Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние проблемы оценки биобезопасности трансгенных растений (Обзор литературы) 10
1.1. Понятие биобезопасности 10
1.2. Динамика распространения ГМ культур 17
1.3. Классификация рисков, сопряженных с ГМ растениями 20
1.4. Научные критерии и основания для оценки риска 23
1.5. Подходы к оценке риска культивирования ГМ культур 26
1.6. Основные экологические риски выращивания ГМ культур 35
1.7. Утечка генов от ГМ культур к диким сородичам 55
1.8. Краткая характеристика сои линии GTS 40-3-2 66
1.9. Биология, экология и распространения дикой сои 68
1.10. Испытания на биобезопасность 72
1.11. Цель и задачи исследования 76
Глава 2. Объект и методы исследования 77
2.1 Объект исследования 77
2.2 Методы исследования 78
Глава 3. Методологическая часть 85
3.1. Выделение ДНК из растительных объектов 85
3.2. Полимеразная цепная реакция 91
3.2.1. Подбор схемы выявления продуктов амплификации 94
3.2.2. Выбор и усовершенствование прибора для РТ-ПЦР 102
3.2.3. Выбор и обоснование мишени 108
3.2.4. Подбор праймеров 111
3.2.5. Подбор зондов 115
3.2.6. Программа амплификации 120
3.2.7. Состав реакционной смеси 123
3.2.8. Наши наблюдения и разработки 125
3.2.9 Настройка параметров расчета 126
3.2.10. Схемы проведения анализов 132
3.2.11. Интерпретация результатов и критерии достоверности 139
3.2.12. Защита от возможных контаминации (загрязнений) проб исследуемых объектов 141
3.2.13. Результаты адаптации и апробации методов 144
Глава 4. Экспериментальная часть 148
4.1. Изучение генетического разнообразия дикорастущей сои и степени ее родства с культурным видом 148
4.1.1. Морфологический и цитологический анализ 149
4.1.2. Генотипирование 150
4.1.3. Интерпретация результатов 15 6
4.1.4. Оценка способности G. soja к сорнячанию 157
4.2. Диагностика переноса генов к диким сородичам и оценка биобезопасности выращивания трансгенной гербицидоустойчивой сои в агроценозе 160
4.2.1. Оценка способности сои к перекрестному опылению 160
4.2.2. Оценка переноса генов при выращивании трансгенной гербицидоустойчивой сои в агроценозе 162
4.2.3. Обсуждение результатов 168
Выводы 170
Список литературы 172
Введение к работе
Трансгенная биотехнология - одна из самых передовых и стремительно развивающихся отраслей современной биоиндустрии и, в особенности, сельского хозяйства. Уже сейчас посевы трансгенных растений (ТР) занимают более 90 млн га, судя по всему, процесс расширения применения ТР будет нарастать. По прогнозам в 2007 г. площади под ТР могут вырасти до 100 млн га. На территории России ТР пока не выращиваются в промышленных масштабах. Согласно существующим в стране нормам перед выпуском в окружающую среду каждый трансгенный сорт должен пройти испытания на биобезопасность. Биобезопасность подразумевает отсутствие фактического или прогнозируемого нежелательного воздействия модифицированного организма в сравнении с исходным ^модифицированным организмом на окружающую среду.
ТР, полученные методами генной инженерии, несут новые гены, обладают новыми признаками, и представляют собой виды, не свойственные ни одной экосистеме планеты. Необходимость проведения оценки биобезопасности основывается на принципе предосторожности, который гласит, что: «отсутствие неоспоримых научных фактов не должно служить причиной отсрочки принятия мер для устранения или сведения к минимуму угрозы» (Конвенция о биологическом разнообразии, 1995). Оценка биобезопасности призвана помочь минимизировать потенциальный ущерб.
Вопросы взаимодействия и сосуществования ТР с традиционными сортами и их дикими сородичами мало изучены. Еще меньше исследовано влияние ТР на биоразнообразие и динамику популяций (Соколов и др., 2002).
Выявление и оценка экологических рисков, сопровождающих выпуск ТР в окружающую среду, позволит принять решение о допустимости или нежелательности возделывания ТР на территории России, а также
предусмотреть комплекс профилактических и защитных мер по контролю проблемы «утечки генов», что имеет важное экологическое значение.
Целью данной работы являлось изучение экологических рисков и оценка биобезопасности при выращивании гербицидоустойчивой сои в современных агроценозах с использованием оптимизированной системы экспресс диагностики.
