Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Особенности биологии аэробных метилотрофных бактерий 11
Глава 2. Ассоциации аэробных метилотрофов с растениями
2.1. Ассоциация аэробных метилобактерий с растениями 24
2.2. Ассоциация аэробных метанотрофных бактерий с растениями 26
2.3. Влияние метилотрофных бактерий на рост и развитие растений in vivo 31
2.4. Метилотрофные бактерии и азотный метаболизм растений 32
Глава 3. Фитогормоны и другие биоактивные соединения 34
3.1. Цитокинины 35
3.2. Ауксины 40
3.3. Витамин В12 45
3.4. Экзополисахариды 47
3.5. Осмопротекторы 48
Глава 4. Материалы методы 50
4.1. Объекты исследования 50
4.2. Культивирование бактерий 50
4.3. Выделение накопительных и чистых культур метилотрофных бактерий 53
4.4. Электронная микроскопия 54
4.5. Изучение физиолого-биохимических свойств 54
4.6. Определение активности ферментов 54
4.7. Аналитические методы 61
4.7.1. Определение фосфолипидного состава клеток 61
4.7.2. Анализ жирных кислот 62
4.7.3. Определение убихинонов 62
4.8. Выделение и идентификация фитогормонов 62
4.8.1. Экстракция цитокининов и ауксинов 62
4.8.2. Идентификация цитокининов 63
4.8.3. Идентификация ауксинов 64
4.9. Определение содержания витамина Віг 65
4.9.1. Культивирование Е. coli - 113-3 65
4.9.2. Экстракция витамина Вп из клеток 66
4.9.3. Анализ экстрактов на наличие витамина В^ 66
4.10. Молекулярно-генетические методы 66
4.10.1. Выделение ДНК 61
4.10.2. Выделение РНК 67
4.10.3. ПЦР-амплификация и секвенирование гена 16S рРНК 67
4.10.4. ПЦР-амплификация тотальной ДНК накопительных культур метанотрофов 68
4.10.5. ПЦР-амплификация ipt гена 69
4.10.6. Синтез первой цепи кДНК 70
4.10.7. ДНК-ДНК гибридизация 70
4.11. Влияние метилотрофов на рост и морфогенез растений in vitro 70
4.11.1. Растительный материал 70
4.11.2. Среды и растворы 71
4.11.3. Культивирование растений 71
4.11.4, Регенерация растений 72
4.11.5, Инокуляция растений метанотрофами и метилобактериями 72
4.11.6, Анализ растительного материала 73
Глава 5. Биоразнообразие метилотрофных бактерий 76
5.1. Аэробные метилотрофные бактерии, ассоциированные с растениями 76
5.2. Филогенетический анализ метилотрофных изолятов 85
5.3. Локализация аэробных метилотрофных бактерий на/в растительных тканях 87
Глава 6. Идентификация метилотрофов 90
6.1. Морфология и ультраструктура 90
6.2. Культуральные и физиолого-биохимические свойства 90
6.3. Метаболическая характеристика 91
6.4. Состав убихинонов, фосфолипидов и жирных кислот 94
6.5. Генотипические свойства 95
6.6. Таксономическое положение новых изолятов метилобактерий 96
Глава 7. Влияние метилотрофов на рост, морфогенез и регенерацию растений, культивируемых in vitro 98
7.1. Влияние метилобактерий и метанотрофов на прорастание семян льна долгунца и табака in vitro 98
7.2. Влияние метилобактерий и метанотрофов на рост и морфогенез табака и картофеля in vitro 99
7.3. Влияние метилобактерий и метанотрофов на регенерацию табака и льна долгунца in vitro 104
7.4. Влияние метилобактерий и метанотрофов на регенерацию и морфогенез пшеницы in vitro 106
Глава 8. Способность метилотрофов к синтезу фитогормонов и витамина В12 112
8.1. Образование цитокининов 112
8.2. Синтез ауксинов 120
8.3. Образование витамина В 132
Заключение 134
Выводы 136
Литература 137
- Ассоциация аэробных метанотрофных бактерий с растениями
- Определение активности ферментов
- Метаболическая характеристика
- Влияние метилобактерий и метанотрофов на рост и морфогенез табака и картофеля in vitro
Введение к работе
В связи с этим логично было предположить, что аэробные метилотрофы, использующие С] соединения, присутствуют в филлосфере и ризосфере, успешно конкурируя с другими микроорганизмами. Более того, нами было постулировано, что аэробные метилотрофные бактерии не просто колонизуют растения, а являются фитосимбионтами. Однако экспериментальные данные о взаимосвязи аэробных метилотрофпых бактерий с растениями до начала нашей работы были весьма фрагментарными и ограничивались розовоокрашеными представителями рода Methylobacterium (Holland, 1997).
Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью нашей работы было определение таксономического и метаболического разнообразия аэробных метилотрофов, ассоциированных с растениями, а также изучение физиолого-биохимических основ их взаимодействия. Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:
Выделить чистые культуры метилотрофных бактерий из различных образцов растений и определить их таксономическое положение.
Оценить влияние аэробных метилотрофных бактерий на рост, морфогенез и регенерацию гнотобиотических растений in vitro.
Определить способность аэробных метилотрофных бактерий синтезировать биоактивные вещества - витамин Bi2 и фитогормоны различных классов - цитокинины и ауксины.
Научная новизна работы. Выявлено таксономическое разнообразие аэробных метилотрофных бактерий, ассоциированных с растениями. Впервые показано, что наряду с представителями рода Methylobacterium с растениями ассоциированы также представители родов Melhylovorus, Paracoccus, Xanthobacter, Methylophaga, Methylocystis, Methylococcus. Электронно-микроскопические исследования показали наличие метилотрофов внутри тканей колонизованных растений, культивируемых in vitro. Установлено, что метилотрофы постоянно ассоциированы с растениями и колонизация филлосферы хвойных и лиственных пород деревьев весной обусловлена развитием метилотрофных бактерий, перезимовавших внутри растительных тканей. Выделены и охарактеризованы метилотрофные изоляты, отнесенные к новому таксону Schlegelia plantiphila gen. nov., sp. nov. Впервые показана стимуляция метилобактериями и метанотрофами роста, морфогенеза и регенерации гнотобиотических растений табака, картофеля, льна и пшеницы, культивируемых in vitro.
Впервые установлена способность метанотрофов и метилобактерий различного таксономического положения синтезировать и поставлять растениям фитогормоны -
ауксины (от 5 до 120 мкг/мл) и цитокинины (10-50 нг/л), а также витамин Ві2 (до 800 нг/л). Обнаружено, что в геноме метилотрофов содержатся участки, гомологичные последовательностям гена синтеза цитокининов de novo. Установлено, что индолил-3-уксусная кислота синтезируется через индолил-3-пировиноградную кислоту.
Научно-практическое значение. Показано, что аэробные метилотрофные бактерии являются фитосимбионтами. Изучение взаимодействия аэробных метилотрофных бактерий с растениями значительно расширяет и углубляет знания об основах симбиоза метилотрофов с растениями, что позволяет оценить их экологический и биотехнологический потенциал, а также разработать новые способы/методы повышения продуктивности сельскохозяйственных культур с использованием аэробных метилотрофных бактерий или их метаболитов.
Облигатные метилотрофы не патогенны для человека, животных и растений и не развиваются на твердых средах, используемых для культивирования растений in vitro. В связи с этим они перспективны для разработки новых биотехнологий культивирования трансгенных растений, микроразмножения и регенерации гнотобиотических растений in vitro, с последующей адаптацией к условиям открытого грунта, адаптации растений в замкнутых экосистемах, в том числе на космических кораблях. Результаты работы послужили основой для создания нового бактериального стимулятора роста растений -«метилобактерина».
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференциях молодых ученых г. Пущино (1999, 2002), Всероссийской школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на V чтениях, посвященных памяти акад. Ю.А. Овчинникова «Биоорганика-2000» (Москва-Пущино, 2000), на II Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), на международной конференции памяти акад. Е.Н.Кондратьевой "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 2000), на международной конференции VAAM (Геттинген, Германия, 2002), на FEMS Congress of European Microbiologists (Любляна, Словения, 2003), на Международных Путинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2003, 2004, 2005), на региональной конференции молодых ученых (Саратов, 2004), Гордоновской конференции "Molecular Basis of Microbial CI Metabolism" (Mount Holyoke, США, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей и 13 тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 164 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 345 ссылок, содержит 21 таблицу и 32 рисунка.
Благодарности. Автор искренне признателен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Каляевой М.А., к.б.н. Захарченко Н.С, Алексеевой В.В., д.б.н., проф. Бурьянову Я.И., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Ламану А.Г., к.б.н. Шепеляковской А.Ю., к.б.н. Хмелениной В.Н., к.х.н. Шляпникову М.Г., Баскунову Б.П., к.б.н. Семеновой Г.А., к.б.н. Ивановой Е.П., к.б.н. Мордуховой Е.А., д.б.н. Рыжковой Е.П., а также всем сотрудникам лаборатории радиоактивных изотопов.
Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям д.б.н. Дорониной Н.В. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Особенности биологии аэробных метилотрофных бактерий
Аэробные метилотрофные бактерии используют метан (метанотрофы) и его окисленные или замещенные производные (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии. Факультативные . метилотрофы используют наряду с одноуглеродными различные полиуглеродные соединения, облигатные метилотрофы используют только Сі-соединения, тогда как ограниченно-факультативные могут расти только на одном или нескольких полиуглеродных субстратах (Antony, 1982).
