекул воды и ионов. При этом изменяются все функции мембраны, и в первую очередь проницаемость и стабильность. Некоторые вещества способны встраиваться в мембрану и делать ее проницаемой для ионов. Белки мембран могут подвергаться как прямому действию химических веществ, так и опосредованному, через липидное окружение. К мембранотропным соединениям относятся про- и антиоксиданты, ионофоры и каналоформеры, ингибиторы и активаторы мембранных ферментов и транспортных систем, детергенты различного происхождения и др. 1.2.1. Редокс-агенты В аэробных условиях в клетке в ходе дыхания постоянно образуются так называемые активные формы кислорода (АФК), или прооксиданты. По одному из существующих определений АФК есть совокупность короткоживущих, взаимопревращающихся и относительно реакционноспособных форм кислорода, взникающих в результате его электронного возбуждения или окислительно-восстановительных превращений (Зенков и Меньшикова, 1993). К ним относятся супероксидный анион-радикал Ог"-, пергидроксильный радикал НО/, перекись водорода Н202, гидроксильный радикал ОН", синглетный кислород 02 , гипогалоиды ОСГ, ОВг-, ОГ, перекисный радикал R02\ алкоксильный радикал RO . В цитоплазме АФК вовлечены как в аэробные биохимические процессы (например, фотосинтез, окисление метаболитов и др.), так и в защитные механизмы против внедрения патогенов. АФК также участвуют в процессах переписного окисления липидов (ПОЛ) (Владимиров и др., 1991). В живой клетке активность АФК контролируется защитными системами со специализированными ферментативными и неферментативными антиоксидантами (АО), в которых существенное значение имеют низкомолекулярные вещества (глутатион, аскорбиновая кислота, токоферол, NADH и др.). Под АО понимают класс веществ, в который входят соединения, снижающие активность радикальных окислительных процессов по одному или нескольким механизмам. При этом различают превентивные АО (изменяющие структурную организацию субстрата окисления, снижающие концентрацию 02, связывающие или окисляющие ионы металлов переменной валентности и осуществляющие перевод перекисей в стабильные продукты окисления: спирты, альдегиды, кетоны) и ингибиторы радикалов (АФК или органических радикалов) (Halliwell and Gutteridge, 1990). АФК оказывают влияние на основные компоненты мембраны (рис. 1). При воздействии на липидный бислой АФК индуцируют или принимают участие в процессах ПОЛ. Известно, что ПОЛ имеет цепной характер и включает следующие стадии: инициацию, продолжение, разветвление и обрыв цепи.
На стадии инициации под действием ионизирующей радиации, ультрафиолетовой компоненты солнечного излучения, некоторых химических веществ, озона воздуха и других воздействий происходит образование органических радикалов (R"). На следующей стадии R" быстро взаимодействует с 02, который в силу незаполненности верхних молекулярных орбиталей выступает в качестве акцептора электронов. В результате такого взаимодействия образуется пероксирадикал (RCV), среднее время жизни которого в биологических субстратах равно 7 с. В свою очередь RO2" атакует ненасыщенные лип иды. Возникновение в результате этой реакции нового радикала R" способствует продолжению окислительной цепи: R + Ог — RCV, RCV + RH — ROOH + К . Возникающие в результате окисления органические перекиси могут включаться в процесс генерации радикалов, так как в присутствии металлов переменной валентности (Си , Со , Мп , V , Fe ) наблюдается разложение с образованием реакционного алкоксильного радикала: ROOH + Меп+ — RO + ОН + Ме(п+1)+. Не все радикалы R , RO" и R02" продолжают участвовать в цепных реакциях, часть их рекомбинирует с образованием неактивных продуктов: R + R - - RR; RO2 + R" - ROOR. В результате реакции диспропорционирования перекисных радикалов образуются молекулярные продукты в возбужденном состоянии, переход которых в основное состояние может сопровождаться излучением кванта света: R02 + R02" - Р -» Р + hv. Обрыв цепных реакций ПОЛ возможен также при взаимодействии радикалов с антиоксидантами. В результате ПОЛ изменяется структура мембраны. Так, например, в искусственных мембранах окисление липидов устраняло образование нанодоменов (Muskatello et al., 2000). Структурные изменения липидного бислоя мембраны приводят к нарушению его барьерных свойств. Сильные окислители (например, ОН ), кроме того, вызывают повреждения белков мембраны. В обзоре (Владимиров, 2002) приведена классификация видов действия ПОЛ на биологические мембраны, в которой различают влияние пероксидации на барьерные свойства мембраны и на физические свойства липидной фазы. Из всех соединений с АФК наиболее стабильна перекись водорода. Молекулы Н202 не имеют электрического заряда и поэтому легко проникают через биологические мембраны. Н202 является окислителем умеренной силы: она способна окислять такие соединения, как тиолы. Цитотоксический эффект Н202 объясняется тем, что внутри клетки она может разлагаться с образованием гидроксильного радикала НО , обладающего очень высокой реакционной способностью.
