Содержание к диссертации
Введение
1. Природа и физиологическая роль белковых ингибиторов протеиназ (аналитический обзор) 8
1.1. Биохимическая характеристика белковых ингибиторов протеиназ растений 8
1.2. Содержание, активность и физиологические функции ингибиторов протеиназ у растений 18
1.2.1. Ингибиторы протеиназ как составная часть системы защиты от вредителей и болезней 18
1.2.2. Ингибиторы протеиназ в тканях растений семейства пасленовых. 33
1.3. Методы определения протеиназ и их ингибиторов 36
2. Материалы и методы 40
2.1. Объекты исследований 40
2.2. Материалы и реактивы 41
2.3. Методы исследований 42
2.3.1. Определение активности протеолитических ферментов 42
2.3.2. Определение активности ингибиторов протеиназ 43
2.3.3. Определение концентрации белка 44
2.3.4. Математическая обработка результатов 45
3. Экспериментальная часть 46
3.1 Методы определения активности протеолитических ферментов и их ингибиторов по гидролизу желатинового слоя фотопластины (разработка методов) 46
3.1.1. Метод определения активности протеолитических ферментов 46
3.1.2. Метод определения активности ингибиторов протеиназ 56
3.2. Активность ингибиторов протеиназ в тканях картофеля 62
3.2.1. Активность ингибиторов трипсина в прорастающих клубнях картофеля 62
3.2.2. Активность ингибиторов протеиназ в проростках картофеля 64
3.3. Активность ингибиторов протеолитических ферментов насекомых-вредителей в тканях картофеля 69
3.3.1. Активность протеолитических ферментов личинок колорадского жука и фасолевой зерновки 69
3.3.2. Активность ингибиторов протеиназ насекомых-вредителей в тканях картофеля 72
3.4. Влияние защитных препаратов и биостимуляторов на антипротеолитическую активность в тканях картофеля 77
Выводы 85
Литература 87
- Содержание, активность и физиологические функции ингибиторов протеиназ у растений
- Ингибиторы протеиназ в тканях растений семейства пасленовых.
- Определение активности протеолитических ферментов
- Активность ингибиторов трипсина в прорастающих клубнях картофеля
Введение к работе
Актуальность темы. Белки-ингибиторы протеолитических ферментов обнаружены в тканях животных, растений и в микроорганизмах (Мосолов, 1971; 1983; Ryan, 1973; 1981; Laskowski, Kato, 1980; Richardson, 1977; Валуева, Мосолов, 1999, 2002). Содержание ингибиторов в семенах культурных растений достигает до 5-10 % растворимых белков (Micola, Kirsi, 1972). Общим свойством этих молекул является способность образовывать с протеолитическими ферментами устойчивые комплексы, что приводит к обратимому подавлению их активности.
Широкое распространение ингибиторов и их содержание в значительных количествах в тканях растений позволяют предположить, что они являются одним из важнейших компонентов регуляции различных физиологических процессов.
Способность растительных белков подавлять активность протеиназ млекопитающих, насекомых и микроорганизмов легли в основу представлений об их защитных функциях. Так, в семенах сельскохозяйственных культур были обнаружены специфические ингибиторы протеолитических ферментов пищеварительного тракта насекомых. Оказалось, что эти ингибиторы были неактивны по отношению ни к трипсину и ни к химотрипсину (Конарев, Вилкова, 1984; Конарев, 1984, 1987, 1991, 2000). В растительных тканях обнаружены ингибиторы, подавляющие активность протеиназ патогенных микроорганизмов (Кладницкая и др., 1994; Конарев, 2000, Валуева, Мосолов, 2002).
Большое количество ингибиторов содержится в тканях картофеля. Особенно высоким содержанием белков-ингибиторов характеризуются клубни картофеля, где на их долю приходится до 15-20% всех водорастворимых белков (Ryan С. A. et al.,1976). Среди белков-ингибиторов, присутствующих в клубнях картофеля, обнаружены ингибиторы протеолитических ферментов различных классов - сериновых, цистеиновых и аспартильных протеиназ, а также металлсодержащих карбоксипептидаз (Garsia-Olmedo F. et al.,1987).
Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata является особо опасным вредителем картофеля. Установлено, что личинки колорадского жука за 2 недели могут уничтожить до 45 % листовой поверхности растений (Теняев, 2000). Изучение физиолого-биохимических и молекулярных механизмов взаимодействия этих насекомых с растениями является актуальной задачей. В этом плане весьма перспективным представляется исследование функционирования системы «протеиназы насекомых - белковые ингибиторы растений».
Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в оценке
значения ингибиторов экзогенных протеиназ в формировании
устойчивости картофеля к колорадскому жуку. Нами были поставлены следующие задачи:
разработка новых методов определения активности протеиназ и их ингибиторов;
изучение активности протеиназ личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata;
изучение активности ингибиторов протеиназ у сортов картофеля с различной устойчивостью к колорадскому жуку;
изучение влияния защитных препаратов и биостимуляторов на активность ингибиторов протеиназ в растениях картофеля. Научная новизна. Разработаны новые методы определения активности
протеолитических ферментов и их ингибиторов. Показано, что уровень активности ингибиторов экзогенных протеиназ (ферментов личинок насекомых) в тканях картофеля зависит от степени устойчивости сорта к колорадскому жуку.
Практическая значимость. Разработанные методы и полученные данные могут быть использованы в селекции картофеля на устойчивость к неблагоприятным факторам среды, в том числе и к насекомым-вредителям.
Апробация результатов. Результаты исследований были представлены на VII Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (Симферополь, 1998), на V Молодежной научной конференции (Сыктывкар, 1998), на VI Молодежной научной конференции (Сыктывкар, 1999), на конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии" (Челябинск, 1999), на IV Съезде физиологов растений России (Москва, 1999), на конференции «Химия и технология применения регуляторов роста растений» (Уфа, 2001), на конференции «Актуальные проблемы современной генетики» (Москва, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в т.ч. 1 патент РФ на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературных данных, описания объектов и методов исследований, изложения и обсуждения результатов исследований, выводов. Список цитируемой литературы содержит 149 ссылок (66 отечественных и 83 зарубежных источников). Работа изложена на ПО страницах и содержит 11 таблиц и 20 рисунков.
Содержание, активность и физиологические функции ингибиторов протеиназ у растений
Как известно, значительная часть ингибиторов в семенах и вегетативных органах растений действует на чужеродные протеиназы: ферменты животных и микроорганизмов. Отсюда предполагается, что эти ингибиторы принимают участие в формировании защитных реакций растений при действии на них насекомых-вредителей и патогенных микроорганизмов. Первые данные о защитной роли ингибиторов былиполучены К. Аппельбаумом и Конжином, которые обнаружили способность ингибиторов трипсина и химотрипсина из семян бобовых подавлять активность пищеварительных ферментов ряда вредителей семян (Appelbaum, Konjin, 1966). В дальнейшем это свойство было обнаружено и у ингибиторов из семян пшеницы, ржи, кукурузы (Melville, Scandalios, 1972; Балаян, 1982). В настоящее время большинство исследователей придерживается мнения о том, что участие в формировании защитных реакций растений при действии на них биотических и абиотических факторов, является одной из основных функций ингибиторов растительных протеиназ (Richardson, 1977; Boisen, 1983; Ryan, 1988; Мосолов, Валуева, 1993; Валуева, Мосолов, 1995; Ибрагимов и др., 2000). Об этом свидетельствуют данные о специфичности растительных ингибиторов к ферментам патогенных микроорганизмов. Многие белки-ингибиторы трипсина и химотрипсина, выделенные из семян растений, обладают способностью подавлять активность сериновых протеиназ микроорганизмов, таких, как субтилизин и протеиназы некоторых грибов рода Aspergillus, Fusarium. Такие ингибиторы широко представлены у растений из семейств злаковых, тыквенных, амарантовых и гречишных.
В структурном отношении эти белки принадлежат к семейству картофельного ингибитора протеиназ I (Валуева, Мосолов, 19996), который также является эффективным ингибитором ферментов микробного происхождения (Ryan et all., 1976). У ряда растений обнаружены ингибиторы, специфичные по отношению к протеиназам микроорганизмов и не действующие на трипсин, химотрипсин и другие протеиназы животных. Подобные ингибиторы выделены из семян фасоли обыкновенной (Mosolov et all., 1982; Мосолов, Малова, Чебан, 1983), маша (Kapur, Tan-Wilson, Wilson, 1989), фасоли-адзуки (Yoshikawa, Ogura, 1978), коровьего гороха (Vartak, Rele, Jagannathan, 1980), конских бобов (Svendsen, Hejgaard, Chavan, 1984), долихоса двухцветкового (Dolichos biflorus) (Bodhe, 1991), чины (Sumathi, Pattabiraman, 1976), канавалии (Terada, Fujimura, Katayama et all., 1994), люцерны (McGull, 1995), томата (Paulot et all., 1991). В семенах злаковых и зернобобовых культур обнаружены ингибиторы, подавляющие активность протеолитических ферментов пищеварительного тракта насекомых. Эти ингибиторы также неактивны по отношению к трипсину и химотрипсину (Балаян, 1982; Конарев, 1984, 1987, 1991; Конарев, Вилкова, 1984). Действие ингибиторов протеиназ из семян на ферменты фитопатогенных микроорганизмов менее изучено. Так, было показано, что ингибитор трипсина и химотрипсина семейства SBBTI, выделенный из семян фасоли, сои, пшеницы, клубней картофеля, подавляет протеолитическую активность патогенных грибов Fusarium solani и F. sumbucinum, которые вызывают гниль корней, плодов и семян, а также трахеомикозное сосудистое увядание у растений различных семейств.