Аэробные метилобактерии - экологически и таксономически гетерогенная
физиологическая группа класса Proteobacteria. Впервые бактерии, способные к
аэробному росту на метаноле как единственном источнике углерода и энергии, были
выделены Loew в 1892 г. и названы Bacillus methylicus. С этого времени и до начала
1960-х годов были выделены только несколько штаммов метилотрофных
микроорганизмов. Начало систематическому изучению их биологии и метаболизма было
положено описанием розовоокрашенного метилотрофа Pseudomonas sp. AMI (Peel,
Quayle, 1961). К настоящему времени изучены сотни штаммов метилобактерий,
проявляющих поразительное таксономическое, экофизиологическое и
цитобиохимическое разнообразие.
Аэробные метилобактерии представлены широким спектром морфотипов: палочковидные, кокковидные, тетраэдральные, ветвящиеся, плеоморфные, прообразующие, делящиеся и почкующиеся, подвижные и неподвижные, бесцветные и имеющие каротиноидные пигменты. Могут иметь грамположительный или грамотрицательный тип клеточной стенки, среди них обнаружены гало-, термо- и ацидотолерантные формы. В соответствии с реализуемыми путями первичной Ci-ассимиляции (сериновый, рибулозомонофосфатный или рибулозобисфосфатный) аэробные метилобактерии условно разделены на 3 основные группы, хотя ряд метилобактерий может использовать эти пути одновременно (Arthrobacter globiformis).
К настоящему времени формально утверждены 11 новых родов грамотрицательных метилобактерий: Methylobacillus (Urakami, Komagata, 1986), Methylophilus (Jenkins et al.,1987), Methylovorus (Govorukhina, Trotsenko, 1991), Methylophaga (Janvier et al., 1985), Methylobacterium (Patt et al., 1976), Hyphomicrobium (Hirsch, 1989), Aminobacter (Urakami et al, 1992), Methylorhabdus (Doronina et al., 1995), Methylopila (Doronina et al., 1998), Methylarcula (Doronina et al., 2000) и Albibacter (Doronina et al., 2001). Кроме того, предложены два новых рода метилобактерий, использующих в качестве источника углерода и энергии метансульфоновую кислоту: Methylosulfonomonas и
Marinosulfonomonas (Holmes et al., 1997), но они пока не валидированы. Наряду с этим к метилотрофии способны представители ряда хорошо известных родов (Paraccocus, Xanthobacter, Arthrobacter, Bacillus, Mycobacterium и многих других).
Облигатные метанотрофные бактерии (метанотрофы) составляют физиологически и таксономически обособленную группу микроорганизмов, структурно-функционально адаптированных к использованию метана в качестве источника углерода и энергии. Первая наиболее удачная классификация метанотрофных бактерий была предложена Whittenbury с соавторами (1970). На основании морфофизиологических свойств более 100 штаммов метанотрофных бактерий были разделены на 2 группы (I и II тип) и 5 родов, объединенных в семейство Methylococcaceae: Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus (І тип); Methylocystis, Methylosinus (II тип). Представители I типа реализуют РМФ путь ассимиляции метана, тогда как у бактерий II типа функционирует сериновый путь. Особенности метаболизма бактерий родов Methylococcus и Methylocaldum (наличие ферментов РМФ-цикла, минорных серинового пути и цикла Кальвина, термотолерантность, а также повышенный Г+Ц состав ДНК), по сравнению с метанотрофами I типа, позволили выделить их в отдельную группу - X тип (Whittenbury and Krieg, 1984; Hanson and Hanson, 1996). Последующие попытки усовершенствовать классификацию облигатных метанотрофов с использованием широкого спектра дифференцирующих признаков (Гальченко и др., 1986) во многом подтвердили схему, предложенную Whittenbury с соавторами.
Исследования филогении метанотрофов на основании анализа последовательности генов 5S и 16S рДНК показали, что метанотрофы с сериновым путем образуют две группы внутри а-подкласса Proteobacteria. Метанотрофы I и X морфотипов образуют отдельную ветвь в у-подклассе Proteobacteria. В этот подкласс отнесены также не использующие метан метилотрофные бактерии рода Methylophaga, тогда как другие метилобактерии с РМФ-путем расположены в р-подклассе. Распределение метанотрофов между двумя группами протеобактерий создало определенные трудности при их классификации как представителей одного семейства. Поэтому Боуман с соавторами (Bowman et al., 1995) предложили включить в семейство Methylococcaceae только метанотрофных бактерий I и X типов. На основании результатов нумерического анализа более 120 фенотипических признаков в сочетании с данными ДНК-ДНК гибридизации 136 штаммов были объединены в три гомологичных кластера. Наряду с родами Methylomonas, Methylococcus, Methylobacter в семейство Methylococcaceae был включен род Methylomicrobium, объединивший непигментированные виды рода Methylobacter - М. agile, М. albus, М. pelagicus (Bowman et al., 1995). Позднее к ним были присоединены род термотолерантных
метанотрофов - Methylocaldum, (Bodrossy et al., 1997), род психрофильных метанотрофов -Methylosphaera (Bowman et al., 1997), а также род Methylosarcina, с двумя новыми видами М. fibrata и М. quisquiliarum, который отличается от других метанотрофов I типа по морфологии клеток, составу жирных кислот и по нуклеотидной последовательности гена мММО и 16S рДНК (Wise et al., 2001). Недавно описаны еще два новых рода и вида экстремофильных метанотрофов I типа: галофильный Methylohalobius crimeensis (Heyer et al., 2005) и термофильный Methylothermus thermalis (Tsubota et al., 2005).
Метанотрофы II типа сгруппированы в два рода Methylosinus и Methylocystis (Bowman et al., 1995), отнесенные в семейство Methylocystaceae (Bowman, 2005). Недавно предложены два новых рода ацидофильных метанотрофов II морфотипа Methylocella и Methylocapsa (Dedysh et al., 2000, 2002; Dunfield et al., 2003), которые объединены в семейство Beijerinckiaceae (Garrity et al., 2005).
Пути окисления Ci-соедиііений. Процессы окисления восстановленных Сі-
субстратов обеспечивают клетки энергией и восстановительными эквивалентами, а также
переводят эти субстраты в доступные формы для ассимиляции, т.е. формальдегид,
формиат и СОг (Рис. 1).
РМФ-путь
02 Н20 а
. / МДГ t ФАДГ ФДГ
Х||2 I I ^ PQQ PQQH2 НАД+ НАДН + Н* НАД* НАДН+НҐ
СН4 ^М^ | СН3ОН . нсно \/ > нсоон со,
НАДН + Н+ I 4г НАД+ J
I цикл
02 Н20 Сериновый путь Кальвина
рММО
Рис. 1.1. Схема окисления метана метанотрофами
Окисление метана метанотрофными бактериями. Первый этап биологического пути окисления метана катализируется метанмонооксигеназой (ММО), имеющей две формы: мембрансвязанную (мММО) и растворимую (рММО).
мММО выявлена у всех изученных метанотрофов, за исключением представителей рода Methylocella (Lieberman and Rosenzweig, 2004; Dedysh et al., 2000; Dunfield et al., 2003). Как правило, фермент локализован в ВЦМ, составляя до 60-80% тотальных мембранных белков (Nguyen et al., 1998). мММО - медьсодержащий белок. Гены, кодирующие мММО, организованы в оперон ртоСАВ, где ртоВ, ртоА и ртоС кодируют
полипептиды субъединиц а, р, у с молекулярными массами 46, 28 и 29 кДа, соответственно (Semrau et al, 1995). У Methylococcus capsulatus Bath и Methylosinus trichosporium ОВЗЬ обнаружены две практически идентичные копии этого оперона (различие составляет только 13 нуклеотидов из 3183) (Semrau et al., 1995), а у Methylococcus - еще третья копия гена ртоС (Stolyar et al., 1999), нуклеотидная последовательность которого отличается от последовательностей других двух аналогичных генов, входящих в состав оперона. Такая структура очень сходна с аналогичной структурой у нитрифицирующих бактерий, в геноме которых также содержится две копии генов, кодирующих аммониймонооксигеназу, атоСАВ и третья копия гена, аналогичного ртоС: атоС (Stein et al., 2000).
Для проявления активности мММО необходима медь (Prior and Dalton, 1985) и, как недавно было показано, ионы железа. Предполагается, что а и /?-субъединицы формируют активный центр, так как они взаимодействуют с суицидным субстратом — ацетиленом. Существует несколько гипотез строения активного центра, в состав которого входят как ионы меди, так и, предположительно, железа (Lieberman and Rosenzweig, 2004). Согласно одной из них, в молекуле фермента находятся два Cu-связываюших участка: А и Е, при этом А-сайт функционирует как активный центр мММО, а Е-сайт является переносчиком электронов (Takeguchi et al., 1999). Донорами электронов для очищенной ферментной системы служат аскорбат, дурохинол и метанол, но не НАД(Ф)Н. Мембранная ММО имеет высокое сродство к метану (Кт=1-2цМ) и кислороду (Кт=0.1цМ), но обладает узкой субстратной специфичностью, соокисляя лишь короткие алканы, алкены и метанол (Lieberman and Rosenzweig, 2004).
