Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Механизмы адаптации растений к засухе 10
1.1.1. Засуха и ее отрицательное воздействие на растения 10
1.1.2. Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам среды 12
1.1.2.1. Эволюционные (конститутивные) механизмы адаптации растений (ксерофитов) к засухе 13
1.1.2.2. Стресс-индуцируемые механизмы адаптации растений к засухе 16
1.1.2.2.1. Физиологические механизмы адаптации растений к засухе 17
1.1.2.2.2 Молекулярные механизмы адаптации 21
1.2. Окислительный стресс 24
1.2.1. Общие представления об окислительном стрессе 24
1.2.2. Активные формы кислорода (АФК) и основные пути их образования 25
1.2.3. Действие АФК на растительную клетку 27
1.2.4. Антиоксидантные системы растений 29
1.3. Биологические особенности яровой пшеницы 32
1.3.1 Особенности формирования элементов продуктивности у пшеницы в процессе онтогенеза 32
1.3.2 Условия произрастания пшеницы 33
1.3.3. Потребность пшеницы во влаге и засухоустойчивость. 37
1.4. Аллоцитоплазматическая пшеница 39
1.4.1. Внехромосомная наследственность 39
1.4.2. Взаимодействие между ядерной, пластидной и митохондриальной генетическими системами 41
1.4.3. Роль внеядерной наследственности у пшеницы 43
1.4.4. Влияние яд ерно-цито плазматических взаимодействий на проявление адаптивных и хозяйственно ценных признаков 48
1.4.4.1. Самофертильная аллоцитоплазматическая пшеница Т. aestivum L. на цитоплазме Aegilops ovaia 52
1.4.4.2. Самофертильная аллоцитоплазматическая пшеница Т. aestivum L. на цитоплазме Secale cereale 56
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 58
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 67
3.1. Действие почвенной засухи на растения 68
3.1.1. Динамика роста растений в оптимальных условиях и при действии засухи 68
3.1.2. Водный статус растений в оптимальных условиях и при действии засухи 71
3.1.2.1. Уровень оводненности тканей листьев 71
3.1.2.2. Влияние засухи на степень насыщенности листьев водой 75
3.1.2.3. Интенсивность транспирации растений 77
3.1.3. Аккумуляция свободного пролина в листьях растений пшеницы в оптимальных условиях и при действии засухи 80
3.1.4. Засуха как индуктор окислительного стресса у растений 83
3.1.4.1. Активность свободной и ион-связанной форм пероксидазы в оптимальных условиях и при действии засухи 83
3.1.4.2. Интенсивность перекисного окисления липидов в листьях растений в оптимальных условиях и при действии засухи 86
3.2. Реализация репарационных возможностей на этапе восстановления растений после воздействия засухи 91
3.2.1. Восстановление водного статуса растений 91
3.2.2. Репарация роста растений 94
3.2.3. Использование пролина в ходе репарационных процессов 94
3.2.4. Репарация окислительного стресса 91
3.3. Действие интенсивной почвенной и воздушной засухи 99
3.3.1. Действие интенсивной засухи на рост и листовую поверхность 101
3.3.2. Фотосинтез при засухе и в период репарации 103
3.3.3. Дыхание при засухе и в период репарации 106
Заключение 109
Выводы 114
Список литературы 116
- Эволюционные (конститутивные) механизмы адаптации растений (ксерофитов) к засухе
- Взаимодействие между ядерной, пластидной и митохондриальной генетическими системами
- Аккумуляция свободного пролина в листьях растений пшеницы в оптимальных условиях и при действии засухи
- Действие интенсивной засухи на рост и листовую поверхность
Введение к работе
Полноценное питание людей, их здоровье, источники энергии — три основные проблемы, решение которых волнует все человечество.
Пшеница, важнейший хлебный злак Земного шара, является одной из самых древних и самых важных продовольственных культур, ее выращивают более чем в 80 странах. По данным FAO (1994), по площади пшеница занимает 216 млн. га, что составляет 29,1 % посевов зерновых культур в мире при средней урожайности 24,5 ц/га.