В соответствие с поставленной целью были решены следующие задачи:
Адаптировать метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-PCR) для качественной и количественной оценки содержания рекомбинантной ДНК в растительном сырье для достоверной идентификации экологического риска утечки генов.
Создать набор эталонов и оптимизировать систему защиты от возможных контаминации (загрязнений) проб исследуемых объектов.
Провести полевые испытания на биобезопасность трансгенной гербицидоустойчивой сои, изучить влияние фитогенных факторов на взаимодействие ТР с дикими сородичами, а также влияние антропогенного фактора на появление устойчивости к гербициду раундап у диких сородичей сои.
Изучить специфику популяций диких сородичей культурной сои, выявить степень родства культурной и дикой сои и способность к гибридизации.
Оценить экологические условия и биобезопасность при выращивании трансгенной гербицидоустойчивой сои в агроценозе.
Научная новизна работы заключается в разработке методов экспресс диагностики качественного и количественного содержания рекомбинантной ДНК в растительном материале, обеспечивающих оптимизацию процесса при проведении исследования и интерпретации данных. В рамках выполнения работы проведены экологические и геоботанические исследования популяций дикой сои в Дальневосточном регионе России и
выявлена степень родства культурной и дикой сои путем генотипирования. Впервые изучена способность трансгенной гербицидоустойчивой сои к гибридизации с дикими сородичами и показана вероятность нарушения биоразнообразия в естественных местообитаниях популяций дикой сои в случае выращивания трансгенной сои.
Методологическая часть работы проводилась в рамках разработки государственной системы диагностики генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в различных объектах. В настоящее время усовершенствованные в ходе выполнения работы методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (МУК 4.2.1902-04, МУК 4.2.1913-04).
Полученные данные о генетической структуре природных популяций дикой сои могут быть использованы в селекционной работе, для создания новых нетрансгенных сортов сои с широким спектром адаптации к экологическим факторам среды.
Изучение взаимодействий ТР сои с дикими сородичами в агроценозе являлось частью масштабной работы по научно обоснованной оценке биобезопасности выращивания ТР на территории России и послужит источником объективного материала для экспертов, принимающих решение о регистрации трансгенных сортов в Российской Федерации для промышленного выращивания.
Объектом нашего исследования стала генетически модифицированная соя линии GTS 40-3-2 (Monsanto Company) устойчивая к гербициду глифосату. Трансгенная соя получена в результате вставки в геном культурной сои (Glycine max) гена кодирующего растительный фермент 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазу (EPSPS) почвенной бактерии
Agrobacterium tumefaciens. Район проведения испытаний на биобезопасность - Дальневосточный регион РФ, Амурская область, Приморский край.
Разработку системы экспресс диагностики качественного и количественного содержания рекомбинантной ДНК в растительном сырье проводили на основе метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (Holland etal, 1991)
Исследования генетической структуры популяций дикорастущих предков ТР сои, собранных в центре их видообразования в Дальневосточном регионе России, проводились методами кариотипического (Palmer R.G., Heer Н., 1973) и молекулярного анализов (Дорохов Д.Б., Клоке Э, 1996).
Полевой агроэкологический опыт по скрещиванию между двумя видами сои (дикорастущей Glycine Soja и культурной генетически модифицированной сои устойчивой к гербициду Раундап) проводился совместно с ВНИИСБ и Центром «Биоинженерия» РАН в условиях свободного переопыления на экспериментальных участках Института сои ДВО РАСХН. Согласно схеме эксперимента растения размещались так, что каждый рядок генетически модифицированной сои чередовался с рядком дикой сои, т.е. создавались оптимальные условия для перекрестного опыления. Для анализа отбирались семена, а также вегетативные части растений дикой сои методами сплошного и случайного рендомизированного отбора (Доспехов Б.А., 1985) с последующим формированием средних проб (ГОСТ 13586.3) по вариантам. Образцы подвергали лабораторному анализу разработанным методом экспресс диагностики на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени.
На второй год эксперимента дополнительно проводился опыт по высеву урожая семян дикой сои, собранного с опытных делянок. Для контроля фитогенных взаимодействий в опытном агроценозе осуществлялась обработка этих посевов 2% раствором гербицида раундап (360 г/л глифосата)
в фазу 3-4 хорошо развитых листьев. Через две недели после начала обработки оценивался процент гибели растений.