Растворимая ММО обнаружена у Methylococcus capsulatus, представителя X типа, большинства культур II типа, и двух метанотрофов I типа: Methylomonas methanica 68-1 (Koh et al., 1993), Methylomicrobium sp.NI (Fuse et al., 1998). pMMO соокисляет широкий спектр ароматических, гетероциклических, ациклических и галогенированных углеводородов (Grosse et al., 1999). Однако pMMO имеет более низкое сродство к метану (Кт= ЗиМ) и кислороду (Кт= 16.8 цМ). Кроме того, рММО функционирует только при низких концентрациях меди в среде (<0.8цМ), что делает затруднительным ее использование в целях биоремедиации, так как редко встречаются загрязненные экосистемы с низким содержанием меди (Lieberman and Rosenzweig, 2004).
pMMO — цитоплазматический ферментный комплекс, состоящий из трех компонентов: гидроксилазы, редуктазы и регуляторного белка В. Гидроксилазный компонент представляет собой олигомер (250 кДа), состоящий из трех субъединиц: аг-содержащей двуядерный негемовый железный центр (60 кДа), 02 (45 кДа) и уг (20 кДа)
(Lieberman and Rosenzweig, 2004). Редуктазный компонент (38.4 кДа) содержит ФАД и [РегБг] -кластер. Редуктаза акцептирует электроны от НАДН, перенося их на двухжелезный сайт гидроксилазы. Регуляторний компонент - 15.8 кДа белок В, не содержит простетической группы и кофактора, но связывается с гидроксилазным компонентом и необходим для эффективной работы pMMO (Smith et al., 2002).
Экспрессия pMMO определяется наличием меди в среде культивирования и регулируется на уровне транскрипции (Morton et al., 2000). Показано, что синтез рММО-специфичной мРНК происходит в условиях низкого соотношения Cu/биомасса (<0.25цМ Си ), а при концентрации меди >0.25 цМ уровни мРНК снижаются. Передача сигнала о репрессии транскрипции рММО осуществляется фосфорилированием и дефосфорилированием белков, контролирующих промоторную область фермента. Остается неясным, как ионы меди взаимодействуют с регуляторными белками (Csaki et al, 2003).
Окисление метанола. Метанол окисляется до формальдегида метанолдегидрогеназами (МДГ), различными у грамотрицательных и грамположительных метилобактерий. В литературе описаны классическая МДГ, МДГ в составе мультиферментного комплекса и НАД^-зависимая МДГ. Классическая НАД(Ф)+-независимая МДГ или первичная алкогольоксидаза, впервые найденная у Methylobacterium sp. М27 (Anthony, Zatman, 1964), состоит из двух а (60-67 кДа) и двух р (8.5 кДа) субъединиц, двух молекул пирролохинолинхинона (PQQ) и одного атома кальция (Anthony, 1992), характерна для большинства грамотрицательных метилотрофных бактерий. Этот фермент окисляет первичные спирты и формальдегид, активируется аммонием или метиламином, имеет оптимум рН около 9 и использует in vitro в качестве акцептора электронов феназинметосульфат (ФМС) или другие искусственные акцепторы, но не пиридиннуклеотиды; in vivo электроны передаются на цитохром с (Duine et al., 1979). Генетические исследования Methylobacterium extorquens AMI показали участие 25 генов в окислении метанола. Три из этих генов кодируют структурные белки: mxaF (1800 п.н) кодирует большую (a), a mxal (290 п.н.) - малую (Р) субъединицы МДГ, mxaG, кодирует цитохром cl - первичный акцептор переноса электронов от МДГ (McDonald and Murrell, 1997). В свою очередь, цитохром ct окисляется цитохромом сц (Anthony, 1986). Гены, кодирующие большую субъединицу МДГ (mxaF), клонированы и частично секвенированы у различных метилотрофных бактерий. Показано, что mxaF является одним из наиболее консервативных структурных генов у метилотрофных бактерий (Bastien et al., 1989). Относительно локализации МДГ имеются разноречивые данные.
МДГ из Methylomonas sp.A4 была обнаружена в ВЦМ (Fassel et al., 1992). Согласно Frank с соавторами (1993), МДГ и оба цитохрома локализованы в периплазме, что связано с токсичностью формальдегида - продукта реакции. Максимальное содержание МДГ в клетке может достигать 50% растворимого белка (Anthony, 1982).
У Pseudomonas esterovorus обнаружена неспецифическая алкогольоксидаза, окисляющая метанол согласно уравнению: СН3ОН+ 02->СН20 + Н2О2 (Rakov et al., 1990).
Из грамположительной термотолерантной метилобактерии Bacillus methanolicus СІ выделена и очищена до гомогенного состояния уникальная МДГ, проявляющая активность исключительно с НАД1" (Dijkhuzen, Arfman, 1990). Фермент состоит из 10 идентичных субъединиц (43 кДа), каждая из которых содержит по одному атому Zn+ в активном центре, два атома Mg+ и прочно связана (но не ковалентно) с НАДН (кофактором), который не высвобождается во время катализа. Кроме того, для активности требуется экзогенный НАД (кофермент) в качестве первичного акцептора электронов, а также белок-активатор, состоящий из двух субъединиц (27кДа) (Hektor et al., 2000). У других грамположительных метилобактерии - Amycolatopsis methanolica и Mycobacterium gastri окисление метанола катализирует метанол:Ы,>Г-диметил-4-нитрозоанилин оксидоредуктаза (MNO) (Bystrykh et al., 1997). Предполагали, что НАД+-зависимая МДГ связана с комплексом ферментов из PQQ-содержащей МДГ, НАД+-зависимой формальдегиддегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы, что делает весь процесс С\-окисления зависимым от НАД* (Duine et al., 1984). Дальнейшие исследования показали, что MNO (49 кДа) сходна с НАД-зависимой МДГ Bacillus methanolicus - также содержит ионы металлов (Zn+ и Mg+) и прочно связана (но не ковалентно) с НАДФН (кофактором), который не высвобождается во время катализа, однако НАД+ не является первичным акцептором электронов и не обнаружен белок-активатор. Вторым компонентом этого мультиферментного комплекса выступает высокомолекулярный белок (>650 кДа) из двух субъединиц по 44 и 72 кДа, обладающий НАДН дегидрогеназной активностью с дихлорфенол индофенол (ДХИФ) или 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенил-тетразолиевым бромидом (МТТ) вкачестве акцептора электронов. Третьим компонентом служит низкомолекулярный белок (15 кДа) со свойствами, сходными, но не идентичными НАД+-коферменту (Hektor et al., 2000).
Окисление метиламина. Метилобактерии родов Hyphomicrobium, Methylobacterium, Methylopila, Methylorhabdus, Paracoccus, Methylophaga, Methylobacillus и Methylophilus способны расти на средах с метиламином, который служит также источником азота. Факультативные метилобактерии Arthrobacter globiformis, Xanthobacter
aminooxidans и Methylarcula растут только на метиламине и очень слабо или вообще не используют метанол.
Метилобактерии осуществляют окислительные превращения метиламина посредством дегидрогеназы, аминоксидазы или системы ферментов N-метилглутаматного пути.
Дегидрогеназа метиламина обнаружена у бактерий родов Methylobacterium, Methylopila, Methylorhabdus, Blastobacter, Xanthobacter, Paracoccus, Methylobacillus и Methylophilus (Доронина, 1999). Аминдегидрогеназа отсутствует у клеток, выращенных на среде с метанолом или сукцинатом, а при пересеве бактерий на среду с метиламином активность фермента появляется раньше, чем начинается рост.
У различных штаммов Arthrobacter globiformis обнаружена аминоксидаза катализующая окисление метиламина до формальдегида и аммиака с образованием перекиси водорода: CH3NH2+ О2+Н2О -> СН2О + NH3 + Н2О2 (Логинова, Троценко, 1976)
Принципиально иные первичные механизмы использования метиламина обнаружены у метилобактерии родов Hyphomicrobium, Methylobacterium, Methylophaga и Methylarcula (Доронина, 1999). Показано, что использование этими бактериями 14С-метиламина связано с акцептированием молекул данного субстрата на глутамате и синтезом N-метилпроизводных: у- глутамилметиламида и N-метилглутамата. В экстрактах клеток исследуемых бактерий обнаружены активности N-метилглутаматсинтазы, у-глутамилметиламидсинтетазы и N-метилглутаматлиазы. С другой стороны, только у галофилов Methylophaga limanica, Methylarcula marina и Methylarcula terricola, обнаружена у-глутамилметиламидлиаза, обеспечивающая образование формальдегида и регенерацию глутамата. Ранее этот фермент был найден у неидентифицированного штамма морских бактерий рода Methylophaga sp. с РМФ-путем. Methylophaga limanica также реализует РМФ-путь, тогда как бактерии нового рода Methylarcula используют ицл" -сериновый цикл. Следовательно, для умеренно-галофильных метилобактерии, независимо от реализуемого пути Сі -метаболизма, характерно наличие у-глутамилметиламидлиазы. Таким образом, N-метилпроизводные глутамата являются переносчиками метальных групп в основные биосинтетические пути (сериновый или РМФ).