Пшеница (род Triticum L.) относится к порядку Poales) семейству Роасеае. Все многообразие диких и культурных пшениц представлено 22 видами. В сельскохозяйственном производстве распространены два вида пшеницы - мягкая и твердая. Главное ее достоинство - высокая питательная ценность хлеба, хлебобулочных, макаронных и крупяных изделий, получаемых из пшеничной муки. В зерне пшеницы удачно сочетаются необходимые для человека белки, углеводы, жиры, витамины, ферменты, минеральные вещества.
В России пшеница - основная продовольственная культура, имеет широкое распространение, начиная с южных границ и почти до 65 северной широты (Архангельская область). Однако, основные площади возделывания размещены в хозяйствах Краснодарского, Ставропольского края, Ростовской области и Центрально-черноземных областях. Но именно эти районы наиболее подвержены действию такого неблагоприятного фактора как засуха, которая оказывает негативное воздействие на растения (Алпатьев, Иванова, 1958; Генкель, 1975). Для того чтобы поддерживать более высокий уровень производства данной культуры в условиях дефицита воды, необходимо исследовать физиологические причины снижения ее продуктивности в засушливом климате.
Глобальные изменения климата, приобретающие все более выраженный характер под влиянием перманентно усиливающихся антропогенных
воздействий, становятся в настоящее время фактором, ограничивающим продуктивность ведущих сельскохозяйственных культур. Использование лучших, высокоурожайных сортов и применение эффективной технологии сельскохозяйственного производства ориентировано на то, чтобы гарантировать стабильную продуктивность, приближающуюся к потенциальным величинам используемых сортов, в условиях непредсказуемых изменений климата и техногенного воздействия человека на среду обитания. В этой ситуации на первый план выступает проблема адаптации сельскохозяйственных культур к неблагоприятным экологическим условиям (Жученко, 1988).
В течение многих лет в России и в мире ведется активная селекционная работа по выведению засухоустойчивых сортов. Для засухоустойчивых сортов при недостатке влаги характерны пониженный осмотический потенциал и высокая водоудерживающая способность. В ответ на водный дефицит обнаружена большая стабильность хлорофилла, меньшие параметры изменения обмена веществ и более высокая устойчивость белоксинтезирующей системы. Способность корневой системы адаптироваться к росту в условиях низкой относительной влажности почвы также характерна для засухоустойчивых сортов пшеницы (Лосева, Петров-Спиридонов, 1993).
Важным, а иногда и определяющим свойством, является способность растений при восстановлении водоснабжения активно репарировать вызванные засухой повреждения. Существенное значение имеют также анатомические особенности растений, развитие корневой системы, продолжительность вегетационного периода сорта, ритм его роста и развития в связи с преобладающим в том или ином районе типами засух (Кожушко, 1988).
Изучение механизмов устойчивости может дать важную информацию для долгосрочного селекционного процесса культурных растений (May, Milthorpe, 1962; Turner, 1979). В настоящее время выведено большое число
7 засухоустойчивых сортов пшеницы (Кумаков, 1985; Головиченко, 1998), однако расширение адаптационных возможностей может быть достигнуто не только методами традиционной селекции, но и путем создания новых генетических систем в форме гибридов аллоцитоплазматической пшеницы. Аллоцитоплазматические гибриды пшеницы (АЦГЛГ), полученные методом возвратных скрещиваний и отбором, представляют собой новый синтетический тип растений, у которых ядро T.aestivum нормально (без ЦМС) функционирует в чужеродной цитоплазме (диких злаков или ржи) (Kihara, Tanaka, 1970; Kihara, 1982).
Известно, что генетические системы цитоплазмы играют значительную роль в детерминации свойства устойчивости растений и обусловливают уровень адаптивной реакции на меняющиеся условия среды (Медведева, Семенов, 1969; Семенов, 2000). В то же время ядерные и цитоплазматические геномы (митохондрий и хлоропластов) представляют собой комплементарные генетические системы клетки, тесно взаимодействующие между собой и со средой обитания.
