Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биохимические механизмы устойчивости растений картофеля к неблагоприятным факторам окружающей природной среды (обзор) 8
1.1. Избыточная и недостаточная влажность. Осмотический шок 11
1.2. Воздействие повышенной и пониженной температуры 16
1.3. Повреждение вредителями
1.3.1. Механическая защита листьев картофеля 27
1.3.2. Участие вторичных метаболитов в формировании устойчивости к вредителям 29
1.3.3. Иммунологическая реакция растений картофеля 36
1.3.4. Участие факторов белковой природы в формировании комплекса устойчивости раст&нйй к болезням и вредителям 37
1.3.5. Устойчивость трансгенных растений картофеля 46
1.3.6. Сравнительная оценка степени устойчивости растений картофеля к листогрызущим насекомым 48
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Материалы 53
2.1.1. Характеристики исследованных образцов растений картофеля 53
2.1.2. Жизненный цикл и характеристики популяций колорадского жука 59
2.1.3. Методика постановки эксперимента 63
2.2. Методы 67
2.2.1. Исследование белков картофеля методом электрофореза в полиакриламидном геле 67
2.2.1.1. Получение экстракта нативных водорастворимых белков из тканей картофеля 68
2.2.1.2. Электрофоретический анализ нативных белков из клубней картофеля 70
2.2.1.3. Электрофоретический анализ денатурированных белков из клубней и листьев картофеля 73
2.2.1.4. Электрофоретический анализ белков-ингибиторов протеиназ из клубней и листьев картофеля 76
2.2.1.5. Обработка и фотодокументирование результатов электрофореза
2.2.2. Количественная оценка содержания гликоалкалоидов в клубнях и листьях картофеля 79
2.2.3. Количественная оценка активности ингибиторов протеиназ из клубней и листьев картофеля 81
2.2.4. Определение содержания адреналина у имаго колорадского жука 84
Глава 3. Динамика содержания гликоалкалоидов в листьях и клубнях картофеля и её связь с устойчивостью к колорадскому жуку 85
3.1. Результаты 85
3.2. Обсуждение 94
Глава 4. Стрессовые белки как факторы устойчивости растений картофеля к колорадскому жуку
4.1. Результаты 109
4.2. Обсуждение 144
Заключение 130
Выводы 134
Список литературы 1
- Механическая защита листьев картофеля
- Характеристики исследованных образцов растений картофеля
- Количественная оценка содержания гликоалкалоидов в клубнях и листьях картофеля
- Количественная оценка активности ингибиторов протеиназ из клубней и листьев картофеля
Механическая защита листьев картофеля
Оптимальный уровень содержания влаги в почве - важный агрономический фактор, во многом определяющий урожайность картофеля. Вместе с тем, биологическое действие этого фактора на растения, чаще всего, оказывается двояким. В частности, избыточная влажность, с одной стороны, затрудняет терморегуляцию растений путем испарения влаги с поверхности листа, с другой стороны, подвергает растения осмотическому шоку вследствие изменения концентрации солей в клеточном соке.
Характер воздействия повышенной температуры и механизмы адаптации к ней, происходящие в растении, мы рассмотрим ниже, в специальном разделе нашего обзора. Сейчас более подробно остановимся на явлении осмотического шока.
Исследование физиолого-биохимической природы адаптации растений к неблагоприятным факторам среды, в основном, проводят на культурах клеток и растений in vitro. Использование этих объектов позволило выявить ряд фундаментальных механизмов осмоустоичивости у растений, включающий: 1) конформационную устойчивость структурных белков и ферментов к действию электролитов; 2) локализацию избытка ионов в метаболически относительно инертных компартаментах, например, вакуолях, или исключение ионов из клетки; 3) накопление в цитоплазме нетоксичных для ферментов метаболитов, поддерживающих осмотический баланс между цитоплазмой и вакуолью, либо цитоплазмой и межклеточной жидкостью, а также выполняющих протекторную функцию в отношении ферментов клетки [Хочачка, Сомеро, 1988; Martinez, Moreno, 1992].