Результаты исследований представлялись на IV молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии (2004), на научно-практической конференции «Решение экологических проблем при производстве сельскохозяйственной продукции» Белгородской государственной сельскохозяйственной академии (Белгород, 2004), на ежегодных декабрьских научных конференциях Российского государственного аграрного университета - МСХА им. К.А Тимирязева (2004, 2005), на международной научной конференции молодых ученых, посвященной 140-летию МСХА им. К.А. Тимирязева «Молодые ученые - аграрной науке» (2005), на заседаниях кафедры экологии и факультета агрохимии, почвоведения и экологии Российского государственного аграрного университета - МСХА им. К.А. Тимирязева (2003-2006). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Автор глубоко благодарна своему научному руководителю - доценту Вячеславу Андреевичу Раскатову, а также Владимиру Глебовичу Лунину за методическую помощь и постоянную поддержку при выполнении настоящей диссертационной работы. Автор также признательна академику РАСХН B.C. Шевелухе, профессорам Е.А. Калашниковой и Н.Б. Прониной, Д.Б. Дорохову, Е.Ю. Сорокиной и СВ. Боровской за консультации и критические замечания.
Динамика распространения ГМ культур
Другим важным вопросом является гербицидная нагрузка на окружающую среду. Необходимо провести сравнение использования гербицидов на устойчивом трансгенном сорте с тем коктейлем гербицидов, который используется на традиционных сортах. В случае глюфосината и глифосата нагрузка на окружающую среду меньше, чем от гербицидов, которые сейчас используются в поле на неустойчивых к гербицидам сплошного действия сортам. Внедрение трансгенных сортов будет сопровождаться уменьшением количества внесенных гербицидов на единицу площади и в связи с этим использование трансгенов может считаться определенным преимуществом. Уменьшение разрушения окружающей среды также дает время для создания еще более качественных и менее вредоносных методов контроля сорняков.
Необходимо проводить исследования по перекрестному опылению. Ясно, что трансгенные сорта при определенных условиях могут переопыляться. Предвидение эффекта переопыления является также очень важной задачей. Как и в случае первичной трансформации, предвидение экологического эффекта от опыления пыльцой трансгенного сорта зависит от селективных преимуществ даваемых чужеродным геном. Современные трансгенные продукты, впрочем, как и любые другие, могут взаимодействовать с любым поедающим их организмом и воздействовать различным образом на экологию, растения и диких животных. Пока не ясно, каким образом могут влиять закодированные трансгеном белки на вкус или привлекательность трансгенных растений для насекомых опылителей (Гончаров, 2001).
Способность к переопылению дикорастущих форм зависит от ряда факторов биологии цветения, возможности скрещивания между внутривидовыми популяциями, разновидностями и видами, влиянием условий окружающей среды во время цветения и расстоянием между растениям.
Токсикологические вопросы концентрируются на пищевой и кормовой безопасности: современные трансгенные продукты могут сделать культуру реципиент непригодной для потребления человеком или животными или для промышленной переработки. Культура может стать токсичной или приводить к аллергическим реакциям, которые не наблюдались у нетрансформированного родительского растения. Нас интересует ферментная активность белка в растении в течение его роста и развития, уборки, хранения или переработки с точки зрения потребления и переработки его в пищеварительном тракте. Также необходимо принимать в расчет возможное получение нежелательных вторичных метаболитов. Кроме того, сам белок или продукты его разрушения могут проявлять токсичность или аллергенность. Современные знания не дают возможности заранее определить аллергенность или не аллергенность данного белка. Оценка частных характеристик такого белка основывается на более общих критериях (количество, относительная стабильность, гомологичность с известными аллергенами и т.п.) и наибольшем количестве доступных данных. Как лучше оценивать токсикологические характеристики также является вопросом для обсуждения. Необходимы новые методы и критерии оценки. Так как изменения в растении, производимые генетической инженерией относительно малы, такие растения являются исключительно удобным объектом для разработки таких новых методов. Вопрос: должны ли трансгенные растения являться объектом более подробных исследований, чем сорта полученные методами традиционной селекции. Важным для решения данного вопроса является, например, наличие в природной среде и поглощение потребителем белков, закодированных введенным трансгеном.
Если изменения в растении касаются его взаимодействия с субстратом, то встает дополнительный вопрос о необходимости оценки взаимодействия с субстратом. Например, устойчивые к гербициду трансгенные растения опрыскивают гербицидом. Это означает, что также должен оцениваться сам гербицид, все продукты его деградации и метаболиты, образовавшиеся под его влиянием. Данные токсикологии метаболитов, образовавшихся под влиянием продуктов деградации гербицида, должны изучаться более внимательно. Сейчас не всегда ясно как могут повлиять продукты метаболизма гербицида на потребителей. Нужно выяснить возможность поражения и его возможные последствия (Гончаров, 2001).