Эти системы контролируют проявление многих хозяйственно ценных признаков в онтогенезе растений и служат потенциальными «вкладчиками» в их генотипическую изменчивость. Поэтому все большее внимание исследователи уделяют изучению ядерно-цитоплазматических взаимодействий как с позиции цитоплазматическоЙ уязвимости культивируемых растений, так и в связи с возможностью получения гибридов, отличающихся более высоким уровнем морфофизиологических реакций в условиях действия абиотических факторов. Таким образом, гибриды аллоцитоплазматической пшеницы с различными типами цитоплазмы представляют собой с одной стороны, удобный модельный объект для изучения сложных процессов регулирования экспрессии генома растений, с другой — имеют важное селекционное значение как доноры хозяйственно-ценных признаков, обусловленных ядерно-цитоплазматическим взаимодействием.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в проведении сравнительного анализа устойчивости к засухе растений двух АЦПГ пшеницы на цитоплазме ржи и на цитоплазме эгилопса с растениями стандартных сортов пшеницы, выяснении физиологических основ возможных различий, прежде всего повышенной устойчивости той или иной формы к действию стрессора.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Выявить различия ответных реакций растений изучаемых форм на действие засухи, а также исследовать их поведение в ходе репарации.
Изучить такие интегральные показатели как рост растений, накопление биомассы и основной газообмен.
Оценить влияние стрессорного фактора на состояние водного статуса изучаемых форм растений.
В качестве неспецифической ответной реакции на засуху исследовать некоторые показатели окислительного стресса.
Научная новизна. В условиях вегетационных и модельных опытов впервые сопоставлена засухоустойчивость двух АЦПТ пшеницы на цитоплазме ржи и на цитоплазме эгилопса с растениями стандартных сортов пшеницы. Впервые проведено обширное исследование действия засухи на некоторые физиологические и биохимические процессы (рост, газообмен, водный статус, аккумуляцию совместимых осмопротекторов, активность антиоксидантных ферментов) в растениях изучаемых форм пшеницы.
Практическая значимость. Исследованные формы
аллоцитоплазматических гибридов могут быть использованы в качестве доноров устойчивости (засухоустойчивость) в селекции яровой пшеницы, а также в непосредственном их использовании в зонах аридного земледелия. Совокупность полученных экспериментальных данных и сделанные на их основе обобщения о механизмах адаптации могут использоваться в курсах лекций для студентов сельскохозяйственных и биологических факультетов университетов и вузов страны.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Результаты исследований были представлены на международном симпозиуме "Plants under Environmental Stress" (Москва, 2001), на V съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), на заседаниях кафедры ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии РУДН, на научных семинарах Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной частей, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 14 рисунков и 13 таблицы. Список литературы состоит из 173 источников, в том числе 108 зарубежных авторов.
Эволюционные (конститутивные) механизмы адаптации растений (ксерофитов) к засухе
Эволюционные адаптации растений к условиям засухи шли по пути формирования следующих механизмов: а) поддержания необходимого для нормальной жизнедеятельности уровня оводненности тканей; б) развития способности клеточного метаболизма функционировать в условиях дегидратации; в) эффективного восстановления клеточных структур и функций после сильного обезвоживания; г) ускоренного завершения жизненного цикла до наступления засушливого периода. Большинство этих механизмов может быть продемонстрировано на примере ксерофитов -растений засушливых местообитаний.
Формирование этих конститутивных защитных механизмов у растений -ксерофитов происходило в процессе длительного филогенеза. Они экспрессируются постоянно, независимо от присутствия или отсутствия действующего фактора и реализуются, как правило, в анатомических и морфологических приспособлениях, что позволяет избегать действия повреждающего фактора и достигать максимально возможной устойчивости к условиям водного дефицита.
В процессе эволюции возникли разные группы ксерофитов, отличающиеся механизмами выживания в условиях экстремально сухого климата (Максимов, 1958; Кузнецов Вл.В, 1992). 1) Суккуленты, или ложные ксерофиты. Это - многолетние растения, запасающие воду в стеблях, листьях или корнях. Эти органы становятся толстыми из-за сильно развитой водозапасающей паренхимы. После дождей в них запасается вода, которая долгое время покрывает потребности растения. Кроме того, растения-суккуленты экономно расходуют воду за счет низкой интенсивности транспирации. Например, у кактусов небольшая интенсивность транспирации связана с сокращением испаряющей поверхности благодаря превращению листьев в колючки. При этом фотосинтетическую функцию листьев выполняют стебли.