Сразу следует указать на то, что природная конформационная устойчивость белков к действию электролитов или модификация белков и ферментов in vivo для придания молекуле полипептида устойчивости к действию высоких концентраций солей характерны лишь для узкого круга видов растений-галофитов, т.е. тех видов растений, для которых высокая концентрация солей в почве (или воде для морских растений) является необходимым условием нормального роста, а не стрессовым фактором [Хочачка, Сомеро 1977]. Поскольку картофель не относится к галофильным растениям, данный механизм осмоустойчивости, по видимому, для него не характерен, и как правило, не учитывается при исследовании природы адаптации картофеля к повышенному содержанию солей в почве и селекции картофеля на осмоустойчивость.
Напротив, такие явления как компартментация избытка растворенных веществ внутри клеток или выведение их из клетки значительно чаще встречаются у растительных организмов, и более подробно обсуждаются в литературе [Yeo et al, 1987; Cramer et al., 1989; Boursier et al., 1987; Boursier, Lauchli, 1989]. В результате удаления избытка ионов из цитоплазмы путем активного транспорта, ферменты основного обмена не испытывают прямого воздействия солей, и растение целиком становится осмоустойчивым.
Функционирование механизмов компартментации или выведения избытка солей из клетки контролируется рядом генов, специфичных для транспорта прежде всего ионов Na+, К+ и СГ. Хотя существование таких генов у многих, в том числе, негалофильных растений, таких как томат и соя, экспериментально доказано [Boursier, Lauchli, 1989; Таї, 1985; Shalata, Таї, 1998], нам неизвестны публикации о такого рода механизме адаптации и значимости его для формирования осмоустойчивости у картофеля.
Кроме компартментации ионов и исключения их из фотоассимилирующих и репродуктивных органов растения, в растительной клетке существует еще один механизм осмоустойчивости, который состоит в накоплении цитоплазмой нетоксичных для ферментов низкомолекулярных соединений (пролин, бетаины, полиолы, глицерин, сахара и пр.), выполняющих осморегуляторную и протекторную функции.
Полезное физиологическое значение низкомолекулярных метаболитов, способных быстро накапливаться в клетке в экстремальных условиях, определяются рядом присущих им физико-химических свойств и нетоксичностью в высоких концентрациях (до 1М) [Martinez, Moreno, 1992]. Это можно хорошо видеть на примере пролина, наиболее изученного к настоящему времени осмопротектора.
Пролин в растительной клетке выступает как протектор стерической структуры биополимеров и гидратационой сферы белков, регулятор активности воды и компонент осморегуляторных механизмов, регулятор эластических свойств протоплазмы в составе пролин- и оксипролинсодержащих гликопептидов, и наконец, как источник энергии и азота в постстрессовый период [Шевякова и др., 1998; Кузнецов, Шевякова, 1999].
Динамика концентрации пролина в растительной клетке, подвергнутой воздействию повышенной концентрации солей, и в процессе реадаптации к оптимальным условиям, а также пути биосинтеза и биодеградации пролина наиболее подробно были изучены на культурах солеустойчивых линий одноклеточных водорослей и клеток высших растений - излюбленных объектах исследования физиологов и биохимиков растений. Показано, что накопление свободного пролина может происходить путем его биосинтеза из глутаминовой кислоты (вследствие активации глутаматфосфотрансферазы - первого фермента цепи биосинтеза пролина, локализованного в цитоплазме), орнитина (у солеустойчивой линии Nicotiana sylvestris) [Ахметова, Шевякова, 1993], а также через гликолатный путь (у пресноводной и морской хлореллы) [Алябьев, 1996]. Кроме того, сверхпродукция пролина в клетке поддерживается торможением его деградации окислительными ферментами внешней мембраны митохондрий.
На картофеле, экспериментальных работ подобного рода проведено значительно меньше, однако, показано, что в клетках растений in vitro (каллусная культура ткани, растения-регенераты), также как и у одноклеточных водорослей, пролин, некоторые другие аминокислоты и соответствующие им амиды способны накапливаться в цитоплазме в ответ на воздействие повышенной концентрации солей [Герасимова и др., 1988; Маханько и др., 1997].
Данные о содержании в тканях картофеля свободных аминокислот и их амидов, а по другим литературным данным - полиаминов, стресс-белков, качественном составе изоформ защитных (адаптационных) ферментов, таких как пероксидаза, предлагается использовать в качестве маркеров осмоустойчивости на уровне каллусных культур или растений in vitro [Герасимова и др., 1988; Сулейманова и др., 1989].
Характеристики исследованных образцов растений картофеля
Переходя к рассмотрению защитной роли белковых факторов, обладающих ингибиторной активностью в отношении протеолитических ферментов, следует указать на тот факт, что, несмотря на огромное количество экспериментальных данных, истинная биологическая функция этих белков остается до конца не выясненной.
