Введение к работе
Актуальность проблемы. Передача сигнала рецепторними тирозинкиназами является важнейшем звеном регуляции биологических процессов клеточного роста, дифференцировки и смерти. Нерегулируемая активация этих рецепторов является ведущим и порой единственным механизмом канцерогенеза ряда опухолей и патологий развития (Hirota et al. 1998). Протоонкоген c-kit кодирует трансмембранную рецепторную тирозинкиназу типа Ш для колониестимулирующего фактора роста. Активирующие мутации в этом гене приводят к конститутивному фосфорилированию рецептора даже в отсутствие колониестимулирующего фактора роста и как следствие к туморогенезу некоторых мезенхимальных и эпителиальных новообразований (Nakahara et al. 1998). Множество фактов свидетельствует о том, что блокирование активности различных рецепторов и белков, участвующих в канцерогенезе, приводит к уменьшению размеров опухоли и продлению жизни больных. Использование новых химических соединений направленного действия, селективно воздействующих на рецепторные белки в опухолевых клетках, реально обеспечивает бблыпую эффективность лечения и меньшую токсичность по сравнению с традиционной неспецифичной химиотерапией.
Для большой группы сарком мягких тканей, самыми распространенными среди которых являются мезенхимальные новообразования желудочно-кишечного тракта, характерна экспрессия и конститутивная активация рецептора с-КГГ (Stepanova et al. 2002). В США ежегодно выявляется около 5000 новых случаев стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (СОЖКТ). В большинстве случаев заболевание заканчивается летальным исходом в течение нескольких лет после постановки диагноза вследствие низкой эффективности традиционной химио- и радиотерапии, причины которой остаются неясными. Прогнозирование успеха лечения конкретного онкологического больного до сих пор остается нерешенной задачей. Одним из подходов к прогнозированию чувствительности к терапевтическому воздействию является поиск маркеров индивидуального ответа и изучения молекулярных эффектов воздействия лекарственного средства, однако большинство предпринятых в этом направлении попыток не обеспечило желаемого эффекта. В частности, это касается лечения СОЖКТ противоопухолевым препаратом фениламинопиримидином (Гливеком). Гливек принадлежит к новейшему классу селективных ингибиторов рецепторных тирозинкиназ, к которым относятся рецепторы с-КГТ, PDGFR и Всг-АЫ. Молекулярный механизм действия фениламинопиримидина был изучен в случае ингибирования рецептора Всг-АЫ при хроническом миелолейкозе (Savage et al. 2002).
і РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ )
I БИБЛИОТЕКА j
1,]
Что касается с-КГТ, обладающего структурной аналогией с Всг-АЫ, то механизм его ингибирования Гливеком, а также последующий молекулярный ответ на действие этого препарата изучены лишь поверхностно. Впервые Гливек использовали для лечения сарком мягких тканей в рамках клинических испытаний №CSTI571-B2222, проведенных в США. Фаза П этих испытаний выявила большое количество положительных ответов, однако 13% пациентов не ответили на терапию, а у рада больных наблюдали рецидив заболевания в течение нескольких месяцев после условно-положительного ответа. Вопрос о молекулярных механизмах первичной и приобретенной резистентности к Гливеку остается открытым.
Анализ дифференциальной экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов является оптимальным подходом для решения этого вопроса, а также для определения возможных маркеров устойчивости к Гливеку. Мы приняли решение изучить влияние Гливека на дифференциальную экспрессию (профилирование) генов в клетках СОЖКТ, сравнивая «генетические портреты» обработанных и необработанных препаратом культур этих клеток. Биологическую значимость результатов профилирования проверяли на панели клинических образцов опухолей, полученных от пациентов до и во время лечения Гливеком.
Цель я задачи работы. Целью настоящей работы было исследование молекулярных механизмов ингибирования конститутивной активности рецептора с-КГТ фениламинопиримидином (Гливеком) и изучение воздействия этого селективного ингибитора тирозинкиназ на изменение передачи сигнала в клетках СОЖКТ. Ставился также целью поиск прогностических маркеров эффективности индивидуального лечения больных СОЖКТ этим препаратом, а, возможно, и ранее неизвестных перспективных терапевтических мишеней.
В связи с этим в работе ставились следующие экспериментальные задачи:
-
Получить стабильную культуру клеток, моделирующую СОЖКТ in vitro и пригодную для изучения терапевтического воздействия Гливека. Оценить эффект Гливека на рост и пролиферацию полученной культуры клеток с использованием современных методов оценки состояния клеточного цикла, выживаемости, уровней пролиферации и апоптоза.