Другой очень важный механизм в одо сберегающей адаптации у суккулентов - функционирование облигатного или факультативного САМ-типа фотосинтеза (Luttge, 1993; Bohnert et al., 1995). У этих растений мало устьиц, которые закрыты днем и открыты ночью. Поскольку ночью температура воздуха ниже, чем днем, а влажность выше, то, в отличие от других растений, суккуленты крайне экономно расходуют воду. При более низкой температуре ночью устьица открыты шире, чем днем, что позволяет активно поглощать углекислый газ. Фиксация углекислоты идет за счет первичного карбоксилирования фосфоенолпировиноградной кислоты (ФЕП). В результате образуется малат, который в течение ночи аккумулируется в вакуоли. Днем малат выходит в цитоплазму, где он декарбоксилируется с освобождением СО2, который включается в цикл Кальвина с помощью фермента рибу лезо дифосфаткарбоксил азы (РБФК) (Bohnert et al., 1995; Adams et al., 1998; Третьяков H.H. с соавт., 1998). Такое разделение фиксации и ассимиляции С02 во времени у суккулентов экологически выгодно - растения обеспечивают себя углеродом ночью и при этом не расходуют много воды на устьичную транспирацию. Таким образом, они эффективнее используют воду по сравнению с Сз-видами. Из культурных растений к суккулентам можно отнести ананас. 2) Тонколистные ксерофиты, или полуксерофиты (например, верблюжья колючка). Они представляют собой полную противоположность первому типу. Эти растения характеризуются интенсивной транспирацией, понижающей температуру растения. Длинные корни достигают грунтовых вод и непрерывно снабжают побеги водой, восполняя при этом ее большой расход. Устьица широко открыты, фотосинтез идет быстро. Несмотря на хорошее водоснабжение и интенсивный фотосинтез, надземные органы растут медленно, так как большая часть ассимилятов расходуется на образование корней (Косулина с со авт., 1993). Культурные растения, например арбуз, груша, шалфей, попадая в засушливые условия, приближаются к этой группе. 3) Жестколистные, или настоящие ксерофиты. Эти растения способны резко сокращать трапспирацию при недостатке воды. К ним принадлежат степные злаки (ковыль, типчак), некоторые зонтичные (синеголовник). Они имеют жесткие кожистые листья с большим количеством устьиц. У ряда представителей этого типа сильно развита кутикула и поверхность листьев как бы отполирована, что способствует сильному отражению солнечных лучей. У одних - устьица погружены в ямки, у других - листья в период наибольшей засухи и высоких температур свертываются в трубку, внутри которой оказываются устьица. Все эти приспособления приводят к снижению транспирации (Максимов, 1958). 4) Эфемеры - растения с коротким вегетационным периодом, совпадающим с периодом дождей. Некоторые эфемеры плодоносят уже через 8-15 дней после появления всходов. Остальную часть года, неблагоприятную для жизнедеятельности, они переносят или в состоянии зрелых семян, или у них есть специальные запасающие воду органы (луковицы) (Чиркова 2002). К этому типу ксерофитов относятся растения степей, например тюльпаны, а также маки, вероники и другие. Из культурных растений к эфемерам можно отнести скороспелые сорта ячменя, озимую рожь, пшеницу, монокарпики, активная жизнедеятельность которых совпадает с периодом весенне-летних осадков. 5) Растения близкие к эфемерам. Они сбрасывают листья, когда становится жарко, и почва пересыхает. В этих условиях растения переходят в состояние покоя. К этому типу ксерофитов относятся колючий астрагал, белая полынь, коксагыз. 6) Растения, способные функционировать в условиях сильного обезвоживания. При этом, они способны высыхать до воздушно-сухого состояния и затем восстанавливать клеточный метаболизм при наступлении дождей.
Итак, растения-ксерофиты, в процессе длительной эволюции сформировали эффективные конституитивные механизмы выживания в условиях засушливых местообитаний. Это генетические адаптации, которые передаются по наследству, носят конститутивный характер и проявляются на уровне целого организма. Однако практически все наземные растения умеренных широт также испытывают недостаток влаги. Они не способны выживать в условиях жесткого засушливого климата, хотя и адаптируются к условиям водного дефицита. В основе их адаптации лежат стресс-индуцируемые механизмы устойчивости, которые детерминированы генетически, отсутствуют в условиях нормального увлажнения и образуются лишь в ответ на действие стрессора. Эти механизмы проявляются не на морфологическом или анатомическом уровнях, а на уровне биохимических процессов и новообразования низкомолекулярных стресс-протекторных соединений, а также защитных макромолекул.