Наиболее часто в литературе рассматривается разложение Н2О2 ионами железа в результате реакции Фентона: Н202+ Fe + — НО" + НО + Fe +. Поэтому Н202 вместе с ионами Fe2+ обычно используют в экспериментах по изучению окислительных процессов в мембране. Выявлено, что введение перекиси водорода в суспензию клеток Е. соїі приводило к нарушению барьерных свойств бактериальной плазматической мембраны только в случае преинкубации клеток с ионами Fe2+ и поддержании их постоянной концентрации в системе аскорбатом или дитиотреитолом (Иванов и др., 2000). При ПОЛ вязкость липидного бислоя мембраны увеличивалась (Владимиров, 2002). Однако в работе (Brzeszczynska and Gwozdzinski, 1998) пероксид водорода наоборот повышал жидкостность мембраны эритроцитов, что коррелировало с переокислением липидов. Кроме того, в этой же работе органические и неорганические пероксиды увеличивали подвижность мембранных белков, а также чувствительность к повышению осмотического давления. Выяснено, что вместе с индукцией ПОЛ Н2Ог увеличивал пассивную катионную проницаемость мембраны эритроцитов (van der Zee et al., 1985). Однако между двумя этими процессами не обнаружено строгой взаимозависимости. Так, предобработка клеток бутилированным гидрокситолуолом или СО значительно ингибировала ПОЛ, не влияя на утечку К+. Кроме того, SH-реагент диамид сильно ингибировал НгОг-индуцированное увеличение пассивной катионнои проницаемости, что указывает на вовлечение окисления SH-групп, т.е. модификации протеинов, в этот процесс. В работе (Richards et al., 1988) лизис эритроцитов, индуцированный гидроксильными радикалами ОН", происходил при полной остановке ПОЛ с помощью экзогенных антиоксидантов. При окислительном стрессе АФК в присутствии ионов Са окисляли тиоловые группы белков внутренней мембраны митохондрий (Kowaltowski et al., 1998). Под действием главным образом гидроксил-радикала происходит окисление цистеиновых остатков белков с образованием дисульфидных связей и метиониновых остатков с образованием метионин-сульфоксида. Окисление тиоловых групп и появление дисульфидов приводило к нарушению функции митохондрий (Berlett and Stadtman, 1997; Kowaltowski and Vercesi, 1999) и было связано с формированием у j неспецифических мембранных пор.