Формальдегид является центральным С і-метаболитом, поступающим в первичные биосинтетические пути ассимиляции (РМФ и сериновый) и подвергающимся дальнейшему окислению с целью получения энергии. Автотрофпые метилотрофы
окисляют Сі-соединения до СОг, который затем ассимилируется через классический РБФ путь (цикл Кальвина).
Прямое окисление формальдегида до формиата у метилотрофов катализируется тремя различными ферментами: НАД^-зависимой дегидрогеназой, требующей восстановленный глутатион (GSH) - обнаружена у Brevibacterium fuscum, Methylorhabdus multivorans, Angulomicrobium scandinavii и Paracoccus kondratjevae; НАД+-зависимой дегидрогеназой, не требующей GSH, которая обнаружена у большинства метилотрофов; дегидрогеназой, которая in vitro проявляет активность с 2,6-дихлорфенолиндофенолом (ДХФИФ) и ФМС, как акцепторами электронов, в соответствии с уравнением: СН20 + ДХФИФ + НгО -»НСООН + ДХФИФНг, присутствует практически у всех метилотрофных бактерий (Anthony, 1982).
Кроме того, у метанотрофов обнаружена гем-содержащая
(форм)альдегидцегидрогеназа, использующая in vitro в качестве акцепторов электронов ФМС и ДХФИФ (DiSpirito et al., 2001).
Циклическое окисление формальдегида до СОг, происходящее в диссимиляционном РМФ-цикле, не связано с участием дегидрогеназ формальдегида и формиата, а представляет собой последовательную цепь реакций, катализируемых синтазой и изомеразой З-гексулозо-6-фосфата, изомеразой фруктозо-6-фосфата, дегидрогеназами глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата. Последняя дегидрогеназа является декарбоксилирующей. В результате происходит образование СОг, 2 моль НАДФН и регенерация рибулозо-5-фосфата, первичного акцептора формальдегида (Соколов, Троценко, 1977). Метилобактерии с сериновым или РБФ- путями получают энергию посредством прямого окисления формальдегида до формиата и СОг. Напротив бактерии с РМФ-путем реализуют оба способа окисления формальдегида в разных соотношениях.
Тетрагидрофолатный (ТГФ) и тетрагидрометаноптериновый (ТГМПТ) пути. Наличие ЩФ-зависимых ферментов у "сериновых" бактерий позволило ряду авторов предположить участие ТГФ в качестве альтернативного механизма окисления формальдегида (Chistoserdova et al., 1998). Недавно у широкого спектра метило- и метанотрофных бактерий найдены гены и ферменты типичного для анаэробных архей метаболического пути - окисления формальдегида до СОг посредством N N -метилентетрагидрометаноптерин (Н4МПТ)-зависимых ферментов (Vorholt et al., 1998). Так, у Methylococcus capsulatus была найдена МАО(Ф)+ и метилентетрагидрометаноптерин зависимая активность ФАДГ (Adeosum et al., 2004).
Н4Ф-путь Метанол Н4МПТ-путь
СеринН4Фгидроксиметилтрансфераза МДГ
Серииовый цикл
= Метилен Н4Ф =3 НСОН р) Метилен Н4МПТ
МетиленН4Фдегидрогеназа
МетиленН4МПТдегидроеназа
НАД(Ф)Н<^
Метенил Н4МПТ
НАДФН Метенил НаФ
Метинил Н4Фциклогидролаза
Н2<>
н4мпт
Метинил Н4МПТциклогидролаза
Формил МФР:Н4МПТформилтрансфераза
Биосинтез пуринов
Формил Н4Фсинтетаза
Формил МФР
Формил МФРдегидрогеназа
ФДГД
нсоон
НАДН
Рис. 1.2. Схема тетрагидрофолатного и метаноптеринового путей у Methylobacterium extorquens AMI при росте на метаноле (Vorholt et al., 1998)
Функциональная роль ТГМПТ- и ТГФ-метаболических путей полностью не выяснена. Активности ферментов ТГМПТ-пути на порядок выше активностей ферментов ТГФ пути, что позволяет предположить его участие в окислении формальдегида, тогда как ТГФ-путь выполняет преимущественно процессы метилирования, в том числе метилирование глицина с образованием серина в сериновом пути (Pomper et al., 1999). Кроме того, оба пути участвуют в детоксикации образующегося формальдегида (Vorholt et al., 2002).
Окисление формиата - завершающая стадия цепи реакций прямого окисления. Известны три фермента, участвующие в окислении формиата до СОг:
Мембрансвязанная формиатоксидаза, использующая в качестве акцепторов электронов кислород и ФМС/ДХФИФ (Hopner, Trautwein,1971).
Формиатдегидрогеназа, также связанная с мембранами и проявляющая активность с ДХФИФ или цитохромом с (Deyhle, Barton, 1977).
НАД+-зависимая формиатдегидрогеназа, локализованная в растворимой фракции, наиболее распространена, однако имеет низкий уровень активности или вообще отсутствует у метилобактерий с РМФ-путем, у который преобладает циклическое окисление формальдегида до СОг (Johnson, Quayle, 1964). Фермент содержит негемовое железо (11-18 г-атом/моль белка) и неорганическую серу (15-20 моль/моль белка). ФДГ
обладает высокой субстратной специфичностью, высокими значения Кт к формиату и низкими к НАД+ (Yoch et al., 1990) и, как правило, активен в широком диапазоне рН (6.0-10). Активность ФДГ стимулируется добавлением флавинмононуклеотида (Кт для ФМН 0,015-0,03 цМ). Окисление формиата происходит согласно уравнению: НСООН + НАД+ ^С02 + НАДН + Н+.
Таким образом, в зависимости от вида бактерии и природы Сі-субстрата у аэробных метилотрофных бактерий реализуются различные механизмы первичного окисления. Общим продуктом первичного окисления восстановленных Сі-соединений является формальдегид, который непосредственно или после окисления до СОг вовлекается в основные биосинтетические пути.
Пути ассимиляции Сі-соединений. Известны три основных циклических пути, ответственных за биосинтез клеточных компонентов при росте бактерий на О соединениях, более восстановленных, чем СОг: рибулозомонофосфатный (РМФ), сериновый и рибулозобисфосфатный (РБФ).
РМФ путь является шунтированным вариантом цикла Кальвина, в котором синтез триозофосфата осуществляется из трех молекул формальдегида. Ключевые реакции цикла: фиксация формальдегида на рибулозо-5-фосфате с образованием З-гексулозо-6-фосфата, который далее изомеризуется во фруктозо-6-фосфат.
Специфические ферменты РМФ-цикла - гексулозофосфатсинтаза (ГФС) и фосфогексулоизомераза (ФГИ). Функции остальных реакций цикла заключаются в регенерации акцептора формальдегида (рибулозо-5-фосфата) из фруктозо-6-фосфата и триозофосфата с образованием фосфотриозы, идущей на биосинтез клеточных компонентов.
Существуют два варианта образования триозофосфатов: фруктозобисфосфатный (ФБФ-вариант, интермедиат - фруктозо-1,6-бисфосфат) и Энтнера-Дудорова (КДФГ-вариант, интермедиат - 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат). Перестройки пентозофосфатов идут также двумя способами: через трансальдолазу и транскетолазу или через седогептулозо-1,7-бисфосфатазу (СГБФ) и транскетолазу.
ФБФ-вариант, как правило, реализуется у факультативных метилобактерий, тогда как КДФГ-вариант характерен для облигатных и ограниченно-факультативных метилобактерий родов Methylophilus, Methylobacillus, Methylovorus и Methylophaga (Доронина, 1999). Грамположительные метилобактерий реализуют ФБФ-вариант РМФ-цикла. ФБФ-альдолазный-СГБФ-азный вариант обнаружен у ограниченно-факультативных метилотрофов типа "М", а также В. methanolicus (Colby, Zatman, 1975).
РМФ цикл ассимиляции углерода характерен для метанотрофов I и X типов, причем у метанотрофов триозофосфаты образуются одновременно через ФБФ и КДФГ.
Превращения синтезированных в РМФ - пути фосфотриоз приводят через ФЕП и пируват к образованию ацетил-КоА, который является стартовым материалом для биосинтеза органических кислот и далее - аминокислот.
Сериновый путь представляет собой циклическую цепь реакций, начинающихся с
образования серина из глицина и формальдегида. Основными в цикле являются четыре
реакции, катализируемые серин-глиоксилатаминотрансферазой (СГАТ),
оксипируватредуктазой (ОПР), глицераткиназой и малил-КоА-лиазой.
Регенерация глицина имеет циклический механизм. Непосредственным предшественником глицина служит глиоксилат, который образуется в результате распада малата до ацетил-КоА и глиоксилата. Последний, акцептируя аминогруппу серина, превращается в глицин, что приводит к замыканию цикла. Таким образом, итогом цикла является синтез ацетил-КоА из двух С і-единиц (формальдегида и СО2).
Важной проблемой серинового пути является превращение ацетил-КоА в Сз- и С4-соединения. У ряда факультативных метилотрофов с сериновым типом метаболизма ацетил-КоА окисляется в глиоксилат посредством реакций цитратного цикла с участием цитратсинтазы, аконитазы и изоцитратлиазы (ицл). Образующаяся при этом молекула глиоксилата также направляется в сериновый цикл. Этот вариант серинового пути получил название изоцитратлиазоположительного (ицл+) (Доронина, 1999).