Взаимодействие между ядерной, пластидной и митохондриальной генетическими системами
Наиболее важными органеллами растительных клеток, обозначаемых общим термином «пластиды», являются хлоропласты. Основная их функция заключается в превращении солнечной энергии в энергию химических связей органических веществ. Хлоропласты участвуют также в восстановлении нитритов и сульфатов, что обеспечивает возможность синтеза большого количества аминокислот. Совместно с другими органеллами клетки хлоропласты играют ключевую роль в фотодыхании, транспорте ионов, промежуточных и вторичных метаболитов (Schreier, Bohnert, 1985).
Хлоропластный геном представлен одной кольцевой молекулой ДНК с молекулярной массой 120-210 т.п. Особый интерес представляют три мультисубъединичных комплекса хлоропластов, имеющих непосредственное отношение к фотосинтезу: светособирающий хлорофилл а/в - белковый комплекс, хлоропластный АТФ-синтетазный комплекс и РБФК (рибулозо-1,5- бисфосфаткарбоксилаза). Последние два комплекса содержат полипептиды, синтезируемые как в цитоплазме, так и в хлоропластах.
РБФК является преобладающим белком хлоропластной стромы. Он содержит две различные субъединицы. Большая (А) субъединица кодируется ДНК хлоропластов, а малая (В) субъединица — ядерной ДНК. Следовательно, синтез РБФК зависит от экспрессии генов двух различных генетических систем, локализованных в отдельных структурных элементах одной и той же клетки. При этом, малая субъединица синтезируется на цитоплазматических рибосомах и является, таким образом, продуктом типичной эукариотической системы, в то время как большая субъединица синтезируется в хлоропластах, которые ближе к прокариотам. Степень экспрессии этих генов скоординирована, однако механизмы координации указанных генетических систем далеко не ясны. Хлоропластные гены выделены и охарактеризованы у ряда высших растений, определена полная нуклеотидная последовательность этого гена у кукурузы и шпината (Zurawski, Clegg, 1987; Lam et al., 1988).
Итак, большинство хлоропластных полипептидов кодируется ядерными генами и синтезируется на цитоплазматических рибосомах. Затем хлоропластные полипептиды транспортируются в развивающиеся хлоропласты. Наличие внеядерных генетических систем является, очевидно, фундаментальным свойством клеточной организации эукариот (Семенов, 2000). Распределение генов обеих субъединиц РБФК между ядерным и хлоропластным геномами является примером широко распространенного феномена дисперсии генов, кодирующих компоненты мультимерных белков субклеточных органелл (Bogorad, 1975).
Другими носителями генетической информации являются митохондрии. Это цитоплазматические органеллы, в которых происходят основные дыхательные процессы клетки, приводящие к запасанию энергии в макроэргических связях аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Митохондрии как дыхательные центры клетки обладают следующими функциями: 1) осуществляют окислительные реакции, являющиеся источниками электронов; 2) переносят электроны по ЭТЦ и синтезируют АТФ; 3) катализируют синтетические реакции, идущие с использованием энергии; 4) регулируют биохимические процессы в цитоплазме (Негрук, 1987).
Митохондрии являются полуавтономными саморепродуцирующимися органеллами клетки. Они обладают полной системой синтеза белка: в матриксе найдены специфичные ДНК, РНК и рибосомы (Беликов, Дмитриева, 1992). Митохондриальная ДНК кодирует полный набор тРНК, необходимых для синтеза белка, рибосомы и некоторые иРНК. Однако митохондрии в большой степени, чем хлоропласты зависят от ядерных генов, поскольку митохондриальные гены кодируют лишь относительно небольшое число компонентов общего состава полипептидов митохондрий. Предполагают, что митохондрии произошли от аэробных бактерий, установивших симбиотические отношения с примитивными протоэукариотами (Leaver et al, 1983; Беликов, Дмитриева, 1992).
Итак, митохондрии являются цитоплазматическими органеллами, обладающими свойством наследственности, саморегуляции, содержат ДНК, но частично находятся под контролем ядерных генов. Мембраны митохондрии состоят из белков (65-70% сухой массы) и фосфолипидов. В клетках растений обычно содержится меньше митохондрий, чем в животных клетках. На поверхности хлоропласта иногда образуются выпячивания, с помощью которых хлоропласты могут соединяться с митохондриями. Это говорит о том, что в зеленых клетках фотосинтез и дыхание происходят согласованно. Митохондрия, как и хлоропласт, является органеллои, характерезующеися обменом веществ и энергии, движением, ростом, размножением, раздражимостью, адаптацией.