В более поздних исследованиях установлено, что наибольшей активностью против трипсиноподобной протеиназы грибов обладают ингибиторы из клубней картофеля (Бенкен, Мосолов, Федуркина, 1976; Кладницкая и др., 1994). Стало также известно, что растительные ингибиторы, относящиеся к семейству картофельного ингибитора, характеризуются высокой активностью по отношению и к протеиназам бактериального происхождения (Кладницкая, Валуева, Домаш и др., 1994). Необходимо отметить, что ингибиторы трипсина из белка яиц птиц не оказывают существенного внимания на протеолитическую активность грибов. Этот факт свидетельствует о высокой специфичности действия и роли растительных ингибиторов по отношению к протеиназам патогеных микроорганизмов. Подавление роста колоний грибов Alternaria alternata, поражающего многие культурные и сорные растения, наблюдалось при действии ингибиторов из семян гречихи (Дунаевский и др., 1995). Ингибитор трипсина из семян кукурузы угнетал активность протеиназы, секретируемой грибом рода Fusarium (Halim et all., 1973). Снижение протеолитической активности секретируемых патогеном протеиназ препятствует расщеплению и трансформации растительных белков и приводит к угнетению фитопатогенных микроорганизмов. Так, на
модельных опытах было показано, что ингибитор трипсина из семян кукурузы, внесенный в культуральную среду в момент инокуляции, угнетал рост шести видов грибов, проявляя наибольшую активность по отношению к F. roseum (Halim et all., 1973). Точно также ингибиторы трипсина и химотрипсина, выделенные из семян фасоли, тормозят рост и развитие грибов F. solani, F. culmorum и Botrytis cinerea (Бенкен, Мосолов, Федуркина, 1976). Ингибитор трипсина из гречихи угнетал рост мицелия и прорастание спор грибов Л. alternata и F. oxysporum (Дунаевский и др., 1994). Ингибиторы сериновой и цистеиновой протеиназ из семян риса эффективно подавляли рост гифосом возбудителя пирикуляриоза риса (Zhong-Kui, Jin-Ku, Hong et all., 1996). О направленности действия ингибиторов свидетельствуют факты присутствия в растениях белков, обладающих строгой специфичностью только к протеиназам микроорганизмов. Такие ингибиторы выделены из семян фасоли, маша, коровьего гороха, конский бобов и др. (Мосолов, Малова, Чебан, 1983; Kapur, Tan-Wilson, Wilson, 1989; Vartak, Rele, Jagannathan, 1980; Svendsen, Heigaard, Chavan, 1984). Специфические ингибиторы микробных протеиназ выделены также из семян ржи, пшеницы, тритикале (Мосолов и др., 1983; Шульгин, 1985).
Ингибиторы протеиназ в тканях растений семейства пасленовых.
К числу объектов с наибольшим содержанием ингибиторов протеиназ принадлежат многие представители семейства пасленовых (Solanaceae) (Richardson М.,1977). Особенно высоким содержанием белков-ингибиторов характеризуются клубни картофеля, где на их долю приходится до 15-20% всех водорастворимых белков (Ryan С.A. et al.,1976). Среди белков-ингибиторов, присутствующих в клубнях картофеля, обнаружены ингибиторы протеолитических ферментов различных классов-сериновых, цистеиновых и аспартильных протеиназ, а также металлсодержащих карбоксипептидаз (Garsia-Olmedo F. et al.,1987). Наибольшее число работ посвящено изучению ингибиторов сериновых протеиназ I и И. Характерной особенностью этих белков является наличие у них олигомерной структуры. Молекула ингибитора I (41кДа) состоит из пяти протомеров, имеющих молекулярную массу около 8кДа, а молекула ингибитора II (23кДа)-из двух протомеров с молекулярной массой 12кДа (Plunkett G, et al.,1982). Была охарактеризована группа белков с молекулярной массой, лежащей в пределах от 20 до 25кДа из клубней картофеля и было установлено, что некоторые из них обладают активностью ингибиторов сериновых протеиназ: трипсина, химотрипсина и субтилизина.
