Содержание к диссертации
Введение
1. Природа и физиолого-биохимическая роль гидролитических ферментов (аналитический обзор литературы)
1.1. Пектолитические ферменты микроорганизмов и растений (структура, свойства и физиологическая роль)
1.2. Целлюлолитические ферменты
1.3. Эстеразы
1.4. Амилолитические ферменты 24
2. Растительные ингибиторы гидролитических ферментов 33
2. Материалы и методы 43
2.1. Объекты исследований 43
2.2. Материалы и реактивы 43
2.3. Методы исследований 44
2.3.1. Определение концентрации белка
2.3.2. Определение липазной активности в экстрактах
2.3.3. Определение активности протеолитических ферментов
2.3.4. Определение активности ингибиторов трипсина по БАЛА
2.4. Математическая обработка результатов 47
Результаты и обсуждение 49
3.1. Модификация и разработка методов определения активности
3.1. Модификация и разработка методов определения активности
3.1.1. Определение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и их ингибиторов по гидролизу субстратов в агарозном геле (модификация методов) 49
3.1.2. Определение активности липаз, амилаз и их ингибиторов методом агарозных гелевых пластин (разработка метода) 56
3.2. Активность гидролитических ферментов в экстрактах имаго и личинок колорадского жука
3.3. Активность гидролитических ферментов в тканях картофеля различных сортов 74
3.4. Активность ингибиторов гидролитических ферментов колорадского жука в тканях картофеля
Выводы 87
Литература 90
- Пектолитические ферменты микроорганизмов и растений (структура, свойства и физиологическая роль)
- Определение активности протеолитических ферментов
- Определение активности липаз, амилаз и их ингибиторов методом агарозных гелевых пластин (разработка метода)
- Активность гидролитических ферментов в тканях картофеля различных сортов
Введение к работе
Синтез белков с антимикробными свойствами является одной из универсальных защитных реакций растений при воздействии на них биотических и абиотических факторов (Clarini, 2002; Сотченков, Голденкова, 2003). К таким молекулам относятся и ингибиторы, способные нейтрализовать гидролитические (пищеварительные) ферменты патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Наиболее подробные сведения получены о защитной роли растительных ингибиторов, действующих на протеолитические ферменты. Показано, что выделенные из семян бобовых, злаковых растений, клубней картофеля препараты ингибировали действие ферментов микроорганизмов, и вследствие этого, были способны подавлять рост и развитие колоний патогенных грибов (Мосолов, 1983; Валуева, Мосолов, 2002; 2004; 2006; Конарев, 2002). С. Рианом и его сотрудниками было обнаружено, что поранение тканей личинками колорадского жука приводит к системному повышению активности ингибиторов протеиназ во всех органах растений томатов и картофеля (Green, Ryan, 1972; Ryan, 1981). Ингибиторы протеолитических ферментов выявлены практически у всех исследованных представителей дикорастущих и культурных растений (Валуева, Мосолов, 2006). Широкое распространение ингибиторов протеиназ и их содержание в значительных количествах в тканях растений позволяют говорить о них как об одном из важных звеньев в регуляции физиологических и патологических процессов. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что в растительных тканях должны функционировать и ингибиторы других гидролаз: амилаз, пектиназ, целлюлаз, эстераз. Однако, экспериментальные сведения об этих гидролитических ферментах и их ингибиторах при взаимодействии растений с фитопатогенами в научной литературе пока весьма ограничены (Фомичева, 1992; Яруллина, Ибрагимов, 2006). По-видимому, функционирование в растительном организме генетически детерминированной системы ингибиторов гидролитических ферментов представляет важную часть механизма противостояния растений организмам-фитофагам, т.е. механизма, обеспечивающего устойчивость растений. В связи с вышесказанным, исследования гидролитических ферментов, их ингибиторов при взаимодействии растительного организма с фитофагами приобретают особую актуальность и имеют важное значение как в научном, так и практическом отношении. В значительной степени, накопление новых фактов в этом плане ограничивается недостатком методов, позволяющих параллельно измерять ферментативную и ингибиторную активности в биологических объектах.
Кроме того, существующие в настоящее время методы измерения активности гидролаз довольно трудоемки, и поэтому не позволяют одновременно анализировать большое количество образцов (Ермаков, 1987; Камышников, 2003; Хазиев, 2005).
Цель нашей работы заключалась в разработке и модификации новых методов измерения активности гидролаз, их ингибиторов, позволяющих анализировать эти молекулы как компоненты единого функционального комплекса при взаимодействии растений с патогенными микроорганизмами и насекомыми-вредителями.
