Содержание к диссертации
I. ВВЕДЕНИЕ 5
ПЛАН ДИССЕРТАЦИИ 7
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
A. Биологическая роль и биохимические свойства GFP. Строение GFP и GFP-подобных
БЕЛКОВ.СВОЙСТВА ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ GFP 8
Биологическая роль GFP 8
Биохимические свойства GFP 9
Пространственная организация GFP 9
Формирование хромофора GFP 13
Спектральные свойства 14
B. МУТАГЕНЕЗ GFP 15
/. Мутации, меняющие структуру хромофора 15
Мутации, изменяющие соотношение пиков возбуждения хромофора GFP.Желтый флюоресцентный белок YFP 18
Созревание белка 22
Вставки чужеродных последовательностей 24
Заключение 25
C. GFP-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ИЗ ИЕБИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ОРГАНИЗМОВ КЛ-ANTHOZOA 26
/. Флюоресцентные GFP-подобные белки 26
2. Нефлюоресцентные гомологи GFP 26
D. Свойства GFP-подобных белков небиолюминесцентных организмов 27
/. Первичная структура гомологов GFP небиолюминесцентных организмов. Сравнительный
анализ первичных структур GFP и гомологов 27
Цветовое разнообразие GFP-подобных белков 27
Тетрамеризация GFP-подобных белков wi.Anthozoa. Тетрамеризация DsRed. 31
E. Направленные изменения свойств GFP-подобных белков. Красные белки кл. Anthozoa.34
Решение проблемы тетрамеризации для красных белков 34
Решение проблемы неспецифической агрегации 37
F. Направленные изменения свойств GFP-подобных белков. Цветные белки 39
/. Получение флюоресцентных белков на основе цветных GFP-подобных белков 39
2. Получение белков, флюоресцирующих в дальней красной области 41
G. Перспективы развития 42
III. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 43
A. Введение 43
B. Направления эволюционных изменений в группе GFP-подобных белков 44
C. Получение белков с измененными спектральными свойствами 48
1. Цветовые переходы между различными группами GFP-подобных белков. Переход между
группами желтых и зеленых флюоресцентных белков 49
Взаимные переходы между группами флюоресцентных и нефлюоресцентных белков 52
Заключение 62
D. Метод гетероолигомерных меток 63
1. Предпосылки к созданию метода гетероолигомерных меток. Общая схема метода
гетероолигомерных меток 63
Получение нефлюоресцентного варианта флюоресцентного белка 66
Меченые бета-актина 67
Характеризация гетероолигомеров in vitro 69
Мечение тубулин-связывающего белка Таи34 71
Создание бицистронного вектора на основе asulCP-NF. 72
Заключение. 72
IV. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ 74
A. Оборудование 74
B. Реактивы 74
C. Буферные растворы 75
D. Микробиологические среды 75
V. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 76
A. Амплификация ДНК 76
B. Мутагенез 76
C. Клонирование, наработка и очистка белков 76
D. Трансформация компетентных клеток Е. coli 76
E. Аналитическое и препаративное выделение плазмидной ДНК 77
F. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 77
G. Первичная оценка поведения мутантных белков 77
Н. Спектроскопия 78
I. Компьютерная обработка данных 78
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 79
ВЫВОДЫ 80
VIII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 81
IX. ПРИЛОЖЕНИЯ 89
Таблица соответствий остатков GFP DsRed по данным рентгеноструктурного анализа 89
Множественное выравнивание первичных структур некоторых известных GFP-подобных белков 9/
3. Таблица положений, подвергающихся положительному давлению отбора в группе
флюоресцентных белков твердых кораллов. Жирным шрифтом обозначены остатки,
подвергнутые исчерпывающему мутагенезу 92
Введение к работе
Первым белком, получившим распространение в качестве внутриклеточного маркера белковой локализации, стал GFP - зеленый флюоресцентный белок, выделенный из гидроидной медузы. В 1961 году, проводя исследования свойств люминесценции гидроидной медузы Aequorea victoria, О.Shimomura с удивлением обнаружил, что очищенная люцифераза гидроида - акварин -испускает синий свет, в то время как живой гидроид обладает способностью к свечению зеленым светом. Оказалось, что наряду с люциферазой, ткани медузы содержат также белок, способный к флюоресценции в зеленой области спектра и конверсии энергии люциферазной реакции в зеленое свечение. Хотя о присутствии флюоресцентных веществ в тканях животных было известно и ранее, GFP стал первым известным флюоресцентным агентом белковой природы [Shimomura et al.,1962]. Открытие люциферазы и GFP медузы Aequorea victoria произошло одновременно, но судьбы двух этих белков в биологии были весьма различными. Уже через несколько лет после обнаружения акварина, в 1967году, этот белок был использован как молекулярно-биологический инструмент в экспериментах с измерениями внутриклеточных концентраций ионов Са2+ [Ridgway et al.,1967]. Дальнейшее стремление к использованию акварина в качестве молекулярного зонда, чувствительного к локальной концентрации одного из наиболее важных внутриклеточных ионов стало причиной всестороннего изучения свойств данной люциферазы. По необходимости изучались и свойства GFP. В частности, структура хромофора GFP была расшифрована Shimomura в 1979г [Shimomura 1979]. Тем не менее, долгое время GFP изучался исключительно как компонент люциферазной системы, не имеющий практического значения. Триумф GFP начался в 1994 году, когда была показана способность данного белка к флюоресценции при экспрессии в клетках [Chalfie et al.,1994]. Первый химерный белок, несущий GFP в качестве ковалентно присоединенного флюоресцентного маркера, был создан лишь в 1995г [Marshall et al.,1995]. За последние 10 лет GFP превратился из необычного белка, составляющего предмет интереса нескольких лабораторий, в важнейший инструмент молекулярной биологии, медицины, клеточной биологии. GFP, обладающий
белковой природой, является самым удобным прижизненным маркером для слежения за белками в клетке. Способность к автокаталитической циклизации хромофора, устойчивость к воздействиям среды, нетоксичность для клеток, хорошие показатели яркости флюоресценции, наконец - прямая возможность получения химерных белков с GFP делают данный белок популярным орудием для исследований динамических клеточных процессов и перемещений отдельных молекул, развития организмов и онкологических процессов. Современные методы исследований, направленные на изучение многофакторных процессов, часто используют GFP в сочетании с другими маркерами или несколько форм GFP. Развитие таких методов было бы затруднено, если бы невозможно было «исправить» некоторые свойства GFP. В то же время управление свойствами GFP и получение желаемых вариантов требует всестороннего изучения структурно-функциональных зависимостей строения этой молекулы.