Данные, полученные в лаборатории института биохимии им. А.Н.Баха РАН, показали, что в клубнях некоторых сортов картофеля присутствует белок с молекулярной массой 17кДа, обладающий активностью ингибитора химотрипсина и отличающийся по ряду свойств от ранее описанных ингибиторов протеиназ из растений семейств пасленовых (Мосолов В.В., Валуева Т.А.,1993). Молекула ингибитора состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 17±1КДа, pi белка 6,8. Ингибитор взаимодействует с трипсином и химотрипсином в соотношении 1:1 (моль/моль), при этом наблюдается субстратная зависимая диссоциация комплексов фермент-ингибитор. Ингибитор не подавляет активность субтилизина и панкреотической эластазы. Способность к образованию «тройного» комплекса, содержащего одновременно одну связанную молекулу трипсина и одну молекулу химотрипсина, свидетельствует о наличии в ингибиторе двух независимых реактивных центров для этих ферментов. Ингибитор отличается от «двуглавого» ингибитора II из клубней картофеля как по величине молекулярной массы, так и по строению молекул. В последние годы в клубнях картофеля была обнаружена и охарактеризована группа белков с молекулярной массой, лежащей в пределах от 20 до 24 кДа и было установлено, что некоторые из них являются ингибиторами сериновых (трипсина, химотрипсина и субтилизина), аспартильных (катепсинаВ) и цистеиновых (папаина и катепсина L) протеиназ.
На основании особенностей первичной структуры все эти белки-ингибиторы были отнесены к суперсемейству ингибиторов протеиназ типа Кунитца (Мосолов В.В., Валуева Т.А.,1993). К этой группе относятся три белка-ингибитора с молекулярными массами 21, 22 и 23 кДа, обозначенного как PKPI (the Potato Kunitzype Proteinase Inhibitors). 21- и 22кДа-белки являются ингибиторами сериновых протеиназ, но различаются по своей специфичности. 21кДА-белок эффективно подавляет активность эластазы из лейкоцитов человека и трипсина и менее эффективно действует на химотрипсин. 22кДа-белок действует как ингибитор цистеиновых протеиназ и примерно с одинаковой эффективностью подавляет активность папаина, фицина и бромелаина. Все белки не активны по отношению к субтилизину, пепсину и катепсинуЭ. Молекула 21кДа-белка состоит из двух полипептидных цепей (16,5±1кДа), соединенных дисульфидной связью, в то время как молекулы 22- и 23кДа-белков представлены одной полипептидной цепью (Валуева Т.А., Ревина Т.А., Мосолов В.В.,1997). Тот факт, что при механическом поранении картофеля накапливаются мРНК, кодирующие PKPI, может свидетельствовать о важной роли ингибиторов этого типа в защите растений от поражения вредными насекомыми и микроорганизмами (Валуева Т.А., Ревина Т.А., Мосолов В.В.,1997).
Таким образом, ингибиторы протеолитических ферментов в тканях растений представлены весьма широким набором белковых молекул, различающихся по составу, физико-химическим свойствам, специфичности к ферментам. Такие молекулы встречаются во всех семействах царства растений.
Методы измерения активности ферментов делят на две группы: одни основаны на остановке реакции через определенные промежутки времени, в других прирост продукта или убыль субстрата регистрируются непрерывно.
В первом случае возможны два варианта: а) из реакционной среды периодически отбирают пробы, в которых (в строго фиксированные интервалы времени) реакция останавливается путем быстрой инактивации фермента; б) готовят серию параллельных проб, останавливая реакцию в них через различные интервалы времени. Методы непрерывной регистрации ферментативной активности часто основаны на том, что в ходе реакции происходит убыль или нарастание количества вещества, обладающего характерными спектральными свойствами. Таким образом измеряют активность дегидрогеназ, использующих НАДН и НАДФН.
Широкое распространение приобрели методы определения активности с использованием вспомогательных ферментов. Они основаны на том, что продукт изучаемой реакции служит субстратом вспомогательного фермента. Этот метод имеет особое преимущество в тех случаях, когда непрерывная регистрация скорости изучаемой реакции затруднена или когда продукт реакции является ингибитором исследую емого фермента.