Методы исследования мембранотропных эффектов
Электрофизиологические методы позволяют решать различные задачи, например, изучать контактные взаимодействия, вязкоупругие свойства мембран, исследовать электрохимические явления на границе раздела мембрана - водная фаза и т.д. Наибольшее распространение эти методы нашли при изучении транспортных свойств мембран. Это обусловлено, прежде всего, тем, что электрофизиологические методы позволяют регистрировать электрические сигналы, связанные с функционированием транспортных систем в большом диапазоне временных интервалов (начиная с микросекунд) и с высокой чувствительностью (вплоть до регистрации электрической активности отдельных ионных каналов). Однако круг вопросов, которые могут быть решены путем измерения электрических параметров мембран и достоверность получаемой информации, в значительной степени зависит от объекта исследований и техники регистрации электрических параметров. Пэтч-кламп метод позволяет измерять электрические параметры мембран в условиях известного состава среды. Он был разработан для регистрации электрической активности одиночных ионных каналов. Суть метода заключается в креплении мембраны в виде перегородки на отверстии стеклянной микропипетки и регистрации ионных токов, идущих через мембрану (Hamill et al., 1981). Важной особенностью метода является отсутствие утечек тока в месте соприкосновения мембраны со стеклом, что достигается формированием контакта с высоким сопротивлением ( 1 ГОм). Имеется несколько способов регистрации методом пэтч-кламп (рис. 4). Наиболее близким к естественным условиям является вариант измерения ионных токов на прикрепленной, но неповрежденной клетке (конфигурация "on-cell" или "cell-attached"), В этом случае исследуемый участок мембраны не отделяется от клетки и не нарушается его связь с цитоплазмой. Измерение на целой клетке осуществляют в конфигурации "whole-cell". Для этого после образования плотного контакта поверхности пипетки с мембраной из конфигурации "cell-attached" мембранную перегородку в отверстии пипетки разрушают подачей импульса напряжения или отрицательного давления. После осуществления прокола мембраны цитоплазма оказывается электрически соединена через микропипетку с измерительным электродом. Это позволяет заменять ионный состав цитоплазмы, а затем в режиме фиксации напряжения регистрировать ионные токи на диализированных таким образом клетках.
Ионные токи через отдельные каналы измеряют, как уже упоминалось, на микроучастке мембраны, ограниченном кончиком микропипетки, с прикрепленной клеткой (конфигурация "cell-attached" или "on-cell"), а также на изолированном микроучастке мембраны (пэтче). Из конфигурации "cell-attached" можно получить два вида изолированного пэтча — как внутренней стороной наружу ("inside-out patch"), так и внешней стороной наружу ("outside-out patch"). В первом случае после крепления мембраны к микропипетке пипетку "отдергивают" от клетки. На ее отверстии остается мембранная везикула. Наружную мембрану разрушают при короткой экспозиции на воздухе. Во втором случае из конфигурации "cell-attached" мембрану под пипеткой разрушают подачей импульса напряжения или отрицательного давления (конфигурация "whole-cell") и после этого микропипетку отводят от клетки. Мембрана замыкается и образует пэтч, ориентированный наружной поверхностью клетки к омывающему раствору. Модификацией регистрации "whole-cell" является конфигурация "перфорированный пэтч" ("perforated patch"). В этом случае пипеточный раствор содержит каналообразугощие мембранотропные соединения, которые модифицируют пэтч в конфигурации "cell-attached", обеспечивая электрическую непрерывность между раствором внутри пипетки и цитоплазмой клетки. Таким образом, возникает возможность регистрации ионных токов через всю мембрану клетки (интегральный ток) без необходимости разрушения пэтча. К тому же при перфорированном пэтче не происходит потери или изменения состава соединений цитоплазмы. В качестве каналоформера вначале использовали нистатин, который вызывает быстрое и обратимое увеличение