Весьма удобной моделью для проведения исследований такого рода является природная система «картофель - колорадский жук». Исследование гидролитических ферментов, их ингибиторов при взаимодействии картофеля и колорадского жука позволит получить и ценный экспериментальный материал о физиологических, биохимических механизмах взаимоотношений сельскохозяйственных растений и насекомых- вредителей.
Соответственно, в процессе выполнения работы решались следующие задачи: - разработка новых методов определения активности амилаз, липаз и их ингибиторов в тканях растений и насекомых;
- модификация методов измерения активности целлюлаз, пектиназ и их ингибиторов в тканях растений и насекомых;
измерение уровня активности гидролитических ферментов в тканях личинок и имаго колорадского жука, обитающих на различных территориях;
- измерение уровня активности гидролитических ферментов и ингибиторов
гидролаз в тканях картофеля районированных сортов и перспективных
селекционных сортообразцов картофеля.
Пектолитические ферменты микроорганизмов и растений (структура, свойства и физиологическая роль)
Целлюлазы - это группа гидролитических ферментов, обладающих способностью гидролизовать нерастворимую целлюлозу до ее мономера-глюкозы. Целлюлазы в тканях находятся виде так называемого целлюлазного комплекса, в состав которого входят несколько ферментов (Родионова, 1981; Головченко и др., 1985; Amadioha, 1993). К ферментам целлюлазного комплекса относят три вида ферментов: эндо-1,4-3-глюканазы, экзо-1,4- fi- глюконазы (целлобиогидролазы) и целлобиазы (р-глюкозидазы). Было отмечено существование и четвертого целлюлолитичекого фермента- экзо-1,4- р-глюкогидролазы (Pant, Ramana, 1989) . Активность компонентов этой системы и взаимодействие между ними определяют эффективность целлюлазного комплекса при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов (Скомаровский, Марков, Гусаков, Кондратьева, 2006). Целлюлолитические ферменты в современной системе классификации объединены в 13 из более чем 60 известных структурных семейств гликозилгидролаз, причем к ним отнесены и два семейства из многочисленной группы ксиланаз (Kubicek,1992; Ghose, Bisaria, 1992;Tomme, Warren, Gilkes, 1995 ). Молекулы ферментов целлюлазного комплекса из различных источников, различаются по своим физико-химическим и биохимическим параметрам. Известные целлюлолитические комплексы в организме представлены набором изоферментов. Соответствено, целлюлазные комплексы из различных источников характеризуются высокой гетерогенностью - как по составу, так и по каталитической способности (активности) по отношению к целлюлозе и ее многочисленным производным. У микроорганизмов известны целлюлазы, ассоциированные с клетками (и, очевидно, выполняющие свою каталитическую функцию in vivo в таком «иммобилизованном» состоянии) и каталитически активные внеклеточные целлюлазы (Рабинович и др., 1990). Известны целлюлазы, объединенные в организованные надмолекулярные структуры (так называемые целлюлосомы, обнаруженные для некоторых бактериальных целлюлаз), и целлюлазы, которые также представляют собой многокомпонентные комплексы, но по- видимому не имеют определенной пространственной организации. Часто в составе целлюлазных комплексов обнаруживают всего два- три отдельных компонента (как правило среди них имеется эндоглюканаза), но в ряде случаев тщательное разделение целлюлазного комплекса из одного источника выявляет наличие 15-20 и более индивидуальных целлюлазных компонентов. По современным представлениям большинство целлюлолитических ферментов являются мультидоменными белками, содержащими по меньшей мере три функционально различных структурных элемента: каталитический домен, целлюлозосвязывающий домен и соединяющий их линкер (Рабинович, Мельник, Болобов, 2002). Как правило, в одном и том же организме может содержаться несколько типов целлюлолитических ферментов, каталитические и целлюлозосвязывающие домены которых принадлежат различным семействам белков. Помимо этих основных фрагментов в структурах целлюлаз различного происхождения могут присутствовать и другие элементы, включая фибронектин III—подобные домены, повторяющиеся гидрофобные последовательности т.н. когезин— докеринового типа (Рабинович, Мельник, 1998).