-
Используя технологию ДНК-микрочипов, определить биологические маркеры ответа на терапию Гливеком и вовлеченные сигнальные каскады, участвующие в генетической регуляции, исходя из изменения уровня экспрессии генов в культуре клеток под действием препарата
-
Подтвердить биологическую и клиническую значимость маркерных генов-кандидатов в условиях in vivo, используя операционный материал и биопсии больных СОЖКТ.
-
Исследовать молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора с-КГГ фениламинопиримидином, анализируя состояние активации ключевых адаптерных белков сигнальных каскадов, начинающихся от рецептора с-КГГ.
-
Провести функциональную оценку механизмов действия белковых продуктов маркерных генов и вычленить функционально активные молекулярные каскады прохождения сигнала от рецептора с-КГГ при его активации и ингибировании в контексте СОЖКТ.
Научная новизна. Все представленные в работе результаты имеют научную новизну. Полученная в настоящей работе клеточная линия GIST882 является первой описанной стабильной культурой клеток СОЖКТ. Эта клеточная линия впервые использована нами как модель СОЖКТ для изучения биологии этого новообразования. Получив препарат Гливек с любезного разрешения компании «Новартис Онкология», мы имели возможность в рамках клинических испытаний впервые исследовать действие Гливека на культуре клеток GIST882. Впервые всесторонне оценено действие Гливека на рост, пролиферацию клеток СОЖКТ и индукцию в них апоптоза, равно как на состояние и взаимодействие каскадов прохождения сигнала от рецептора KIT и на уровни экспрессии других генов. Нами впервые проведено генетическое профилирование ответа на действие Гливека в системе СОЖКТ in vitro. В ходе этих экспериментов впервые выявлен ряд Гливек-зависимых генов, которые потенциально могут использоваться в качестве маркеров эффективности лекарственного ответа, а для семи из них изменение экспрессии при действии Гливека подтверждено двумя независимыми методами. Эффект резкого изменения экспрессии двух генов (SPRY4A и MAFbx) под действием Гливека наблюдали также в клинических биопсийных образцах опухолей больных СОЖКТ, что является принципиально новым результатом. Впервые показано, что инсерционная соматическая мутация гена с-КГГ 1530ins6 определяет резистентность к Гливеку. Молекулярные механизмы эффектов Гливека также впервые подробно исследованы на уровне белков.
Практическое значение работы определяется тем, что она является интегральной частью клинических испытаний № CSTI571-B2222 эффективности препарата Гливек в лечении СОЖКТ. В ходе этих испытаний от пациентов до и после терапии Гливеком был получен уникальный набор биопсий СОЖКТ, который использовался в данной работе. На этих клинических образцах, как в случае благоприятного ответа на терапию
Гливеком, так и в случае резистентных СОЖКТ, подтверждена биологическая значимость полученных в культуре клеток результатов.
Анализ экспрессии генов, определяющих эффективность ответа на Гливек, позволил найти прогностические маркеры результативности лечения Гливеком, которые можно определять даже в тонкоигольных биоптатах СОЖКТ. Выявленные маркеры являются высоконадежными; действительно, предсказание совпадало с клинической картиной в 100% случаев. Разработанная модель СОЖКТ in vitro имеет большую практическую ценность, поскольку может быть использована для поиска потенциальных маркеров лекарственной эффективности других препаратов. Кроме того, на основании полученных в этой работе данных белковые продукты генов SPRY4A и RTP801 могут рассматриваться как потенциальные мишени при разработке новых лекарственных препаратов, особенно в случаях СОЖКТ, резистентной к Гливеку.
Апробация. Материалы работы были представлены на 7-ой ежегодной научной конференции имени Эдварда Д. Ластбайдера, Филадельфия, США, 2002; 2-ой научной конференции по проблемам рака желудочно-кишечного тракта, проводимой Онкологическим центром Андерсона, Орландо, США, 2002; 5б-ой ежегодной конференции Общества хирургов-онкологов (Society of Surgical Oncology), Лос-Анджелес, США, 2003 и 94-ой ежегодной конференции Американского общества исследования рака (American Association for Cancer Research), Вашингтон, США, 2003. Диссертационная работа была апробирована на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии Российского государственного медицинского университета и в Центре биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.
Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 4 тезисных сообщения, 3 из которых были представлены в виде симпозиальных докладов на международных научных конференциях. Автор диссертации награжден дипломом за лучший доклад и премиями для молодых ученых научных обществ Американской ассоциации раковых исследований (AACR-ILEX Oncology) и Онкологического центра Андерсона.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждения, выводы, список
литературы. Диссертация изложена на страницах и включает в себя 28
рисунков и 3 таблицы. Список литературы содержит 267 источников.