В качестве сопрягающих ферментов часто используют дегидрогеназы и их коферменты в окисленной или восстановленной форме. Например, активность гексокиназы определяют в системе, содержащей дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата и НАДФ. Скорость восстановления НАДФ соответствует скорости гексокиназной реакции. Иногда используют системы двойного или тройного сопряжения, однако, конечным звеном такой системы является соответствующая дегидрогеназа (например, при определении активности фосфофруктокиназы, креатинкиназы).
Определение активности протеолитических ферментов
Для определения протеиназ, гидролизирующих N,a -бензоил -DL-аргинин -4- нитроанилид (БАПА) использовали метод В.Р.Эрлангера (Erlanger, Kokowski, Cohen, 1961). Активность ингибиторов трипсина и проназы Е определяли по методике Гофмана-Вайсблая с некоторыми модификациями (Гофман, Вайсблай,1975). К 0,5 мл трис-НС1-буфера добавляли 1,0 мл экстракта и 0,5 мл фермента. Затем приливали 1,0 мл раствора БАПА, после чего инкубировали на водяной бане 10 минут при 37 С, затем для прекращения реакции добавляли 0,5 мл 30% уксусной кислоты. В качестве контроля служил раствор, состоящий из 0,5 мл трис-НС1-буфера, 1,0 мл дистилированной воды, 1,0 мл экстракта, 0,5 мл 30% уксусной кислоты и 0,5 мл раствора фермента. В параллельных опытах, в которых определяли активность трипсина или проназы, вместо испытуемого раствора добавляли воду. Растворы спектрофотометрировали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 405 нм. Активность фермента с ингибиторами и без них определяли по формуле: А - активность ферментов (ИЕ/мл), Егр. - экстинция трипсина / химотрипсина / проназы, Еоп. - экстинция опытного раствора, V - объем инкубационной смеси, V,- объем ферментного раствора (мл), t - время протеолиза (мин.). Активность фермента выражали в ингибиторных единицах (ИЕ). В стандартных условиях за единицу ингибиторной активности принимали такое его количество, которое необходимо для подавления единицы активности трипсина на 100%.
Для определения концентрации белка в растворах использовали метод М. Бредфорд (M.Bradford, 1976). 100 мг красителя Кумасси голубого G-250 растворяли в 50 мл этанола, приливали 100 мл 85% фосфорной кислоты, 20 мл соляной кислоты; доводли дистилированной водой до 1,0 литра. К 1 мл раствора белка добавляли 1 мл реактива и определяли оптическую плотность при 590 нм. Контролем служил раствор, содержащий 1,0 мл дистилированной воды и 1,0 мл красителя. Калибровочную кривую для определения концентрации белка строили по а-химотрипсину. ри обработке данных использовалась программа Microsoft Excel. Среднюю арифметическую (Хср) вычисляли по формуле: где Хср - абстрактная характеристика всей совокупности в целом, Х-значение текущих измерений, п - общее число измеренных значений. Стандартное или среднее квадратичное отклонение (s) вычисляли по формуле: Среднюю арифметическую ошибку рассчитывали по формуле: Уровень достоверного отличия (Т-критерий) определяли по формуле:
Активность ингибиторов трипсина в прорастающих клубнях картофеля
Растения семейства пасленовых характеризуются высокой активностью ингибиторов протеиназ в тканях картофеля. Наибольшая активность ингибиторов обнаруживается в клубнях этого растения. Особенно высоким содержанием белков-ингибиторов характеризуются клубни картофеля, где на их долю приходится до 15-20% всех водорастворимых белков (Ryan С.А. etal.,1976). Среди белков-ингибиторов, присутствующих в клубнях картофеля, обнаружены ингибиторы протеолитических ферментов различных классов - сериновых, цистеиновых и аспартильных протеиназ, а также металлсодержащих карбоксипептидаз (Garsia-Olmedo F. et al.,1987). В таблице 3 представлены наши данные об активности ингибиторов трипсина в прорастающих клубнях. Для определения активности ингибиторов трипсина использовали два субстрата различного типа: синтетический субстрат БАПА и белок желатин. Как видно, исследованные сорта характеризуются неодинаковым уровнем ингибиторной активности в клубнях. Наибольшая активность этих ингибиторов выявлена у сорта Белореченский (в расчете на сырую массу клубней). Низкой активностью ингибиторов трипсина обладают клубни сортов Невский, Гатчинский, Ева. Однако, вследствие низкого содержания растворимого белка в клубнях сорта Ева, удельная активность ингибиторов в клубнях этого сорта определяется на высоком уровне. Как видно из таблицы, в клубнях сорта Ева удельная активность ингибиторов самая высокая из исследованных нами сортов. Низкой удельной активностью ингибиторов трипсина обладают клубни сортов Невский, Луговской, Акросия.