Наряду с этим существует большая группа метилотрофов, лишенных изоцитратлиазы и реализующих ицл ~ вариант серинового пути, но не способных превращать ацетил-КоА посредством реакций глиоксилатного шунта. Лишь недавно было показано, что глиоксилат регенерирующий цикл у ицл " метилотрофов включает реакции гидроксибутиратного цикла, но детали этого пути требуют генетических и энзиматических доказательств. Ацетил-КоА окисляется до глиоксилата через этилмалонил-КоА, метилсукцинил-КоА, изобутирил-КоА, метакрилил-КоА и Р-гидроксиизобутирил-КоА посредством метилмоланил-КоА-мутазы, R-специфичной кротоназы, изобутирил-КоА-дегидрогеназы и ГТФазы (Korotkova et al., 2002).
Сериновый путь Сі-ассимиляции реализуют метилобактерии родов: Aminobacter, Hyphomicrobium, Methylobacterium, Methylopila, Methylorhabdus, Methylarcula и Methylosulphonomonas, а также метанотрофы II морфотипа.
РБФ - путь автотрофной ассимиляции СО2, встречается у метилобактерии реже, чем РМФ и сериновый пути, т.к. энергетически менее выгоден (Strom et al.,1974). РБФ-путь реализуют метилобактерии родов: Angulomicrobium, Blastobacter, Renobacter,
Ancylobacter, Paracoccus, Albibacter, Xanthobacter, Beijerinckia и метанотрофы Methylococcus capsulatus и представителей рода Methylocaldum.
Один из ключевых ферментов этого цикла - фосфорибулокиназа, катализирует реакцию фосфорилирования рибулозо-5-фосфата в рибулозо-1,5-бисфосфат. Другой ключевой фермант - рибулозобифосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РБФК), катализирует реакцию карбоксилирования и гидролитического расщепления рибулозо-1,5-бифосфата с образованием двух молекул 3-фосфоглицериновой кислоты, одна из которых далее восстанавливается в 3-фосфоглицеральдегид, а другая участвует в регенерации акцептора. РБФК из Мс. capsulatus имеет (ХбРб структуру, в отличие от других протеобактерий, которые имеют а$% структуру. Гены РБФК локализованы в одном опероне ebb: большая субъединица (48 кДа) кодируется cbbL; малая (14.5 кДа) cbbS. Экспрессия генов ebb оперона положительно регулируется на уровне транскрипции LysR-подобным белком CbbR (Baxter et al., 2002). Регенерация Ci-акцептора осуществляется двумя путями: при участии транскетолазы и трансальдолазы или траисальдолазы и СГБФазы.
Уровни фиксации СОг у метилотрофов значительно варьируют, что зависит от пути Сі-метаболизма и условий культивирования. Показано, что метилобактерии и метанотрофы с сериновым путем С і-метаболизма ассимилируют СОг гораздо активнее, чем метилотрофы с РМФ путем или метанотрофы X типа (Доронина, Троценко, 1984; Шишкина, Троценко, 1986). Отмечено, что СОг (0.5-1% в газовой фазе) на первых этапах ускоряет рост бактерий.
Центральный метаболизм. Между путями первичного и центрального метаболизма Сі-соединений у аэробных метилотрофных бактерий наблюдается определенная корреляция. Метилотрофы с сериновым путем имеют слабые активности ферментов катаболизма углеводов. Напротив, у метилотрофов с РМФ-путем эти ферменты играют существенную роль, т.к. участвуют в регенерации акцептора формальдегида и образовании НАД(Ф)Н.
Большинство факультативных метилотрофов обладает полным набором ферментов ЦТК, который при метилотрофном росте играет преимущественно биосинтетическую роль (Логинова, Троценко, 1979). Для многих облигатных и ограниченно-факультативных метилотрофов с РМФ - путем характерно отсутствие а-кетоглутаратдегидрогеназы и ферментов глиоксилатного шунта (Trotsenko et al., 1986), вследствие чего предполагается, что цитратный цикл у них разобщен и представляет собой две ветви, имеющие биосинтетическую направленность. Но секвенирование генома и анализ кодирующих последовательностей у Methylococcus capsulatus Bath выявили ген, кодирующий данный
фермент (Ward et al., 2004). Возможно, что при росте на Сі-субстратах ген а-кетоглутаратдегидрогеназы репрессирован, но существуют условия, при которых фермент дерепрессируется и -активен. Напротив, метилотрофы с сериновым путем имеют замкнутый нитратный цикл, который, ввиду низкой активности а-кетоглутаратдегидрогеназы, выполняет в основном анаболическую функцию.
Ресинтез С4-Дикарбоновых кислот и поддержание благоприятного энергетического и конструктивного метаболизма у метилотрофов обеспечивается благодаря карбоксилированию пирувата и фосфоенолпирувата (ФЕП). Основным ферментом фиксации СОг у метилобактерий с сериновым путем является ФЕП-карбоксилаза, а у метилобактерий с РМФ циклом - пируваткарбоксилаза (Логинова, Троценко,1979; Доронина, 1999).
У метилотрофов с сериновым путем некоторые ферменты углеводного обмена либо отсутствуют (гексокиназа, дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата), либо имеют крайне низкие активности (фруктозобисфосфатальдолаза), что обуславливает неспособность этих бактерий расти на сахарах. Напротив, у метилотрофных бактерий с РМФ-путем ферменты углеводного обмена имеют высокие активности и осуществляют катаболизм фосфогексоз по гликолитическому пути, а у метанотрофов и по пентозофосфатному. У метанотрофов ключевую реакцию гликолиза — фосфорилирование Фр-6-Ф до ФБФ катализирует ФФн-зависимая ФФК. Кроме того, распад Сб-фосфосахаров может происходить по пути Энтнера-Дудорова. Поскольку у метанотрофов I типа отсутствует активность пируваткиназы, этот путь является единственным механизмом синтеза пирувата из фосфотриоз. Множественные метаболические блоки в путях центрального метаболизма - отсутствие пируваткиназы, ФЕП-синтазы, пируватфосфатдикиназы, а-кетоглутаратдегидрогеназы и ферментов глиоксилатного шунта у всех исследованных облигатных метилотрофов, наряду с функционированием специализированных механизмов трансформации энергии, обусловливают их неспособность к росту на полиуглеродных субстратах (Shishkina and Trotsenko, 1982; Trotsenko et al, 1987; Доронина, 1999).
Аэробные метилобактерий ассимилируют аммоний посредством
глутаматдегидрогеназы или ферментов глутаматного цикла (глутаматсинтаза / глутаминсинтетаза), у некоторых метилобактерий проявляются активности всех трех ферментов. Большинство видов метанотрофов способны к фиксации атмосферного азота, однако не все культуры растут на среде без азота (Oakley and Murrell, 1988). Метанотрофы I морфотипа ассимилируют NH/ путем восстановительного аминирования сс-кетоглутарата и пирувата, а также через глутаматный цикл, тогда как метанотрофы II типа
вовлекают аммонийный азот в клеточное вещество через глутаматный цикл. Мс. capsulatus ассимилирует азот посредством аланиндегидрогеназы и ферментов глутаматного цикла (Murrell and Dalton, 1983; Lees et al., 1991).
Ассоциация аэробных метанотрофных бактерий с растениями
Впервые метанотрофы были обнаружены на поверхности водного растения Elodea sp. в 1906 и названы Bacillus methanicus (переименованные позднее в Methylomonas methanicd). В дальнейшем метанотрофов выделяли из почв, донных осадков, активных илов, пресных и соленых водоемов (Hanson & Hanson, 1996; Гальченко, 2001). Связь метанотрофов с растениями долгое время оставалась без внимания. Основной ролью метанотрофов в природе считали участие в глобальном цикле углерода в различных экосистемах. Метанотрофы окисляют метан - парниковый газ, обуславливающий уровень озона в тропосфере и стратосфере и уровень гидроксильных радикалов в тропосфере (Schimel, 2000). Хотя СН4 обладает относительно коротким временем жизни в атмосфере (11 лет), но задерживает тепло в атмосфере в 21 раз более эффективно, чем ССЬ, и поэтому вносит существенный вклад в глобальное потепление климата на планете. До недавнего времени уровень метана в атмосфере составлял около 1.8 ррш, однако эта цифра ежегодно увеличивается на 1%, а за последние 300 лет концентрация метана увеличилась более, чем вдвое (Cicerone, Oremland, 1988; Khalil, 1993). Возрастание концентрации метана в атмосфере связано как с абиогенными (геохимическими), так и с биогенными (метаногенез) источниками. Значимость этих источников варьирует в разных географических регионах. Около 70% от общего содержания метана в атмосфере Земли (600 Тг С) вырабатывается метаногенами (Schimel, 2004) и 40 - 50% биогенного потока метана составляет эмиссия метана из природных (болота, прибрежные области) и сельскохозяйственных (рисовники) заболоченных территорий (Cicerone & Oremlend, 1988; Oremland, Culberston, 1992). В связи с возрастанием численности населения на планете за последние 30 лет площади рисовников увеличились на 60%, поэтому снижение эмиссии метана из этих источников за счет бактериального окисления может существенно повлиять на глобальный бюджет СЩ в атмосфере (ЕНег, 2001).