проводимости мембраны по отношению к катионам (Horn and Marty, 1988). Удобной альтернативой послужил амфотерицин В (Rae et al., 1991). Он образует слабоселективные каналы, проницаемые для низкомолекулярных соединений, путем комплексообразования с мембранным холестерином (Досон и др., 1991). Применение грамицидина D в перфорированном пэтче не только предотвращает выход метаболитов из клетки, но и обеспечивает наибольшую селективность, делая мембраны проницаемыми для протонов и катионов щелочных металлов (Akaike, 1996). Относительно недавно предложено использовать ПАВ, р-эсцин (производное сапонина), для модификации мембраны в пэтч-кламп эксперименте (Fan and Palade, 1998). Это соединение образует неселективные поры в липидном бислое, размеры которых зависят от концентрации. При 50-100 мкМ Р-эсцин способствует проницаемости мембраны для веществ с большим молекулярным весом (Konishi and Watanabe, 1995). Преимуществом 3-эсцина является его хорошая растворимость в воде, к тому же он позволяет вводить в цитоплазму низкомолекулярные соединения, такие как красители, индикаторы и др. Пэтч-кламп метод обладает значительными преимуществами перед другими микроэлектродными методами. Это, прежде всего, гарантированное отсутствие утечек, а также контролируемый состав растворов по обе стороны мембраны. Кроме того, метод позволяет устанавливать фиксированное напряжение на мембране вследствие более высокого сопротивления мембраны по сравнению с сопротивлением микропипетки и отсутствия утечек тока в месте контакта мембраны со стеклом. Относительно недавно фирмой Axon Instruments (США) представлены две автоматизированные установки для тестирования большого количества веществ по влиянию на мембранные транспортные системы (ионные каналы и переносчики) (OpusXpress, 2002; PatchXpress, 2003). Первая установка основана на стандартЕюй электрофизиологической методике. В условиях фиксации мембранного потенциала регистрируются токи от ооцитов лягушки Xenopus, в цитоплазму которых предварительно введены м-РНК исследуемого ионного канала.
После того, как в клетках произойдет синтез и встраивание белков канала в плазматическую мембрану, ооциты помещают в экспериментальные камеры установки, и начинается эксперимент. Нововведение состоит в том, что установка имеет 8 камер, т.е. может работать одновременно с восемью ооцитами, и достигнута высокая степень автоматизации. Введение электродов, смена растворов, регистрация токов и слежение по электрическим характеристикам за жизнеспособностью ооцитов, т.е. фактически весь процесс сбора данных осуществляется без вмешательства экспериментатора под управлением компьютера по заранее составленному плану. Разработчики считают, что на восьми ооцитах можно протестировать до 192 соединений, по 24 на ооцит. Вторая установка регистрирует активность ионных каналов различных клеток пэтч-кламп методом в конфигурации "whole-cell". Образование плотного контакта с высоким сопротивлением, разрыв участка мембраны для формирования нужной конфигурации, регистрация токов по заранее составленному протоколу и смена растворов происходят автоматически одновременно в 16 камерах установки. Предполагают, что при работе на полную мощность установка может тестировать более 2000 соединений в день. Это настоящий прорыв в фармакологии ионных каналов. Случаи использования обеих установок на практике в литературе еще не описаны, однако можно надеется, что оба подхода в ближайшее время будут способствовать быстрому и эффективному поиску новых блокаторов и активаторов ионных каналов, Электронный парамагнитный резонанс как метод исследования подвижности (упорядоченности) макроструктур стал применяться после разработки синтеза стабильных нитроксильных радикалов. Введение такого радикала в состав молекулы позволяет использовать ЭПР-зонды для характеристики микровязкости бислоя, степени упорядоченности и вращательной или поступательной подвижности меченых молекул в разных условиях. ЭПР-спектр "реагирует" на изменение не только анизотропии, но и скорости вращения метки, описываемое временем корреляции.