Среди растительных объектов на первом месте по содержанию ингибиторов стоят семена бобовых, среди которых особенно выделяются бобы сои. Не удивительно, что именно эта культура послужила объектом, из которого впервые, в 1946-1947 г.г. Кунитцем был выделен, очищен и охарактеризован ингибитор трипсина [Kunitz, 1947].
Кроме бобовых, ингибиторы протеолитических ферментов обнаружены в семенах растений других семейств, например, злаков (рожь, пшеница, ячмень) и сложноцветных (латук), а также и в вегетативных органах растений - листьях и стеблях [Мосолов, 1971].
В клубнях картофеля также содержится ряд белков, обладающих способностью подавлять активность модельных протеолитических ферментов. Отдельные ингибиторы различаются между собой как по своим физико-химическим характеристикам, так и по специфичности в отношении разных протеиназ.
Сохони и Амбе были первыми, выделившими очищенный препарат ингибитора трипсина из клубней картофеля [Sohonie, Ambe, 1955]. Позже Хохштрассер и др. выделили из клубней картофеля адсорбцией на трипсиновой смоле целый ряд белков, обладавших антитриптической активностью. Ингибиторы с молекулярной массой 24 кДа подавляли также активность плазмина, химотрипсина и калликреина плазмы [Hochstrasser, Werbe, 1969]. В 1963 году Болз и Риан получили из сока клубней картофеля препарат ингибитора, который отличался специфичностью к химотрипсину, полностью подавляя как протеолитическую, так и эстеразную активность этого фермента. Кроме того, ингибитор Болза и Риана подавлял протеолитическую (но не эстеразную) активность трипсина, активность субтилопептидазы А и в то же время оказался неактивен в отношении пепсина, фицина, бромелаина и реннина [Balls, Rian, 1963].
Среди различных ингибиторов, выделенных из клубней картофеля, особый интерес представляет собой полипептид с молекулярной массой 3000-4000, полученный в очищенном состоянии Рэнкауэром и Рианом в 1968 году [Rancour, Ryan, 1968]. Это соединение подавляет активность карбоксипептидазы В, и является первым ингибитором фермента типа пептидазы белковой природы, описанным в литературе.
С введением в практику биохимии современных методов гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и изоэлектрофокусирования, возможности исследователей в области выделения и очистки белков существенно расширились.
Сравнительно недавно (в 1995-1997 г.г.) группой сотрудников института биохимии им. А.Н. Баха под руководством В.В. Мосолова были выделены и охарактеризованы сразу несколько новых ингибиторов из клубней картофеля [Ревина и др., 1995; Валуева и др., 1997]. Три из них, с молекулярной массой от 20 до 24 кДа, на основании сходства первичной структуры и функций, отнесены к семейству ингибиторов протеиназ типа соевого ингибитора Кунитца (в англоязычной литературе - the Potato Kunitzipe Proteinase Inhibitors, - РКРІ). Белок 21 кДа, состоящий из двух полипептидных цепей 16,5 и 4,5 кДа, является сильным ингибитором лейкоцитарной эластазы, трипсина и химотрипсина, но не действует на субтилизин. 22 кДа-белок является специфическим ингибитором трипсина и не активен в отношении субтилизина и цистеиновых протеиназ. В свою очередь, белок 23 кДа -мощный ингибитор цистеиновых протеиназ [Валуева и др., 1997].
Другой белок с молекулярной массой 17 кДа, обладает активностью ингибитора трипсина и химотрипсина, но не действует на субтилизин и панкреатическую эластазу. По ряду признаков, отличающих этот полипептид от уже описанных в литературе, он пока не может быть отнесен к определенному семейству, и, по-видимому, является новым, ранее не описанным в литературе, ингибитором сериновых протеиназ [Ревинаидр., 1995].
Исследование качественного состава ингибиторов, активных в отношении какой-либо одной протеиназы, показало, что спектры "множественных форм" ингибиторов из клубней разных видов картофеля отличаются значительным разнообразием и не только видо-, но и сортоспецифичны. На этом основании даже предложено использовать электрофоретические спектры ингибиторов протеиназ, особенно ингибиторов трипсина и химотрипсина, в качестве паспортной характеристики определенного сорта картофеля [Ромашкин и др., 1988; Reda et al., 1992; Конарев, 1997].