Многочисленные исследования показали важность водных растений в процессе эмиссии СЩ. Подсчитано, что в некоторых экосистемах более 80% этого потока из анаэробной зоны почвы в атмосферу происходит через хорошо развитую аэренхиму корней, листьев и стеблей водных растений (Chanton et al., 1989; Dacey, Klug, 1979; Dacey 1980; Schutz et al., 1989; Bazhin, 2004) с помощью пассивного транспорта. Механизм этого транспорта газов детально изучен и описан (Dacey, 1980; Cicerone & Oremland, 1988; Nouchi et al., 1990; Chanton, Dacey, 1991). Четкой зависимости скорости потока метана в атмосферу от видового состава растений на изучаемой территории не обнаружено. Проникновению биогенного метана в атмосферу препятствуют аэробные метанокисляющие сообщества («бактериальный газовый фильтр»), функционирующие в разных экосистемах (Hanson & Hanson, 1996; Заварзин, Васильева, 1999; Dubey et al., 1996; Dubey, 2001). Одним из важнейших компонентом этого фильтра являются метанотрофы, ассоциированные с корневой зоной водных растений. Нейтрофильные, мезофильные метанотрофы играют существенную роль в снижении потока метана в болотах умеренной и субтропических зон и на заливных рисовых полях. С применением 14СН4 показано, что 90% окисления метана в рисовниках происходит именно на глубине залегания корней, куда только они могут поставлять кислород, но не на поверхности почвы (Bosse, Frenzel, 1997). В экспериментах in situ с отмытыми от почвы болотными растениями: понтедерией сердцевидной (Pontederia cordata), ежеголовником (Sparganium eurycarpum), стрелолистом ланцетолистным (Sagittaria lancifolid) показано, что ассоциированные с ними метанотрофы окисляют 63%, 88% и 50% от общего потока выделяемого метана соответственно (King, 1996; Schipper, Reddy, 1996; Calhoun, King, 1997). При этом указывается, что скорость окисления метана зависит не столько от концентрации метана в ризосфере, сколько от концентрации доступного кислорода, который транспортируется из аэрируемых тканей побега растений в корневую зону по аэренхиме, особенно развитой у водных растений (Dacey, 1980). Аналогичные результаты получены для метанотрофных ассоциаций с другими водными растениями - рогозом широколистным (Typha latifolid), вейником канадским (Calamogrostis canadensis) (King, 1994), меч-травой (Cladium jamaicense), кувшинкой белой (Nymphaea odorata), лотосом (Nelumbo pentapetala) (Gerard, Chanton, 1993), хвощом топяным (Equisetum fluviatile) (Kankaala, Bergstrom, 2004) и рисом (Oryza sativa) (Bosse, Frenzel, 1997; Gilbert, Frenzel, 1995). Скорость поступления кислорода в корневую зону водных растений разного таксономического положения сильно отличается (Moorehead, Reddy, 1988), чем, по-видимому, и объясняются различия в скорости окисления метана ассоциированными метапотрофами (Calhoun, King, 1997). В экспериментах с рисом установлено, что толщина почвенного слоя, в котором наблюдается максимальное количество метанотрофов, равна 0 - 0.5 см от непосредственной поверхности корня, что объясняют также доступностью кислорода, поставляемого растением. При этом скорость окисления метана в ризосфере превышала скорость окисления в почве. Учитывая огромную площадь поверхности корней и количество метанотрофов на них, авторы предположили, что окисление метана в ризосфере намного эффективнее этого процесса в почве (Bosse, Frenzel, 1997). Сравнение скорости окисления метана в прикорневой зоне, корнях и стебле водных растений указывало на тесную связь этой активности именно с корнями, поскольку окисление метана в стебле не обнаружено (Gerard, Chanton, 1993). Скорость окисления метана зависит также от стадии роста и развития растений. Для риса отмечена максимальная активность окисления СЩ в вегетационной фазе роста. При этом активность окисления метана in situ не коррелировала с количеством клеток метанотрофов, возможно, из-за присутствия как активно растущих, так и покоящихся форм (ЕПег, 2001).
До недавнего времени считали, что метан не может вырабатываться самими растениями, поэтому их рассматривали только как «транспортную систему», которая позволяла метану проникать из анаэробной зоны на поверхность. Однако, совсем недавно стало известно, что растения способны сами вырабатывать метан в аэробных условиях in situ, причем их вклад в атмосферный «бюджет» составляет 62-236 млн т С / год для живой биомассы и 1-7 млн т С / год для растительного опада (Keppler et al., 2006). Источники метана в растениях пока не ясен.
Интересно, что метанотрофы обнаружены в тканях предварительно стерилизованных растений риса (Bosse, Frenzel, 1997). Добавление в питательную среду для болотных растений антибиотиков, специфически ингибирующих активность метанотрофов, не полностью подавляло окисление метана, что позволило предположить, что метанотрофы располагаются не только на поверхности, но и внутри корней. Это предположение подтверждается данными in situ гибридизации с вейником канадским (Calamogrostis canadensis) (Calhoun, King, 1997) и рисом (Gilbert, Frenzel, 1998). Методами сканирующей конфокальной микроскопии с использованием поликлональных антител и рРНК-проб установлено, что в растениях риса метанотрофы располагаются в сосудах ксилемы центрального цилиндра, а также в клетках кортекса и эпидермы. При этом отмечено, что клетки растения, заполненные метанотрофами, лишены ядра и, по-видимому, не активны. Количество метанотрофов внутри тканей риса увеличивалось с возрастом растения (Gilbert et al., 1998).
Определение активности ферментов
Клетки в экспоненциальной фазе роста центрифугировали при 6000g, 15 мин и отмывали буфером, соответствующим методике определения активности фермента, ресуспендировали в том же буфере. Разрушение клеток проводили двумя способами: 1) Экструзией из замороженного состояния на модифицированном прессе Хыоза с использованием щелевой матрицы конструкции ИБФМ РАН (Ратнер с соавт., 1972). 2) Обработкой ультразвуком на аппарате MSE (Англия) мощностью 150 ватт при 20кГц (4x30 сек) при 4С. Неразрушенные клетки и их фрагменты отделяли центрифугированием (10000g, 45 мин), супернатант использовали для определения активности ферментов. Активности ферментов определяли при 30С. Метанолдегидрогеназу (НФ 1.1.1.99) определяли по восстановлению дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) при 600 нм (Anthony, Zatman, 1964). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): Трис - НС1 буфер, рН 9.0 - 50; NH4CI - 20; ДХФИФ-0.075; феназинметосульфат (ФМС) - 0.5; метанол - 10; KCN - 0.5; экстракт. Реакцию начинали добавлением метанола. НАД - зависимую метанолдегидрогеназу (1.1.1.1) определяли по восстановлению НАД4" при 340 нм (Arfman et ah, 1989). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): Трис - НС1 буфер, рН 9.0 - 50; MgSC 4 - 5; дитиотрейтол - 1; метанол - 10; НАД - 1; экстракт. Реакцию начинали добавлением метанола. Дегидрогеназы формальдегида (НФ 1.2.1.3) и формиата (НФ 1.2.1.2) определяли по восстановлению ДХФИФ (Johnoson, Quayle, 1964). Реакционная смесь в 2мл содержала (мкмоль): К-фосфатный буфер, рН 7.0 - 50; ДХФИФ - 0.075; ФМС - 0.5; формальдегид - 2 или формиат - 50; экстракт. Реакцию начинали добавлением субстрата. НАД -зависимую формальдегиддегидрогеназу (НФ 1.2.1.1) определяли по восстановлению НАД+ при 340 нм (Johnson, Quayle, 1964). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): К - фосфатный буфер, рН 7.0 - 50; НАД - 0.25; восстановленный глутатион - GSH (либо без него) - 2; формальдегид - 2; экстракт. Реакцию начинали добавлением формальдегида. НАД -зависимую формиатдегидрогеназу (НФ 1.2.1.2) определяли по восстановлению НАД+ при 340 нм (Johnson, Quayle, 1964). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): Трис - НС1 буфер, рН 7.5 - 50; НАД - 0.25; формиат - 50; экстракт. Реакцию начинали добавлением субстрата. Оксипируватредуктазу (НФ 1.1.1.29) определяли по окислению НАД(Ф)Н (Blackmore, Quayle, 1970). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): Трис - НС1 буфер, рН 7.4 - 100; НАД(Ф)Н - 0.5; экстракт. Реакцию начинали добавлением 5 мкмоль оксипирувата натрия. При наличии НАДН-редуктазы, полученный результат корректировали на окисление НАДН экстрактом без оксипирувата. L-серин-глиоксилатаминотрансферазу (НФ 2.2.6.1) определяли спектрофотометрически, регистрируя глиоксилат-зависимое образование оксипирувата из L-серина (Blackmore, Quayle, 1970). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): Трис -НС1 буфер, рН 7.5 - 100; пиридоксальфосфат - 0.02; НАДН - 0.5; глиоксилат - 10; экстракт. Реакцию начинали добавлением 10 мкмоль L-серина. При наличии в экстрактах активности глиоксилатредуктазы в полученный результат вносили соответствующую поправку. Малатлиазу определяли по разложению малата до глиоксилата с фенилгидразином (Dixon, Kornberg, 1959). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): Трис - HCI буфер, рН 7.4 -100; L-малат - 10; АТФ - 6; КоА - 0.5; фенилгидразин (нейтрализованный до рН 7.0) - 10; цистеин (нейтрализованный до рН 7.0) - 3; экстракт. Реакцию начинали добавлением 10 мкмоль L-малата. Образование фенилгидразопа глиоксилата регистрировали при 324 нм. Гексулозофосфатсинтазу определяли спектрофотометически (Ferenci et al. 1974) по восстановлению НАДФ в опосредованной реакции с использованием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (НФ 1.1.1.49) и глюкозофосфатизомеразы. Реакционная смесь в 2мл содержала (мкмоль): К - фосфатный буфер, рН 7.0; MgCb - 8; НАДФ+ - 0.5; глюкозофосфатизомеразу из мышцы кролика - 1.68 мкмолярных единиц; глюкозо - 6 -фосфатдегидрогеназу (тип 7, Sigma) - 0.15 мкмолярных единиц; рибозо-5-фосфат; экстракт. Реакцию начинали добавлением 5 мкмоль формальдегида. Гексокиназу (НФ 2.7.1.1) определяли, используя сопрягающий фермент глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (van Dijken, Quayle, 1977). Реакционная смесь (2мл) содержала (мкмоль): Трис - НС1 буфер, рН 7.6 - 100, MgCl2 - 5, АТФ - 6, НАДФ+ - 1, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу - 2 ед. Реакцию начинали добавлением глюкозы (1 мкмоль) или фруктозы (1 мкмоль) + глюкозо-6-фосфатизомеразы (1 ед). Гліокозо-6-фосфатдегидрогеназу (НФ 1.1.1.49) определяли по восстановлению НАДФ (Korndberg, Horecker, 1955). Реакционная смесь в 2мл содержала (мкмоль): К-фосфотный буфер, рН 7.5 - 150; MgCb - Ю; НАД(Ф)+ - 1.0; натриевая соль глюкозо-6-фосфата -10; экстракт. Реакцию начинали добавлением субстрата. 6-фосфоглюконатдегидпогеназу (1.1.1.44) определяли по восстановлению НАДФ+ (Korndberg, Horecker, 1955). Реакционная смесь в 2мл содержала (мкмоль): Трис - НС1 буфер, рН 7.5 - 100; MgCl2 - 10; НАДФ+ - 1.0 Реакцию начинали добавлением 10 мкмоль натриевой соли 6-фосфоглюконата. Альдолазу фпуктозо-1,6-бисфосфата (НФ 4.1.2.13) определяли с сопрягающим ферментом глицерофосфатдегидрогеназой (van Dijken, Quayle, 1977). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): Трис - НС1 буфер, рН 7.5 - 100; СоСЬ - 2; НАДН - 0.5; глицерофосфатдегидрогеназу - 0.36 ед; экстракт. Реакцию начинали добавлением 2 мкмоль фруктозо-1,6-бисфосфата. Альдолазу 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконата (НФ 4.1.2.14) определяли с сопрягающим ферментом лактатдегидрогеназой (Wood, 1971). Реакционная смесь в 2мл содержала (мкмоль): имидазольный буфер, рН 8.0 - 50; 6-фосфоглюконат (натриевая соль) - 10; НАДН - 0.5; MgCb - 5; дитиотрейтол - 2; лактатдегидрогеназу из мышцы свиньи ("Reanal") - 5 ед; экстракт. Реакцию начинали добавлением 6-фосфоглюконата. Контролем служила реакционная смесь без 6-фосфоглюконата. 6-фосфофруктокиназу (НФ 2.7.1.11) определяли, используя сопрягающий фермент фруктозо-1,6-бифосфатальдолазу (van Dijken and Quayle, 1977). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): трис - НС1 буфер, рН 7.6 - 100, MgCl2 - 5, АТФ (или ФФ„) - 8 (2), НАДН - 0.5, фруктозо-6-фосфат - 10, альдолазу фруктозобисфосфата - 2 ед., осглицерофосфатдегидрогеназу - 0.75 ед., экстракт. Реакцию начинали добавлением фруктозо-6-фосфата (10 мкмоль). Рибулозобисфосфаткарбоксилазу (НФ 4.1.1.39) определяли радиоизотопным методом с использованием NaH СО3. Реакционная смесь в 1мл содержала (мкмоль): Трис - НС1 буфер, рН 7.6 -100; MgCl2 - 2.5; глутатион восстановленный (GSH) - 10; рибулозо-1,5-бисфосфат (натриевая соль) - 0.25; NaH14C03 - 18 (20 мккюри), экстракт. Реакцию проводили при 30С, отбирали пробы объемом 0.02 мл с интервалом в 1мин, наносили их на квадраты стекловолокнистой бумаги Whatman GF/F, фиксировали добавлением 0.05 мл 6н. НС1, высушивали и просчитывали радиоактивность. Фосфорибулокиназу (НФ 2.7.1.19) определяли по методике для рибулозобисфосфаткарбоксилазы, заменяя рибулозо-1,5-бисфосфат на рибозо-5-фосфат (0.25 мкмоль) + АТФ (0.25 мкмоль).
Метаболическая характеристика
Для выяснения какие элементы генома ответственны за выработку цитокининов у представителей метилотрофов, мы проанализировали ряд уже известных структур генов, кодирующих ферменты- ключевых реакций в пути биосинтеза цитокининов у других микроорганизмов. До начала нашей работы были определены нуклеотидные последовательности генов, ответственных за продукцию цитокининов у различных видов фитопатогенных бактерий. Нами проанализированы известные нуклеотидные последовательности генов tmr и tzs из Agrobacterium tiimefaciens (Akiyoshi et al., 1987) uptz из Pseudomonas syringae pv. savastanoi (Powell, Morris, 1986) и соответствующие аминокислотные последовательности белков. Сравнение нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей показало высокую степень гомологии 5 -концевых последовательностей ДНК этих генов и концевых последовательностей соответствующих белков. В С-концевой области аминокислотные последовательности белков очень вариабельны, что справедливо и для соответствующих участков ДНК. Тем не менее аминокислотные остатки в районах с 25 по 38 и с 92 по 104 отличаются консервативностью, а последовательности С 31 по 38 и с 96 по 104 полностью совпадают (Akiyoshi et al., 1987). Гены биосинтеза цитокининов у исследуемых штаммов метилотрофов выявляли методом ПЦР с использованием соответствующих олигонуклеотидных праймеров, гомологичных различным участкам генов tmr, tzs viptz.
Олигонуклеотид №1 кодирует аминокислоты с 31 по 38 продукта гена tzs, последовательность нуклеотидов праймера №2 комплементарна последовательности, кодирующей аминокислоты с 98 по 104 того же белка. У всех трех генов ptz, tzs и tmr соответствующие белки Ptz, Tzs и Ipt в этих районах имеют 100%-ную гомологию. Последовательность олигонуклеотида №3 комплементарна последовательности, кодирующей аминокислоты с 224 по 230 продукта гена tzs, который в этой области не имеет гомологии с генами tmr и ptz. Олигонуклеотид №4 соответствует последовательности, кодирующей аминокислоты с 48 по 55 продукта гена ptz, который в этой области имеет очень слабую гомологию с продуктами генов tzs и tmr. Наконец, олигонуклеотид №5 комплементарен последовательности, кодирующей аминокислоты с 159 по 167 продукта гена ptz, который в этой области не имеет гомологии с генами tzs и tmr. ПЦР проводили с использованием в качестве матрицы геномной ДНК, выделенной из биомассы исследуемых штаммов метилотрофов, с различными комбинациями пар праймеров: 1-2, 1-3,1-5,4-2,4-3,4-5.
Электрофоретический анализ продуктов амплификации показал наличие четких полос только в случае применения пар олигонуклеотидов 1-2 и 1-3. В качестве положительного контроля в ПЦР с этими парами праймеров был использован препарат ДНК, выделенный из A. tumefaciem. Размеры амплифицированных фрагментов ДНК соответствовали ожидаемым, то есть примерно 220 пар нуклеотидов (далее продукт 220 п.н.) для пары праймеров 1-2 и примерно 600 пар нуклеотидов (далее продукт 600 п.н.) для пары праймеров 1-3. Однако, кроме этих полос на электрофореграмме образцов, полученных из ДНК исследуемых штаммов метилобактерий, присутствовали и другие полосы, соответствующие фрагментам ДНК, длина которых была больше ожидаемой примерно вдвое (рис. 8.3). После разделения в легкоплавкой агарозе полученные фрагменты ДНК были повторно амплифицированны с теми же парами праймеров. В результате вторичных ПЦР на электрофореграмме получили: при использовании пары праймеров 1-2 и продукта 220 п.н. - одну полосу, соответствующую фрагменту ДНК длиной примерно 220 п.н.; в случае использования пары праймеров 1-3 и продукта 600 п.н - одну полосу, соответствующую фрагменту ДНК длиной примерно 600 п.н. При использовании фрагментов ДНК большей длины были получены для каждой пары праймеров по два фрагмента ДНК с такими же размерами, как после первичной амплификации. Эти результаты позволяют предположить, что исследуемые гены представлены по крайней мере двумя копиями, находящимися в непосредственной близости. Подобное дублирование последовательностей нередко встречаются у микроорганизмов и служит, по-видимому, для усиления функции генов. Таким образом, методом ПЦР нами показано, что исследуемые штаммы метилобактерий содержат в своем геноме структуры, гомологичные последовательностям генов биосинтеза цитокининов А. tumefaciem.