Выделение вакуолей
Для исследований использовались вакуоли корнеплодов столовой свеклы Beta vulgaris L. Растения выращивали на опытном участке института. Корнеплоды отбирали на фазе покоя (для тестирования мембранотропных соединений) и на фазе первого года вегетации (для пэтч-кламп экспериментов). Корнеплоды хранили в овощехранилище в течение нескольких месяцев при температуре +4-+5 С. 3.2. Выделение вакуолей Изолированные вакуоли получали микрообъемным механическим методом (Саляев и др., 1981). Корнеплод свеклы нарезали на брусочки шириной 5 мм и длиной 2-3 см. 3-4 брусочка помещали на 2 мин в чашку Петри с раствором выделения. Затем брусочки свеклы нарезали лезвием безопасной бритвы на тонкие пластинки (толщиной 1 мм). Кусочки ткани оставляли в растворе еще на 2 минуты, после чего вынимали из чашки Петри пинцетом. Вакуоли, осевшие на дно, определяли в бинокуляр как красные шарики на розовом фоне. Вакуоли засасывали в микропипетку и переносили в камеры установки для цейтрафферной компьютерной видеосъемки с инкубационным раствором, или в камеру пэтч-кламп установки, заполненную контрольным раствором. 3.3. Растворы Раствор выделения содержал — для экспериментов по изучению влияния веществ на барьерные свойства мембраны (в мМ): 100 КС1, 5 ЭДТА, 15 HEPES/KOH, рН 8,3, аланин (до осмотической концентрации 1000 мОсм-кг-1); для пэтч-кламп эксперимента: 100 КС1, 2 MgCl2, 5 ЭДТА, 50 трис/MES, рН 7,5- _, 8,0. Осмотическую концентрацию (1150 мОсм-кг ) регулировали аланином и измеряли на осмометре ОМКА 1Ц-01 (Россия). Инкубационный раствор содержал (в мМ): 100 КС1, 15 HEPES/KOH, рН 7,3, аланин (до осмотической концентрации 1 Осм-кг-1). В качестве мембранотропных агентов использовали соединения, названия, концентрация, краткая характеристика и источник получения которых представлены в таблице 1 (стр. 74). Поскольку цитотоксическое действие Н2Ог обусловлено тем, что он может быть источником гидроксильных радикалов, в растворы с перекисью добавляли 50 мкМ FeSC 4 7НгО и 150 мкМ аскорбиновой кислоты для запуска реакции Фентона, как описано в работе (Иванов и др., 2000). Контрольный раствор, использовавшийся для заполнения экспериментальной камеры пэтч-кламп установки и проведения контрольных измерений в начале каждого эксперимента, содержал (в мМ): 100 KCI, 2 MgCb, 0,1 СаС12, 1 ЭГТА, 5 трис, рН 7,3-7,5 - MES, аланин (1150 мОсм-кг"1). Для заполнения микропипеток использовался раствор, содержащий (в мМ): 100 КС1, 2 MgCl2, 5 трис, рН 5,5-6,0 - MES, аланин (1050 мОсм-кг"1). 3.4.
Компьютерная цейтрафферпая видеосъемка микроскопических образцов Как известно, цейтрафферная (замедленная) регистрация прижизненных процессов, происходящих в биологических микрообъектах, посредством киносъемки позволяет наблюдать в динамике явления, недоступные человеческому глазу в обычных условиях (Кравченко и др., 1969). Такая регистрация, на наш взгляд, была бы полезна во многих областях физиологии растений и биотехнологии. Использование современной компьютерной техники, обладающей возможностью записи, хранения и обработки большого количества видеоинформации, способно значительно упростить и расширить эффективность таких исследований. Для увеличения производительности эксперимента важно в одном опыте зарегистрировать изображение не одного, а серии микроскопических образцов. При таком подходе можно варьировать условия эксперимента, осуществлять контроль и различного рода воздействия на образцы, что позволит использовать цейтрафферный метод для решения таких задач как испытания влияния физических факторов, действия биологически активных соединений и т.