Плейотропный эффект трансгенов еще более труден для оценки. Имеющиеся трансгены или их продукты и метаболиты могут непредсказуемым путем взаимодействовать и проявляться в любых экологических или токсикологических характеристиках культуры. Несомненно такой эффект может проявляться, но так как он является непредсказуемым, то он очень труден для оценки безопасности и регулирования. Неясно как такой эффект может быть измерен, как можно определить его достоверность и является ли вообще этот эффект негативным. Основываясь на общих расчетах взаимодействия экосистем и потребителей, мы можем считать этот эффект менее важным, чем вопросы экологии и токсичности, но могут быть и противоположные мнения.
Объект исследования
Объектом нашего исследования стала генетически модифицированная соя GTS 40-3-2 (Stine 2254 RR - Monsanto Company) устойчивая к гербициду глифосату. Трансгенная соя получена в результате вставки в растительный геном культурной сои гена кодирующего фермент синтетазу (EPSPS) почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. Выбор объекта объясняется следующими причинами:
Генетически модифицированная соя, устойчивая к глифосату, на сегодняшний день одно из самых востребованных трансгенных растений. Использование ее на засоренных сорняками полях не только дает прибавку урожайности (до 40 %), но и уменьшает количество вносимого гербицида, снижает затраты на культивирование почвы, потери воды. Эти особенности ее агротехники обеспечивают производителям большую прибыль и имеют природоохранный характер. Устойчивая к гербицидам соя пока по-прежнему остается доминирующей среди трансгенных сельскохозяйственных культур в восьми странах мира: США, Аргентине, Бразилии, Канаде, Мексике, Румынии, Уругвае и Южной Африке.
Перечисленные обстоятельства наряду с намерениями оригинаторов этого объекта зарегистрировать его для выращивания на территории РФ делают генетически модифицированную сою, устойчивую к гербициду глифосату актуальным объектом для исследования.
Район проведения испытаний на биобезопасность - Дальневосточный регион РФ, Амурская область, Приморский край. Выбор района объясняется следующими причинами:
Дальний Восток - один из основных районов в нашей стране, где возделывается культурная соя (Giycine soja) и единственный регион, где встречается дикорастущая соя. Дальневосточный регион является центром происхождения вида и поэтому риски «утечки» признака гербицидоустойчивости в природные популяции сои представляют наибольшую потенциальную опасность с точки зрения сохранения биоразнообразия. Дикая уссурийская соя G soja, считается родоначальницей или, по крайней мере, одной из родоначальниц или ближайшей родственницей культурной сои G. max (Скворцов, 1927, Комаров, 1958).
Экологические условия выращивания: почва лугово-черноземовидная, с гумусовым горизонтом мощностью до 30 см и содержанием гумуса 5%, климат резко-континентальный с чертами муссонности, годовое количество осадков 550 мм.
Выделение ДНК из растительных объектов
Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией проводят дифференциальный анализ кривой плавления. Такой способ визуализации полученных данных гораздо удобнее для понимания и анализа.
Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I. При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами (Taq-man assay, beacons) возможно различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к изменениям в графике кривой плавления. Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована.
Известно, что использование ДНК-зондов в том или ином варианте является наиболее предпочтительным в свете повышения специфичности анализа. Однако к недостаткам зондов относится высокая стоимость, что делает работу по подбору зондов, праймеров и условий амплификации дорогостоящей. Вместе с тем, использование интеркалирующих агентов является очень простым и дешевым. Отпадает необходимость подбора специальных праймеров, зондов, так как можно пользоваться уже используемыми праймерами, эффективность работы которых уже проверена. Эти обстоятельства делают применение интеркалирующих агентов весьма привлекательным.
Поскольку технологии Molecular beacons и LightCycler весьма дорогостоящие, их имеет смысл применять лишь в том случае, когда требуется крайне специфичная детекция лишь одного из образующихся PCR-продуктов. В нашем случае этого не требуется, поэтому технологии Molecular beacons и LightCycler были исключены из списка подбираемых схем. Для облегчения окончательного выбора способа детектирования продуктов ПЦР проведено сравнение методик SYBR Green и TaqMan (табл. 1).
В результате проведения опытов нами выбрано сочетание интеркалирующего агента SYBR Green с специфичными для обнаруживаемых последовательностей ДНК-зондами, которые дополняют друг друга при построении графиков накопления продуктов ПЦР. Было установлено, что SYBR Green хорошо работает до значения порогового цикла около С(Т) = 35-37, затем точность начинает падать. TaqMan также необходим, поскольку при количественном определении растительной рекомбинантной ДНК требуется проконтролировать в одной пробирке образование нескольких PCR-продуктов.