По удельной активности ингибиторов трипсина в клубнях исследуемые сорта картофеля можно разделить на 3 группы: 1 - с высокой активностью ингибиторов (Ева, Ашкадар, Фреско, Белореченский), 2 - со средними значениями активности ингибиторов (Пригожий, Тулунский, Уральский ранний, Сантэ), 3-е низкой активностью (Томич, Акросия, Пушкинец, Луговской, Невский, Гатчинский). Уровень активности ингибиторов трипсина в клубнях исследованных сортов картофеля коррелирует с показателем их устойчивости к действию патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Большой интерес в практическом плане представляет исследование активности ингибиторов протеиназ в вегетирующих органах, т.к. личинки колорадского жука питаются, в первую очередь, листьями картофеля. На рисунке 12 представлены данные об активности ингибиторов трипсина в проростках картофеля на разных этапах развития (2-5 см, 15-20 см, 30-40 см). Видно, что активность ингибиторов в проростках значительно (в 5-10 раз) ниже, чем в покоящихся клубнях. При исследовании молодых проростков (2-5 см) оказалось, что на данном этапе развития наибольшей активностью ингибиторов трипсина обладает устойчивая к колорадскому жуку линия 089-5 (1,68 ИЕ/г массы ткани), затем следует среднеустойчивый Пушкинец (0,93 ИЕ/г массы). Активность ингибиторов трипсина сортов Гатчинский, Лиу и линии 1-3-1 определяется примерно на одном уровне. Неустойчивый сорт Невский характеризуется низкой активностью данных ингибиторов в проростках в изучаемый период. .
При изучении следующего этапа развития проростков (15-20 см) ситуация меняется. Высокая активность ингибиторов наблюдается у сорта Гатчинский (1,52 ИЕ/г массы ткани). Средние позиции занимают сорта Лиу и линия 1-3-1. У остальных сортов активность ингибиторов триписна значительно ниже, примерно 0,6 ИЕ/г массы ткани. При длине проростков 30-40 см содержание ингибиторов протеолитических ферментов значительно ниже по отношению к более молодым проросткам. Разница между сортами по ингибиторной активности невелика и варьирует в пределах 0,32-0,66 ИЕ/г массы ткани. Наибольшая удельная активность определяется у проростков сорта Гатчинский (8,99 ИЕ/г белка), а наименьшая - у линии 089-5 (1,27 ИЕ/г белка). В ранний период развития проростков высокой активностью ингибиторов фермента проназы Е (рис. 13) характеризуются линия 1-3-1 и сорт Невский. Остальные сорта характеризуются невысокой активностью ингибиторов проназы и по этому показателю различаются между собой незначительно (0,94-1,4 ИЕ/г массы ткани). Изученные сорта сильно различаются по осдержанию белка. Соответственно, соотношение удельной активности ингибиторов в проростках другое, чем по активности в расчете на массу ткани. По удельной активности ингибиторов проназы Е выделяется сорт Пушкинец (34,7 ИЕ/г белка) и линия 089-5 (21,6 ИЕ/г белка). У других исследованных сортов удельная активность ингибиторов проназы Е примерно одинаковая. В проростках среднего возраста (15-20 см) наибольшей активностью ингибиторов проназы Е обладает сорт Пушкинец (1,45 ИЕ/г массы), наименьшей - Невский (0,6 ИЕ/г массы ткани). Такая закономерность прослеживается и при изучении удельной активности ингибиторов проназы Е в проростках. В проростках более позднего возраста (30-40 см) высокая активность ингибиторов проназы Е характерна для линии 089-5 (0,93 ИЕ/г массы ткани) и сорта Пушкинец (0,85 ИЕ/г массы ткани). У остальных исследованных сортов антипроназная активность составляет 0,4 ИЕ/г массы ткани. По удельной активности ингибиторов проназы выделяется сорт Пушкинец с показателем активности 13,27 ИЕ/г белка. Активность ингибиторов проназы Е остальных сортов значительно ниже вышеперечисленных и примерно одинакова.
