Введение к работе
Актуальность проблемы. Горизонтальный перенос генов (ГПГ) является предметом глубокого интереса широкого круга дисциплин, начиная с исследований устойчивости к антибиотикам, заканчивая генетически модифицированными организмами. ГПГ происходит экстенсивно в пределах прокариотических организмов, и его экологические и эволюционные эффекты хорошо документированы (Koonin et al. 2001). Сравнительный анализ геномов бактерий, архей и эукариот показывают, что значительная часть генов в прокариотических геномах подвержена горизонтальному переносу.
Фиксация и долгосрочное сохранение горизонтально перенесенных генов позволяет предположить, что они придают организмам селективные преимущества, такие как устойчивость к антибиотикам, вирулентность, или фиксация азота в организме реципиента (Koonin еt al., 2001; Gogarten и др., 2002; Richardson and Palmer, 2007). Практика показывает, что ГПГ между эукариотами является редким событием. ГПГ у высших растений включает в себя в первую очередь ДНК митохондрий или хлоропластов (Richardson и Palmer, 2007). Горизонтальный перенос ядерных генов между видами растений лишь слабо исследован. Редкие примеры переноса генов бактерий в ядерную ДНК многоклеточных эукариот касаются прежде всего грибов и животных, как реципиентов (Garcia-Vallve и др., 2000;. Rosewich и Kistler 2000; Screen, and St. Leger, 2000; Veronico и др., 2001;. Кондо и др. др. 2002;. Richards и др., 2006;. Акуна и др., 2012). Четко задокументированные примеры горизонтального переноса генов от прокариот к растениям долгое время были ограничены только Agrobacterium rhizogenes и видами Nicotiana (White et al., 1983;. Intrieri и Buiatti 2001).
Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes переносят Т-ДНК (фрагменты
большой плазмиды (Ti) или (Ri), соответственно) в хозяйские клетки (White et
al. 1982; Otten et al. 1992; Veena et al. 2003; Tzfira and Citovsky 2006; Vain 2007).
Экспрессия генов, закодированных в Т-ДНК отвечает за развитие опухолей или
косматых корней на растении. Эти новообразования представляют собой
трансгенные ткани на нетрансгенных растениях. Однако, у представителей рода
Nicotiana была обнаружена фиксации Т-ДНК вставки в геноме растения и ее
последующая передача в ряду половых поколений. Эта Т-ДНК была названа
клT-ДНК. Детальная характеристика клТ-ДНК показывает, что
присутствующие в ней гены экспрессируются, а вставка Т-ДНК в геномы Nicotiana могла происходить неоднократно и независимо. Эти факты наводят на мысль о том, что клТ-ДНК придавала растениям селективные преимущества в ходе эволюции. Выявление и детальное изучение новых примеров горизонтального переноса генов между агробактериями и растениями позволило бы сделать обобщение относительно возможной роли Т-ДНК в растениях.
Целью данной работы было изучение последовательностей ДНК,
гомологичных Т-ДНК агробактерий, приобретенных растениями в результате горизонтального переноса генов. В конкретные задачи входило:
- разработка научно-методических подходов для эффективного скрининга
видов растений на наличие в их геномах последовательностей, гомологичных
описанным в литературе, на примере онкогенов агробактерий;
- скрининг видов двудольных растений на наличие Т-ДНК подобных
последовательностей;
детальная характеристика структуры клТ-ДНК у Linaria vulgaris;
анализ распространения клТ-ДНК в различных видах рода Linariа;
сравнительный анализ морфогенетических процессов in vitro у видов Linaria и Nicotiana, контрастных по наличию клТ-ДНК.
Научная новизна. Впервые в результате целенаправленного поиска в ходе анализа 200 видов двудольных растений выявлен новый пример горизонтального переноса генов между агробактериями и растениям: у видов в пределах рода Linaria обнаружены Т-ДНК-подобные последовательности. Этот факт свидетельствует о том, что горизонтальный перенос генов от агробактерий к растениям является редким событием, но не уникален для представителей рода Nicotiana, как считалось ранее. Данное открытие стало возможным благодаря предложенному нами новому подходу, позволяющему эффективно скринировать образцы ДНК различного происхождения (в том числе ДНК растений) на предмет присутствия в них последовательностей, сходных с описанными ранее в литературе для других объектов. Подход основан на применении ПЦР в реальном времени с вырожденными праймерами и вырожденными зондами и сочетает в себе положительные стороны ПЦР и гибридизации ДНК-ДНК по Саузерну.
Впервые охарактеризована структура и предприняты попытки исследования
функций клТ-ДНК Linaria vulgaris. Показано, что клТ-ДНК организована как
несовершенный прямой повтор. Каждая копия в составе повтора имеет
протяженность более 10 тпо и содержит последовательности, гомологичные
агробактериальным генам ORF2, ORF3, ORF8, rolA, rolB, rolC, ORF13, ORF14,
mis, кроме того, левая копия содержит фрагмент гена acs. Консервативной
является последовательность гена rolC, совпадающая на 93% с
соответствующей последовательностью из штамма А4 A. rhizogenes (Acc. # X03433). Компьютерный анализ последовательности гена Lv rolC показывает, что он может кодировать полноразмерный белок.