д. 3.4.1. Экспериментальная установка Для решения задачи автоматизации эксперимента по изучению стабильности вакуолярных мембран в условиях действия мембранотропных соединений нами была разработана и создана экспериментальная установка для цейтрафферной компьютерной регистрации видеоизображений серии микроскопических образцов, а также программное обеспечение (создано ведущим инженером-программистом СВ. Розиновым), позволяющее управлять экспериментом и обрабатывать полученные видеоданные. Установка (рис. 5) состоит из инвертированного микроскопа Биолам ГТ-1 (Россия) (1), коллектора микроскопических образцов (собственного изготовления) (2), закрепленного на столике микроскопа, видеокамеры КТП-67 (Россия) (3), установленной на микроскопе через микрофотонасадку МФН-11 (Россия) (4), фиксатора видеокадра на базе приборного интерфейса КАМАК (5), персонального компьютера (процессор Celeron — 600 МГц, RAM - 128 Мб, HDD — 30 Гб) (6), программного обеспечения для снятия и обработки видеоизображения (собственного изготовления). Коллектор микроскопических образцов (рис. б) состоит из двух дисков коллектора (1,2), выполненных из оргстекла, электродвигателя с редуктором (ДСМ-11-220, 2 об/мин) (3), с закрепленным на валу диском привода коллектора (4), корпуса крепления двигателя (5), 12 камер для микроскопических образцов (6), винтов крепления и регулировки вертикального положения камер (7), узла подшипника скольжения (8), на валу которого закреплены диски коллектора и подвижная система потенциометра (ПЛП) определения положения коллектора (9). Нижний диск коллектора имеет 12 радиальных разрезов, делящих его на лепестки. На верхнем диске коллектора укреплено 12 выступающих ребер. Камера для микроскопических образцов (6) представляет собой конструкцию, состоящую из бруска оргстекла с отверстием диаметром 10 мм, наклеенного на край вырезанной половинки стандартного микроскопического предметного стекла.
Свободным концом предметного стекла камера вставляется в щель между верхним (1) и нижним (2) дисками коллектора и зажимается винтом (7). Фокусировка изображения осуществляется этим же винтом, вертикальным перемещением камеры, подпружиненной лепестком нижнего диска коллектора, Перемещением (вручную) предметного стекла по горизонтали регулируется положение микроскопического образца в поле зрения микроскопа. Вращение коллектора осуществляется за счет зацепления ребер верхнего диска коллектора с выступами на диске привода коллектора (4) при работе электродвигателя (3). При попадании заранее заданной области микроскопического образца в поле зрения микроскопа, под действием выступа на диске привода коллектора (4) срабатывает микровыключатель, размыкающий цепь питания электродвигателя (3). Вращение коллектора прекращается. При этом выступ на верхнем диске коллектора (1) жестко фиксируется механической защелкой, что обеспечивает стабильность местоположения образца при многократной прокрутке коллектора. Блок управления коллектором состоит из схемы определения положения коллектора, схемы управления работой электродвигателя привода коллектора, блока питания (+12 В, +5 В, -12 В) и связан с компьютером через последовательный порт RS-232. Схема определения положения коллектора содержит мультивибратор на интегральном таймере К1006ВИ1 и формирователь сигнала линии связи на микросхеме К170АП2. В цепь, определяющую частоту выходного сигнала мультивибратора, включен потенциометр ПЛП (9), подвижная система которого закреплена на оси вращения коллектора, в результате чего в компьютер поступает сигнал с частотой, соответствующей номеру камеры микроскопического образца. Схема управления работой электродвигателя содержит усилитель сигнала линии связи (микросхема К170УП2) и буферный усилитель (К155ЛЛ2) нагруженный на электромагнитное реле, через контакты которого подключается электродвигатель привода коллектора. Фиксатор телевизионного кадра построен на базе приборного интерфейса КАМАК и содержит промышленные модули: быстродействующий аналого-цифровой преобразователь с оперативным запоминающим устройством (Ф4226), счетчик (2x24,111.005), крейтконтроллер (СС83), а также модуль собственного изготовления с микросхемой строчной развертки телевизионного приема (К174ХА11). Фиксатор оцифровывает черно-белый телевизионный сигнал с разрешением 1024x600 точек по 256 уровням яркости.