Целлюлазные системы- системы, включающие ферменты, способные расщеплять 1,4—р—глюкозидные связи в полимерных формах целлюлозы, а также ферменты иной специфичности или некаталитические белки, способные действовать на поверхности целлюлозы, т.е. содержащие целлюлозосвязывающий домен. Существование формального структурного сходства целлюлозосвязывающих доменов и ингибиторов протеаз наводит на мысль о возможной полифункциональности тех и других. Так, для некоторых растительных ингибиторов протеаз известна способность подавлять активность полисахаридгидролаз (амилаз) (Reese, 1975; Конарев,1992; Мосолов, 1994 ).Целлюлазные системы, синтезируемые аэробными грибами, весьма подробно изучены на примере ферментов из Trichoderma, Penicillhim, Fusarium, Humicola, Phanerochaete, Schizophillum. Число определяемых «целлюлолитических» белков в этих системах иногда исчисляется десятками, однако большинство из них является гомологами или множественными формами ограниченного набора основных компонентов, принципиально отличных по структуре и механизму действия (Синицын, Черноглазов, Гусаков, 1995; Kurabi, Berlin et all., 2005). Оказалось, что основным компонентом грибных целлюлазных систем является целлобиогидролаза I. Она сохраняет конфигурацию расщепляемой связи в продуктах реакции и катализирует процессы трансгликозилирования. Низкомолекулярные субстраты она атакует преимущественно вблизи восстанавливающего конца. Именно целлобиогидролаза I необходима для расщепления нативной целлюлозы, причем в этом процессе участвуют все три ее составные части — КД, С—концевой целлюлозосвязывающий домен (ЦСД) и линкер (Konstantinidis , Marsden , Sinnott ,1993).
Целлобиогидролаза II катализирует гидролиз гликозидных связей с обращением конфигурации у аномерного углерода. Показано, что, эндоглюканаза I Т. reesei, принадлежит тому же семейству, что и целлобиогидролаза I и имеет близкую третьичную структуру. Эндоглюканаза IV Т. reesei, принадлежащая к новому семейству 61/М, охарактеризована сравнительно недавно. Аналогичный белок обнаружен и у культурного шампиньона Agaricus bisporus (Saloheimo, Nakari-Setala,Tenkanen, Penttila ,1997).
В ферментных системах псевдомонад, бацилл и Erwinia не найдены целлобиогидролазы. Поэтому их функция, вероятнее всего, не является только трофической. Некоторые из ферментов, видимо, участвуют в фитопатогенезе, облегчая проникновение микроорганизма в клетку хозяина, либо образуя сигнальные молекулы—олигосахарины, регулирирующие фитоиммунные реакции. В этой связи особый интерес представляет структурное сходство отдельных эндоглюканаз и ксиланаз сапрофитных грибов и фитопатогенных бактерий. Существует структурное сходство ЦСД и растительных ингибиторов протеиназ, участие которых в регуляции взаимоотношений растения и патогена считается доказанным (Мосолов, Валуева, 1993; 1994; 1995; 2006).
Определение активности протеолитических ферментов
Фитопатогены растений вооружены мощным ферментативным аппаратом. С участием его компонентов могут. осуществляться превращения практически всех содержащихся в тканях зеленого растения соединений. Это относится к различным группам гидролитических ферментов, включая и катализаторы, участвующие в разложении элементов покровных тканей растения (целлюлоза, гемицеллюлозы, пектиновые вещества, соединения группы лигнинов и их производных и др.). При участии этих ферментов преодолеваются механические барьеры на пути прорастающих спор и становятся осуществимыми первые этапы заражения- внедрение паразита внутрь клетки хозяина, установление непосредственного контакта и взаимодействия между ним и протоплазмой клетки. Фитопатогены располагают обширным набором протеолитических ферментов, ферментами нуклеинового обмена, эстеразами, глюкозидазами, ферментами, расщепляющими полимерные формы углеводов (Felton et al., 1989; Cornell, 1989; Wong, 2005;2005).
В процессе эволюции растения выработали защитные механизмы, которые позволяют им успешно противостоять различного рода неблагоприятным воздействиям, в том числе, вредителям и фитопатогенным микроорганизмам (Mosolov, 1976; Шапиро и др., 1986; 1991; Morimoto 1990; Едрева, 1991; Itoh et al., 2003; Валуева, Мосолов, 2002; Пятыгин, 2008).
Синтез белков с антимикробными свойствами является одной из универсальных защитных рекций растений при воздействии на них различных патогенных микроорганизмов (Felton et al., 1989; Сарсенбаев, 1986; Хайруллин и др., 1993; Озерецковская, Васюкова, и др., 1993; Сотченков, Голденкова, 2003).