Хромосомные и цитоплазматические детерминанты представляют собой генетические системы клетки, тесное взаимодействие которых между собой и с окружающей средой определяет внутреннюю организацию и динамику процессов жизнедеятельности (McDaniel and Sarkissian, 1968; Sarkissian and Srivastava, 1969; Hoober, 1975). Полиморфизм и комплементация митохондрий уже доказаны у кукурузы, сорго, пшеницы, ржи, гороха, хлопчатника и у других культур. Митохондрии поддерживают внутриклеточный гомеостаз, что придает растениям фенотипическую стабильность при стрессе (Sarkissian, Srivastava, 1969). Создание «гибридных» генетических систем открывает новые возможности для изменения функционирования и экспрессии генома путем замены цитоплазмы как компонента этой системы. К таким системам относятся аллоцитоплазматические (АЦПГ) формы пшеницы Г. aestivum L. на чужеродной цитоплазме, донорами которой являются различные виды таких родов, как Aegilops, Secale L., а также некоторые виды рода ТгШсит L. (Т. timipheevi) (Семенов, 2000).
Ядерно-цитоплазматические гибриды позволяют получить новую информацию об участии цитоплазмы в генетической системе ТгШсит и эволюционной принадлежности видов Triticinae при сравнительном анализе реакции ядра на чужеродную цитоплазму (Kihara, 1975; Tsunewaki et al., 1976). Ядерно-цитоплазматические гибриды пшеницы могут иметь селекционный потенциал, потому что генетическая основа пшеницы расширяется при введении чужеродной цитоплазмы. Используя мужскую стерильность как один из характерных признаков, вызванных внедрением чужеродной цитоплазмы, различные усилия были предприняты для создания гибридов F[ в селекции пшеницы (Wilson and Ross, 1962; Maan and Lucken, 1972).
Аккумуляция свободного пролина в листьях растений пшеницы в оптимальных условиях и при действии засухи
Итак, необходимо было выяснить, какие еще физиологические особенности аллоцитоплазматических гибридов могут быть ответственны за лучшую компенсацию нарушений водного статуса растений при засухе. В качестве одного из характерных показателей ответа растений пшеницы на засуху может служить уровень свободного пролина в листьях.
Свободный пролин является одним из наиболее широко распространенных органических веществ, служащих в качестве совместимых осмолитов у высших растений (Кузнецов Вл.В., Шевякова, 1999). Он имеет особенность накапливаться в растениях при действии неблагоприятных факторов, обладая выраженным стресс-протекторным эффектом. Кроме того, пролин обладает также и выраженными антиоксидантиыми свойствами. Таким образом, уровень свободного пролина может быть непосредственно использован как важный показатель интенсивности адаптационных реакций растения при неблагоприятном воздействии водного дефицита на биохимические процессы метаболизма клетки.
Данные одного из экспериментов представлены в таблице 7. Как видно из результатов этого опыта, в условиях оптимального увлажнения исходный уровень свободного пролина был относительно невысок и практически не различался у изученных форм, составляя в среднем 1 мкмоль пролина/ г свежей массы листьев. В ходе проведения опыта в контрольном варианте наблюдалась заметная аккумуляция пролина при учете динамики изменений пролина по отношению к исходному содержанию. В результате к концу опыта содержание пролина в листьях всех изученных форм возрастало в 2-2,2 раза.
После прекращения полива, уже на 5 день засухи (Табл. 7) у растений наблюдали резкое усиление аккумуляции свободного пролина в листьях. В результате его уровень за этот период в 6,8-14,3 раза превысил его содержание по сравнению с контрольными растениями. Еще через 7 дней засухи содержание пролина в тканях листьев дополнительно увеличилось. Максимальная его концентрация - 32 мкмоль пролина в 1 г свежей массы листьев - была зафиксирована у гибрида АЦПГ пшеницы на цитоплазме ржи, что в 15 раз превосходило уровень пролина в листьях контрольных растений того же возраста и в 34 раза при сравнении с исходным значением. У растений с. Комета наблюдалось значительно меньшее увеличение содержания пролина в листьях, тем не менее, его уровень вырос в 11 раз над контрольными растениями того же возраста. Сходные данные были получены также для растений сорта Приокская.