Поскольку наличие генов само по себе не свидетельствует о синтезе соответствующих продуктов, мы проанализировали их экспрессию у изучаемых штаммов метилобактерий на уровне информационных РНК. Наличие информационных РНК, имеющих соответствующую структуру, дает основание полагать, что данная последовательность ДНК является частью функционально активного гена, который кодирует аминокислотную последовательность ключевого фермента пути биосинтеза цитокининов. Используя олигонуклеотидные праймеры№2 (вариант 1) и №3 (вариант 2), AMV-обратную транскриптазу и РНК из биомассы М. mesophilicum и М. mays как метилотрофных линий (выращенных на среде К с СНзОН), так и гетеротрофных линий (более 10 пассажей на агаризованной среде К с 3% сукцината), мы синтезировали кДНК. Последние затем использовали для.ПЦР-амплификации с применением пар праймеров 1-2 и 1-3 в каждом варианте кДНК. Положительным контролем служила РНК Л. tumefaciem. кДНК, синтезированной из иРНК A. tumefaciens, с использованием пары праймеров 1 -2 амплифицировался фрагмент ДНК ожидаемого размера - около 220 п.н. При использовании пары праймеров 1-3 - фрагмент ДНК (около 600 п.н.) амплифицировался только в том образце, в котором кДНК была синтезирована при участии олигонуклеотида №3 (рис. 3). Эти результаты вполне согласуются с данными о структуре гена tzs А. tumefaciens. В то же время во всех образцах из М. mesophilicum (рис. 8.4) и М. mays (фото не приводится) амплифицировалось по два фрагмента ДНК, а именно фрагменты длиной примерно 220 п.н. и около 800 п.н. в варианте ПЦР с парой праймеров 1-2 и фрагменты длиной примерно 600 п.н. и около 1200 п.н. в варианте ПЦР с применением пары праймеров 1-3. Полученные результаты можно объяснить, если принять сделанное в первой части работы предположение, что исследуемые гены представлены двумя копиями, находящимися в непосредственной близости, и транскрибируются в составе одной иРНК. Тот факт, что эти иРНК присутствуют в клетках М. mesophilicum, выращенных как на метаноле (0.3%), так и на сукцинате (0.3%), указывает на то, что экспрессия данного гена носит конститутивный характер. Во всяком случае, метанол не является фактором, вызывающим экспрессию данного гена.
Влияние метилобактерий и метанотрофов на рост и морфогенез табака и картофеля in vitro
Для проверки наличия пути биосинтеза ИУК через триптамин экстракты клеток метилобактерий инкубировали с раствором L-триптофана (600 мг/мл) с последующим анализом продуктов его превращения методом ТСХ. Триптамин не найден среди промежуточных продуктов метаболизма триптофана, что свидетельствует об отсутствии активности триптофандекарбоксилазы. В то же время триптамин не был столь эффективным стимулятором образования ИУК у исследуемых штаммов метилобактериий, как триптофан.
Известно, что превращение триптофана в ИУК через индолил-3-ацетальдегид катализируется оксидазой, окисляющей боковую цепь триптофана (фермент TSO). Определение активности данного фермента у аэробных метилобактерий с помощью чашечного теста дало отрицательные результаты. Ранее было показано (Oberhansli et al., 1991), что TSO индуцируется в стационарной фазе роста Pseudomonas fluorescens, в отличие от триптофанаминотрансферазы, которая более активна у клеток в логарифмической фазе роста. TSO обнаружена также у бактерий, которые могут использовать триптофан в качестве источника углерода. Однако исследуемые метилобактерий не росли на триптофане и не имели активности TSO в стационарной фазе роста на среде с метанолом и L-триптофаном, что указывает на отсутствие этого фермента.
Двухступенчатый путь биосинтеза ИУК через индолил-3-ацетамид показан только у фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae (Comai, Kosuge, 1980), Agrobacterium tumefaciens (Thomashow et al., 1984), Erwinia herbicola (Manulis et al., 1991), а также у непатогенных Bradyrhizobium и Streptomyces (Manulis et al., 1994). Однако анализ ДНК из 216 штаммов ризосферных псевдомонад не выявил генов триптофанмонооксигеназы, что позволило авторам сделать вывод об отсутствии пути биосинтеза ИУК с участием этого фермента у ризосферных псевдомонад (Мордухова с соавт., 1991). С другой стороны, ранее отмечалось образование индолил-3-ацетамида у Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens. В связи с этим обнаружение индолил-3-ацетамида среди экзометаболитов метилобактерий нельзя рассматривать как достаточно убедительное доказательство наличия пути биосинтеза ИУК через данный интермедиат.
Итак, нами впервые показано образование ауксинов, из триптофана у аэробных метилотрофных бактерий и выявлен, по крайней мере, один путь биосинтеза ИУК через ИПвК. Следовательно, наряду с обнаруженными ранее цитокининами, метилотрофы синтезируют фитогормоны другого класса - ауксины, причем ИУК, выделенная из культуральной жидкости метилотрофов,- стимулировала рост гнотобиотических растений, что подтверждает существование тесной метаболической связи метилобактерий с растениями.
Кроме фитогормонов, многие метилотрофные бактерии способны синтезировать другие биоактивные соединения, такие как витамины. Известно, что РОФМ синтезируют и накапливают витамин Вп, особенно при росте на метаноле.
Витамин Bi2 анализировали с помощью ауксотрофного по витамину В штамма Escherichia coli 113-3. Количество синтезируемого витамина определяли в экстракте разрушенных клеток бактерий, поскольку витамин Вп не экскретируется бактериями. Известно, что Е. coli 113-3 может расти на метионине, поэтому в эксперимент включался дополнительный контроль на метионин. Способность к биосинтезу витамина Віг обнаружена у всех исследуемых штаммов (Табл. 8.6). Метилобактерий и метанотрофы различного таксономического положения синтезируют витамин Ві2 с выходом 5-700 нг/л.
Согласно литературным данным, растения не способны синтезировать витамин Віг, поэтому бактерии, ассоциированные с растениями, могут поставлять эти вещества, необходимые для реакций изомеризации и трансметилирования.
Нами получены приоритетные данные о симбиозе с растениями не только РОФМ рода Methylobacterium, но метилобактерий и метанотрофов различного таксономического положения (Methylovorus, Paracoccus, Xanthobacter, Methylophaga, Methylocystis, Methylococcus, Schlegelia). Связь между растениями и метилотрофами взаимовыгодна. Микросимбионты зависят от растений в своих питательных нуждах и как физического местообитания. В свою очередь растения зависят от бактерий в плане удаления вредных для самого растения метаболитов, образуемых- во время роста, например, метанола. Очевидно, физиологически активные ткани растений вырабатывают значительные количества метаболитов, а бактерии удаляют их из апопласта, используя в качестве источника питания, разлагают до более простых соединений (например, аммиак), которые в конечном счете возвращаются в растение. Исследования образования и эмиссии СН4 на заболоченных территориях указывают на взаимосвязь потоков метана с растениями. С одной стороны, растения способствуют эмиссии метана из анаэробной зоны почв в атмосферу, благодаря способной диффузии по хорошо развитой аэренхиме растений. С другой стороны, растения способствуют проникновению кислорода и молекулярного азота вглубь, стимулируя тем самым рост бактерий, окисляющих метан.
Клетки метилотрофов вырабатывают ЭПС, которые сохраняют популяцию метилотрофов на поверхности растений, что помогает им получать органические вещества из апопласта растительного листа. При этом, в отличие от патогенов, метилотрофы не оказывают негативного воздействия на растения. Наоборот, метилотрофы помогают растениям: участвуют в азотном обмене, поставляют витамины, регулируют рост и развитие растений посредством синтеза фитогормонов - цитокининов и ауксинов, повышают устойчивость растений при различных стрессах, способствуют выживаемости. По-видимому, метилотрофы поставляют растениям фитогормоны в оптимальном соотношении цитокинины/ауксины, что необходимо для правильного роста корней и побегов.
Поскольку метилотрофные бактерии положительно влияют на растения, манипуляция с ними посредством генной инженерии или селекции должна стать легитимной стратегией целенаправленного улучшения свойств и урожайности растений. Возможно, режимы и дозы внесения удобрений удастся рационализировать, учитывая, что они являются питающими и для микроорганизмов. Метилотрофы также полезны для повышения сохранности и прорастаемости семян некоторых растений.
В целом, способность метилобактерий стимулировать рост и морфогенез растений in vitro указывает на перспективность их применения в различных направлениях современной экспериментальной физиологии и биотехнологии растений. Комбинированное использование разработанных методов колонизации растений в условиях отсутствия конкуренции с нежелательной микрофлорой создает основу для новых технологий их культивирования, в особенности для клонального микроразмножения растений с низкой регенерационной способностью. Облигатные метилобактерии, растущие только на С і-субстратах, имеют. очевидные преимущества перед факультативными и являются новыми перспективными объектами для колонизации гнотобиотических растений, поскольку не растут на богатых средах, используемых для культивирования последних. Дальнейшее изучение физиолого-биохимических и молекулярно-генетических основ фитосимбиоза аэробных метилотрофных бактерий позволит понять принципы этого взаимодействия и более эффективно реализовать метаболический потенциал метилотрофов в современной биотехнологии растений.