Полимерные соединения
Поливинилпирролидон представляет собой протекторное соединение. Его используют в качестве адсорбента фенолов или хинонов, которые являются токсическими эндогенными компонентами тканей, окисляющими SH-группы белков. Влияние ПВП на период полураспада изолированных вакуолей представлено на рис. 19. Как видно, ПВП оказывал незначительное воздействие на барьерную функцию тонопласта. С увеличением концентрации протекторное действие ПВП повышалось. По-видимому, содержание фенолов во фракции изолированных вакуолей недостаточно велико и ПВП увеличивал стабильность мембраны не за счет связывания фенолов. Скорее всего, эффект ПВП объясняется его полимерным строением. Стабилизирующее действие при этом могло быть связано с увеличением вязкости раствора, с возможным образованием объемной пространственной сетки и электростатического взаимодействия с поверхностью вакуоли. Определенную роль могли играть и взаимодействия концевых участков полимера с лектиноподобными белками тонопласта. 4.2.2. Арабипогапактаи Арабиногалактан (АГ) — природный полисахарид, входящий в состав древесины лиственницы Сибирской, где его содержание достигает 15 % по весу (Кузнецова и др., 2002). Предполагают, что АГ обладает гепатопротекторным, мембранотропным и иммуностимулирующим свойствами. Влияние этого вещества на период полураспада изолированных вакуолей представлено на рис. 20. Из рисунка видно, что АГ проявил протекторные свойства по отношению к тонопласту, и при увеличении концентрации стабильность вакуолей повышалась. Действие арабиногалактана на мембрану вакуолей, также как и в случае с поливинилпирролидоном, вероятно, определяется его полимерным строением. Можно предположить, что повышение стабильности изолированных вакуолей свеклы обусловлено взаимодействием углевода с тоноп ластом и формированием на поверхности вакуоли примембранного углеводного слоя (или пространственной сетки), способствующей восстановлению барьерных свойств тонопласта. 4.2.3. Альбумины БСА и ЧСА представляют собой кислые белки животного происхождения, которые являются преобладающими в плазме крови, т.е. белками, определяющими свойства микроокружения пограничных мембран. Эти белки используют для адсорбции фенола и хинона или для связывания свободных жирных кислот и ингибирования липолитической активности.
Влияние бычьего и человеческого сывороточных альбуминов на период полураспада изолированных вакуолей представлено на рис. 21. Как видно, альбумины незначительно влияли на барьерную функцию тонопласта, причем БСА проявил слабое стабилизирующее, а ЧСА - дестабилизирующее воздействие. При окислении липидов и при действии мембранных фосфолипаз в тонопласте могли образовываться жирные кислоты и их производные, которые приводят к дестабилизации мембраны при увеличении их концентрации до определенного предела. Связывание свободных жирных кислот альбуминами должно было повышать стабильность изолированных вакуолей. Учитывая отрицательный поверхностный заряд вакуоли, кислотность собственных белков тонопласта и высокие коэффициенты полярности альбуминов (-48 и 49 у БСА и ЧСА соответственно (Vanderkooi and Capaldi, 1972)), можно предположить, что их взаимодействие с мембраной было электростатическим и в меньшей степени гидрофобным. Связывание этих белков с мембраной могло приводить к образованию белковой "сетки", влияющей на барьерные свойства тонопласта. 