Обнаруженная очень сильная и быстро происходящая аккумуляция пролина в листьях растений изученных гибридов пшеницы при действии засухи, очевидно, подтверждает его важную роль в адаптациионном процессе, которая определяется его участием в осморегуляции, антиоксидантними свойствами, протекторной функцией по отношению к клеточным мембранам.
В настоящее время установлено, что очень многие стрессоры, действующие на растение, усиливают образование активных форм кислорода (АФК), которые при избыточном накоплении в тканях вызывают окислительный стресс, оказывая сильное повреждающее действие на структуру и функцию клеток растений. Обнаруженная в проведенных опытах интенсивная аккумуляция свободного пролина в растениях пшеницы и гибридов при засухе уже может свидетельствовать о развитии окислительного стресса. Однако клеточные системы защиты от избытка АФК включают не только соединения, обладающие антиоксидантными свойствами, к числу которых относится свободный пролин, но также ферменты, разрушающие АФК, переводя их в неактивное, не повреждающее клетки состояние.
Для проверки высказанного предположения о возможном более эффективном функционировании защитных систем у изученных гибридов было предпринято изучение активности пероксидазы в качестве одного из ферментов антиоксиданти ой защиты растений. Пероксидаза, присутствующая в клетке в виде свободной и ион-связанной форм, принимает участие в детоксикации перекиси водорода, избыточное появление которой индуцируется стрессорами, к числу которых относится и засуха.
Активность свободного и связанного изозимов гваяколовой пероксидазы была измерена в тканях листьев растений пшеницы с. Комета и АЦПГ пшеницы на цитоплазме ржи н на цитоплазме эгилопса (Рис. 4 и Рис. 5).
В листьях всех изученных форм растений в условиях оптимального водообеспечения активность свободной формы гваякол овой пероксидазы значительно, в 6-И раз, превосходила активность ион-связанной формы, при этом с возрастом активность обеих форм несколько возрастала. При воздействии засухи соотношение активности обеих форм ферментов в листьях гибридов несколько, хотя и не очень значительно увеличивалась, тогда как у с. Комета даже немного понижалась.
Увеличение активности обеих форм пероксидазы у гибридов, хотя и относительно небольшое по размеру, подтверждает ее участие в разрушении Н2О2 и пероксидов органических соединений, что свидетельствует о ее защитной роли у растений при стрессе.
Действие интенсивной засухи на рост и листовую поверхность
Основными объектами проведенных исследований послужили растения аллоцитоплазматических гибридов пшеницы на цитоплазме ржи и эгилопса, созданные проф. О.Г.Семеновым. Выбор на АЦПГ пшеницы в качестве объекта исследования остановился потому, что хотя их изучение проводится уже в течение ряда лет, до сих пор физиологические особенности этих растений описаны очень слабо, ограничиваясь в основном феноменологией (Медведева, Семенов, 1969; Семенов, 2000; Морозова, Семенов, 2004). В настоящей работе было решено не столько исследовать возможные различия между АЦПГ и стандартными сортами в оптимальных условиях выращивания, но основное внимание обратить на способность растений изучаемых форм адаптироваться к неблагоприятным факторам среды. При этом, не ставя целью изучить механизмы устойчивости, что невыполнимо в рамках диссертационной работы, было решено по мере возможности исследовать основные процессы, в которых реализуется адаптация растений.
Исследование выполнено в основном на довольно молодых растениях пшеницы и гибридов (III-IV стадии органогенеза) (Куперман, 1955), поскольку и в природных условиях Средней полосы России недостаток почвенной влаги -засуха - часто захватывает этот период развития растений (Генкель, 1975). К этому моменту, а также в течение опытов, максимальная продолжительность которых составляла 1 месяц, растения изученных форм в оптимальных условиях водообеспечения мало различались между собой. Помимо уже отмеченного ранее несколько более интенсивного роста растений АЦПГ на цитоплазме эгилопса следует также указать на заметно пониженную интенсивность транспирации этих растений, что может быть свидетельством большей их ксероморфности в сравнении с растениями других исследованных форм.