Впервые проведено исследование распространения клТ-ДНК среди
представителей рода Linaria. По гомологии с Т-ДНК L. vulgaris обнаружены последовательности Т-ДНК в следующих видах рода Linaria: L. acutiloba, L. alpina, L. buriatica, L. debilis, L. hepatica, L.incompleta, L. melampyroides L. ruthenica , относящихся к секции Linaria, а также L. dalmatica, L. genistifolia, L. sabulosa, относящихся к cекции Speciosae. Показано, что виды рода Linaria,
содержащие Т-ДНК и относящиеся к двум секциям представляют собой монофилетическую группу.
Впервые проведено исследованиея морфогенеза in vitro растений рода Linaria
(у некоторых представителей которого нами показано наличие Т-ДНК в
геномах) по сравнению с представителями рода Nicotiana, у которых согласно
литературным данным присутствует Т-ДНК; обнаружено, что все
исследованные виды характеризуются высокой регенерационной способностью не зависимо от наличия Т-ДНК в геноме. Это свойство могло способствовать появлению трансгенных растений из трансформированных агробактерией тканей, в результате чего Т-ДНК получила возможность передаваться в ряду половых поколений.
Теоретическое и практическое значение работы.
Разработаны научно-методические подходы, позволяющие эффективно скринировать образцы ДНК различного происхождения на предмет присутствия в них последовательностей, сходных с описанными ранее (например, онкогенами агробактерий). На базе этих разработок могут быть созданы тест-системы для обнаружения патогенов, характеризующихся быстрым мутированием геномов (поскольку в этом случае также необходимо выявлять последовательности ДНК, гомологичные описанным ранее, но отличающиеся от них).
Разработан способ диагностики биоматериалов на наличие в них агробактерий (Патент на изобретение №: 2458142), который может быть применен в сельском хозяйстве, в частности, в плодоводстве и виноградарстве, для оценки заражения растений агробактериями).
Обнаружены новые доказательства в пользу горизонтального переноса генов между агробактериями и растениями, которые могут успокоить общественное мнение относительно биобезопасности трансгенных культур. Трансгенные растения природного происхождения имеют нормальную морфологию, за миллионы лет своего существования не оказали губительного действия на экосистемы, за тысячелетия использования людьми в качестве лекарственных трав (L. vulgaris) не оказывали негативного влияния на здоровье людей. Результаты диссертации используются на биолого-почвенном факультете СПбГУ в курсах лекций «Генная инженерия и биотехнология», «Генетика развития растений».
Основные положения выносимые на защиту:
Благодаря предложенному нами новому подходу, основанному на применении
ПЦР в реальном времени с вырожденными праймерами и вырожденными
зондами и позволяющему эффективно скринировать образцы ДНК растений на
предмет присутствия в них последовательностей, сходных с Т-ДНК
агробактерий, в ходе анализа 200 видов двудольных растений выявлен новый
пример горизонтального переноса генов между агробактериями и растениям: у
12 видов в пределах рода Linaria обнаружены Т-ДНК-подобные
последовательности.
Показано, что Т-ДНК Linaria vulgaris является полноразмерной и организована как несовершенный прямой повтор, в отличии от Т-ДНК в геноме Nicotiana, где около половины последовательности оказалось утерянной. По гомологии с L. vulgaris выявлены Т-ДНК-подобные последовательности в геномах/., acutiloba, L. alpina, L. bunatica, L. debilis, L. hepatwa, L.incompleta, L. melampyroides L. ruthenwa, относящихся к секции Unarm, а также L. dalmatica, L. genistifolia, L. sabulosa относящихся к секции Speciosae . Сайт интеграции Т-ДНК в геном растения совпадает у исследованных видов, что свидетельствует о монофилетическом происхождении данных секций рода Linaria. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конгрессах, конференциях, симпозиумах, совещаниях и школах: Международный конгресс по молекулярной биологии растений (Барселона, Испания, июнь, 2003 г.), XI конгресс MPMI (Санкт-Петербург, июль, 2003 г.); Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, ноябрь, 2003); III съезд ВОГиС (Москва, июн, 2004 г.); Международная конференция «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, (Москва, 2006 г.); Конференция «Современная биотехнология - защите окружающей среды» (Пущино, 2006 г.); Четвертый съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006 г.); Международная научная конференции «СП. Костычев и современная сельскохозяйственная микробиология» (Ялта, Украина, 2007 г.); AB-RMS симпозиум и PhD курс, (С-Петербург, 2007 г.) ; V Съезд Общества Биотехнологов России (Москва, 2008 г.); Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2009 г.); Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, 5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, июнь 2009 г.); Международная конференция "Растительная генетика, геномика, и биотехнология, Новосибирск (июнь, 2010 г.) ; XVIII Конгресс Федерации европейских обществ Биологии растений (FESPB) (Валенсия, Испания, июль, 2010 г.); Международная конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, октябрь, 2012); II(X) Международная Ботаническая Конференция молодых ученых в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, ноябрь 2012 г.); Международная школа-конференция «Растительно-микробные сообщества: молекулярные основы адаптивного потенциала» (Алушта, Украина, октябрь, 2012 г.); 33-я Международная конференция по корончатым галлам (Огайо, США, декабрь 2012 г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 печатные работы, из них 17 в ведущих международных и отечественных научных журналах, рекомендованных перечнем ВАК, 1 патент, 2 книги. Структура и объём работы. Диссертация изложена на 270 страницах, включая 48 рисунков, 13 таблиц, список литературы, содержащий 321 ссылку. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и выводов.
Похожие диссертации на Горизонтальный перенос генов между Agrobacterium spp. и высшими растениями