4.3. Стимуляторы роста растений: амбиол, фоны, бихол Амбиол и фонк являются новыми биологически активными органическими веществами, впервые синтезированными в Институте биохимической физики РАН в 1984 г. (Смирнов и др., 1984) и в настоящее время широко применяемыми в растениеводстве. Малые дозы этих соединений вызывают усиление роста и развития надземной и подземной частей растений, увеличение их урожайности и устойчивости к стрессовым факторам, стимулируют прорастание семян и образование корешков у зеленых черенков растений (Поликарпова и др., 1994; Воронина и др., 1994). В модельной системе фотоиндуцированного окисления глицилтриптофана измерена антиоксидантная активность этих двух стимуляторов роста растений (Воронина и др., 2001). Показано, что амбиол обладает значительной антиокислительной активностью, а фонк - слабый антиоксидант. Еще одним новым биологически- активным соединением является бихол. Мембранотропная активность этих веществ до сих пор не исследовалась. Результаты экспериментов по влиянию синтетических стимуляторов роста амбиола и фонка в сравнении с влиянием пероксида водорода представлены на рис. 22 и 23, соответственно. Видно, что амбиол и фонк довольно сильно дестабилизировали мембрану вакуоли. Несмотря на то, что амбиол и фонк могут обладать антиоксиданти ой активностью, в условиях нашего эксперимента они сами оказывали повреждающее действие на тонопласт, а вместе с Н2О2 лишь ускоряли разрушение вакуолей. Вероятно, эти вещества в данных условиях, кроме замедления процессов ПОЛ, способствовали образованию водных пор в мембране, что в конечном итоге приводило к снижению ее барьерных свойств. Соединение бихол значительно стабилизировало тонопласт (рис, 24). Период полураспада вакуолей при его влиянии в концентрации 1 мг/мл увеличивался почти в 4 раза. Однако бихол не предотвращал дестабилизирующего действия Н202. Можно предположить, что бихол и пероксид водорода имеют разные механизмы воздействия на барьерную функцию мембраны изолированной вакуоли. 4.4. Сравнительный анализ влияния биологически активных веществ на стабильность мембраны изолированной вакуоли Как видно из представленных данных по влиянию биологически активных веществ на барьерную функцию тонопласта (рис. 12-24), стабильность изолированных вакуолей в контроле несколько варьирует.
Причина этому может заключаться в гетерогенности суспензии изолированных вакуолей. Поскольку наши опыты были направлены на выявление мембранотропного эффекта и на определение его величины (т.е. не абсолютного, а относительного значения), важным в первую очередь явилось отношение Тт вакуолей при действии испытуемого соединения к Тщ вакуолей в контроле - Тщот„. Все исследованные вещества по характеру действия (и в зависимости от концентрации) можно разделить на три группы (рис. 25): 1-я группа — вещества, способствующие деструкции мембраны (столбцы 2-7), 2-я группа - вещества, не оказывающие заметного влияния на стабильность вакуолей (столбцы 8-13) и 3-я группа — вещества, стабилизирующие барьерные свойства мембраны (столбцы 14-17). Итак, как видим, разрушению мембраны способствовали Н2О2, глутатион окисленный, ДМСО в высоких концентрациях. Механизм действия указанных веществ, как мы предполагаем, основан на стрессовой дестабилизации липидного матрикса мембраны и связан с процессами перекисного окисления липидов (ПОЛ) или ослаблением молекулярных взаимодействий в матриксе при встраивании в него молекул неполярного органического растворителя (как, например, в случае с ДМСО). Протекторное действие на стабильность вакуолярных мембран, как видно из рис. 25, оказывали вещества, относящиеся к классу антиоксидантов (ДМСО в низких концентрациях, дитиотреитол, глутатион восстановленный, ДГК). Антиоксиданты различной природы могут замедлять и прерывать процессы ПОЛ и тем самым повышать стабильность изолированных вакуолей. Такой механизм отчетливо проявлялся в экспериментах с совместным использованием в опытах Н2О2 (вещества, приводящего к ускорению перекисного окисления липидов) и антиоксидантов, ингибирующих этот процесс. Наиболее сильное протекторное действие на тонопласт оказывал дигидрокверцетин. Период полураспада фракции изолированных вакуолей при его действии в концентрации 1 мг/мл увеличивался в 7,5 раза. В то же время не для всех нами испытанных новых биологически активных соединений (амбиол, фон к и бихол) было выявлено протекторное действие на изолированные вакуоли.