В проведенных экспериментах засуха как стрессорный фактор использовалась в двух основных вариантах. Режим умеренной почвенной по засухи удавалось быстро создавать при выращивании опытных растений в сосудах (15-20 растений/5 кг почвы) путем прекращения полива. Однако в условиях вегетационного домика ИФР невозможно было контролировать другие параметры среды обитания опытных растений, что также сказалось на воспроизводимости результатов некоторых опытов. Более сильное и значительно лучше регулируемое стрессорное воздействие на растения было осуществлено в опыте, проведенном в камере Фитотрона МСХА, где помимо почвенной растения подвергались также воздушной засухе (40% относительной влажности воздуха), сопровождаемой сильными потоками сухого воздуха, имитирующим ветер. Наконец, еще один весьма эффективный подход для выявления различий между использованными формами состоял в изучении репарационных возможностей растений в период их восстановления после прекращения засухи.
В качестве показателей, характеризующих состояние растений в норме, при действии стрессора и в период репарации после восстановления полива растений, использовали прежде всего такие общие параметры как рост, накопление биомассы, а также фотосинтез и дыхание, отражающие общее состояние растений. Другую группу показателей применяли для оценки состояния водного статуса как первичного звена воздействия засухи и инициируемого этим неблагоприятным фактором окислительного стресса.
Наиболее прямым действием засухи, проявившимся у растений всех исследованных форм, явилось торможение ростовых процессов, накопления биомассы, развития ассимиляционной (листовой) поверхности. В основе этих негативных явлений лежит обнаруженное в опыте, проведенном в Фитотроне МСХА, неблагоприятное соотношение энергетических процессов, а именно -подавление фотосинтеза и активация дыхания.
Нарушение водного статуса растений при засухе заключалось в снижении оводненности и усилении водного дефицита листьев, а также падении интенсивности транспирации. У растений исследованных гибридов наблюдалось меньшее в сравнении с растениями стандартных сортов обезвоживание тканей листьев. Разница была особенно выразительной, если судить по ОСВ. Ухудшение состояния растений по отношению к оптимальным условиям у с. Приокская проявилось в снижении ОСВ на 27,82%, тогда как у АЦПГ пшеницы на цитоплазме ржи и эгилопса всего на 18,60 и 12,93% соответственно.
Одной из самых заметных ответных реакций на засуху растений многих видов, в том числе пшеницы и, как обнаружено в настоящем исследовании, ее АЦПГ, является аккумуляция свободного пролина. Подтверждением важной его роли в адаптации растений пшеницы служит тот факт, что при засухе содержание пролина в листьях увеличивалось более чем в 10-15 раз. Хотя накопление свободного пролина на начальном этапе засухи в листьях растений с. Комета в 2 раза превосходило его уровень у гибридов, однако в дальнейшем скорость его аккумуляции у АЦПГ возрастала, тогда как у с. Комета — падала. В результате при сильной, 12-дневной засухе содержание свободного пролина в листьях АЦПГ превышало в 1,5 раза его уровень у с. Комета.
Известно, что при действии засухи в тканях растений происходит избыточное накопление активных форм кислорода (АФК), вызывающих окислительный стресс (Lee et. al., 1982; Hendry, 1994; Kuzniak, 2002). Поэтому несколько неожиданным оказался тот факт, что активность гваяколовой пероксидазы при засухе даже упала в листьях растений пшеницы с. Комета и лишь слабо возросла у АЦПГ. Необходимо отметить, что в недавно выполненном исследовании Кузнецова с соавт. (Кузнецов Вас.В. с соавт., 2003) на растениях пшеницы (с. Саратовская) при засухе также было обнаружено лишь слабое усиление активности как свободной и ион-связанной форм пероксидазы, так и каталазы, другого фермента, расщепляющего перекись водорода. Видимо, недостаточная активность процессов детоксикации этого агрессивного соединения явилась причиной значительного усиления перекисного окисления липидов (ПОЛ) при засухе. В то же время, оба изученных АЦПГ пшеницы по этому показателю обнаружили существенно большую устойчивость в сравнении с растениями с. Комета.
Относительно более высокая устойчивость к окислительному стрессу растений АЦПГ в сравнении с растениями с. Комета проявилась в том, что у АЦПГ 1) на начальном этапе засуха значительно меньше усиливала ПОЛ и 2) при продолжении засухи не происходило дальнейшего усиления ПОЛ по сравнению с контрольными растениями, что было характерно для растений с. Комета.