Количественная оценка содержания гликоалкалоидов в клубнях и листьях картофеля
Сравнительное изучение жуков разных популяций и форм рисунка переднеспинки по ряду биологических показателей, включая реакции на различные сорта картофеля и томата, свидетельствуют о том, что внешние признаки колорадского жука в определенной степени взаимосвязаны с эколого-физиологическими адаптациями его внутривидовых и внутрипопуляционных форм. Очевидно, что среди последних имеются формы с различиями пищевых адаптации на уровне видов и сортов кормовых растений Устойчивые же различия фенотипической структуры (фенооблика) основных групп популяций вида отражают, таким образом, характерное для них соотношение внутривидовых форм, определяющее биологическую специфичность разных популяций и популяционных комплексов колорадского жука [Фасулати, 19876; 1993; Фасулати, Епенкова, 1995].
В своей работе мы использовали имаго первого летнего поколения колорадского жука, собранных в полевых условиях на посадках культурного картофеля (Смоленская обл., Гагаринский р-он). Для того, чтобы избежать нежелательного для нашей работы проявления полиморфизма природных популяций колорадского жука и соответствующих им особенностей пищевой специализации, мы старались отбирать жуков, полностью идентичных по рисунку переднеспинки, причем, для проведения разных вариантов эксперимента были взяты следующие основные фенооблики жука: 1 - пятна А и В слиты, точка Р ярко выражена, рисунок симметричный; 2 - рисунок несимметричный (пятна А и В разделены слева или справа); 3 - пятна А и В разделены, рисунок симметричный.
Поскольку различия по эколого-физиологическим характеристикам (в том числе, - по пищевым адаптациям) колорадского жука отражается в основном на расположении и форме пятен А и В, мы иногда (в случае недостаточного числа особей жука с полностью идентичным фенообликом) допускали примешивание к типу 2 типов 5 и 8, а также к типу 3 - типа 6, что в целом не может существенно отразиться на результатах эксперимента.
Отобранных особей имаго колорадского жука, группами по 6-8 шт. подсаживали на листья четырех - пяти верхних ярусов индивидуальных растений картофеля. Для того чтобы избежать свободного перемещения жуков, их заключали в садки из тонкой капроновой сетки, укрепленные у основания листа. За подсаженными жуками периодически наблюдали, и удаляли их с растения после того, как жуки уничтожали приблизительно 1/3 часть всей площади листовой пластинки (обычно для этого требовалось около 16-20 часов, для дикорастущих видов картофеля меньше, т.к. площадь их листа значительно меньше, чем у культурных образцов). Немедленно после этого жуков умерщвляли и использовали для количественного определения адреналина (ниже, п. 2.2.3).
Часть поврежденного жуками листа срезали ножницами через 1, 3 и 5 суток после начала эксперимента. Для характеристики специфичности повреждений, наносимых колорадским жуком, сравнивали результаты биохимического анализа индивидуальных растений, поврежденных разными фенотипами колорадского жука (серия опытов №1) и механически поврежденных листьев другого растения (опыт №2). В последнем случае повреждения наносили искусственно, постепенно надрезая край листа ножницами в течение среднего срока экспозиции в серии опытов №1.
Контролем, отобранным одновременно с поврежденными листьями, служили, во-первых, неповрежденные листья индивидуальных растений, участвовавших в опытах 1 и 2 (контрольная серия №1), во-вторых, листья с неповрежденных растений (контроль №2). Для чистоты эксперимента на всех контрольных листьях и листьях в опыте №2 также были укреплены капроновые садки (без жуков!).
Собранные листья помещали в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу для транспортировки в лабораторию, и не позднее чем через 2 часа приступали к фиксации собранного материала и выделению из него экстрактов белков и гликоалкалоидов (ниже, п.п. 2.2.1.1 и 2.2.2). Клубни контрольных и экспериментальных растений, поврежденных колорадским жуком, извлекали из ящиков с грунтом после полного пожелтения листьев у всех сортообразцов и видов картофеля, очищали от земли, промывали и также использовали для экстракции белков и гликоалкалоидов. Контролем служили клубни, образованные неповрежденными растениями. Сведения о количестве экспериментальных растений, использованных во всех сериях опытов и контролей, каждого из исследованных образцов приведены в таблице 2.1.
Количественная оценка активности ингибиторов протеиназ из клубней и листьев картофеля
По данным литературы, среди всех гликоалкалоидов культурного картофеля явно доминируют а-соланин и а-хаконин (триазиды) [Jonasson, Olsson, 1994а; 1994b; Bergenstrahle, 1995]. На тот же факт указывают авторы методики, с помощью которой мы определяли общее содержание соланина и хаконина в различных образцах тканей картофеля [Тукало, Царик, 1970]. В тоже время у дикорастущих видов картофеля не только присутствуют, но могут и преобладать другие стероидные гликоалкалоиды, например, лептин, соланокарденин, демиссин, а также а-томатин, который достаточно широко распространен и среди сортов S. tuberosum [Методические рекомендации..., 1993]. Будет ли корректно считать, что использованная нами методика позволяет определять содержание всех стероидных гликоалкалоидов, имеющихся у растения?
С одной стороны, калибровочная кривая, которой мы пользовались для расчета концентрации гликоалкалоидов по величине поглощения (ДАш) хлороформного экстракта окрашенного комплекса с метиловым оранжевым, была составлена нами по соланидину, использованному в качестве стандарта. Таким образом, строго говоря, данная методика позволяет определять только соланин и хаконин, агликоном которых и является соланидин.
С другой стороны, структура агликона разных гликоалкалоидов в целом очень близка, а стероидная часть молекулы (она участвует в гидрофобном взаимодействии с метиловым оранжевым) и вовсе одинакова [Bergenstrahle, 1995]. Специфические свойства гликоалкалоидов обусловлены, прежде всего, химической структурой углеводной части молекулы, её качественным и количественным составом [Rayburn et al., 1994], однако, гидролиз углеводного "хвоста" гликоалкалоидов (три- и тетразидов), предусмотренный данной методикой, и приводящий к образованию свободного агликона, должен, таким образом, полностью нивелировать исходные различия между гликоалкалоидами. По этим причинам результаты количественного определения разных гликоалкалоидов не должны существенно зависеть от их молекулярной структуры, а тем более от происхождения и физиологических свойств.
Тукало и Царик в своей методической статье не оговаривают возможности применения их методики для определения всего разнообразия гликоалкалоидов, однако составители "Методических рекомендаций..." [1993] успешно применяли данную методику для определения а-томатина. Мы, в свою очередь, на основании вышеизложенных соображений будем считать, что с помощью методики Тукало и Царика определяли в тканях картофеля "общее содержание гликоалкалоидов" вне зависимости от того, каким был исследуемый вид картофеля и какой гликоалкалоид у него доминирует.
Остановимся теперь на обсуждении возможной роли гликоалкалоидов в механизме формирования устойчивости растений картофеля к колорадскому жуку. Токсические свойства, которыми обладают эти биологически активные вещества в отношении насекомых, признаются сейчас очень многими авторами.
Специальными исследованиями установлено, что гликоалкалоиды картофеля способны ингибировать ацетилхолинэстеразу, что существенно затрудняет проведение нервного импульса и блокирует координирующую деятельность центральной нервной системы, в том числе и у насекомых [Bushway et al, 1987]. В другой работе на нескольких модельных объектах (суспензионные культуры эритроцитов кролика, клеток корня свеклы и протопластов Penicillium notatum Westling) показано, что в определенной концентрации гликоалкалоиды вызывают лизис клеток, причем хаконин в этом смысле оказался почти на порядок токсичнее соланина. Авторы данной работы предполагают, что гликоалкалоиды изменяют проницаемость клеточных мембран, встраиваясь в них вместо каких-то специфичных стероидных соединений [Roddick et al., 1988].
Что же касается колорадского жука и насекомых вообще, то использование ими некоторых чужеродных стероидов (например, (3-ситостерина), поступающих с пищей, для создания собственных клеточных элементов (в основном, стеринов) является скорее нормой из-за неспособности синтезировать стерины и, в частности, холестерин самостоятельно [Гилмур, 1968]. В то же время, включение в этот процесс других источников стероидной структуры, таких как стероидные алкалоиды и гликоалкалоиды, может иметь совсем иные, нежелательные и даже фатальные последствия для метаболизма.
Об этих, а возможно, ещё каких-то других негативных последствиях, и свидетельствует, по всей вероятности, повышение уровня адреналина у особей колорадского жука, питавшихся на устойчивых образцах картофеля.