В настоящее время известно, что при инфицировании в растительном организме включаются специфические сигнальные системы, которые воспринимают, умножают и передают сигналы от патогена в генетический аппарат клеток, что приводит к активации и экспрессии защитных генов (Рубин и др., 1975; Рубин, 1977; Pfliiger, 1988;Bonhamou et al., 1991;Enyedi, Yalpani, Silverman , Raskin ,1992; Тарчевский, 1992;1996;2001).
Большая часть известных защитных белков растений объединена в группу так называемых PR-белков (pathogenesis-related), синтез которых индуцируется или возрастает во время сверхчувствительного ответа HR (hypersensitive response) или системно проявляющейся устойчивости SAR (systematically acquired resistance) (Castoria et al., 1989; Bronner, 1991; Дьяков, 1994; Маали Амири, Голденкова-Павлова и др., 2007). Для растительных PR-белков характерна видоспецифичность, одни и те же патогены при поражении растений разных видов индуцируют синтез неодинаковых по составу и свойствам защитных молекул (Сотченков, Голденкова, 2003). Известно, что семена растений содержат большое количество различных PR-белков, которые обеспечивают их защиту в состоянии покоя и в период прорастания (Финкина, Баландин, Серебрякова и др., 2007; Hilder et al., 1999).
Показано, что олигосахаридные фрагменты клеточных стенок грибов и продукты их гидролиза выступают в качестве элиситоров, индуцируя синтез фитоалексинов или экспрессию генов других PR-белков, таких как ингибиторы гидролаз (Яруллина, Ибрагимов, 2006).
Наиболее изученными являются ингибиторы протеолитических ферментов (Bryant, 1976; Wilson 1980; 1983; Richardson, 1977; 1986; Tashiro, 1990; Кладницкая, Валуева, Домаш, Мосолов, 1994; Ибрагимов, 1997; 1998; Дунаевский, 2000; Ussuf, 2001; Ибрагимов и др., 2006; Домаш и др., 2008). В ответ на агрессивное действие протеиназ патогена в растении индуцируется синтез белковых ингибиторов, действие которых может быть направлено на подавление активности этих ферментов. Впервые подобное явление наблюдалось у томатов, инфицированных P. infestans. (Woloshuk, Meulenhoff, et al.). Было также показано, что при инфицировании клубней картофеля этим оомицетом накапливаются белки-ингибиторы сериновых протеиназ с молекулярными массами от 20 до 25 кДа (Нурминская, Богданов, 1990).
В настоящее время показано, что некоторые ингибиторы сериновых протеиназ, выделенные из семян растений и клубней картофеля, способны подавлять рост и развитие патогенных грибов (Cordero, Raventos, Segundo,1992) Например, ингибитор трипсина из кукурузы (Zea mays L.) полностью подавлял рост мицелия гриба Aspergillus flaws. Рекомбинантный белок PKPI-B10, полученный в результате экспрессии кодирующего его гена РКРІ-ВІ0 и действующий как специфический ингибитор трипсина, угнетал рост мицелия гриба F. culmorum. Ингибитор трипсина из семян бобового растения (Psoralea corylifolia L.) эффективно тормозил рост мицелия четырех грибных патогенов -Alternari brassicaceae, A.niger, F.oxysporum и Rhizoctonia cerealis (Ревина, Герасимова, Кладницкая,2008).
В регуляции взаимоотношений растения и фитопатогена очень важно наличие или появление в тканях растений веществ, модифицирующих активность пектолитических ферментов, главным образом ингибиторов, веществ, стабилизирующих клеточные стенки (суберина и лигнина), или полифенольных соединений, а также фитоалексинов, локализованных в клеточных стенках. Ингибирующее действие этих соединений на пектолитические ферменты часто усиливается при активировании пероксидазы и полифенолоксидазы.
В тканях ряда растений были обнаружены вещества, способные в значительной степени инактивировать процессы ферментативного гидролиза пектинов - ингибиторы пектиназ (Рубин, 1977) Эти вещества обнаружены в различных органах растений: в листьях, плодах, клубнях, стеблях и т.д. (Тютерев, 1976). I
Ингибиторами пектолитических ферментов являются белки клеточных стенок, сходные по свойствам с фитоагглютининами. Содержание ингибитора ПГ белковой природы в клеточных стенках увеличивается при заражении и предохраняет клеточные стенки от разрушения. В присутствии этого белка эндо-ПГ из возбудителя вилта не вызывала высвобождение ПО из клеточных стенок хлопчатника (Метлицкий, Озерецковская, 1984; Шубанов, 2002).
Обнаружено, что в отношении пектиназ ингибирующей активностью обладают две группы природных соединений: вещества фенольной и вещества белковой природы. Ингибиторы белковой природы были выделены из клеточных оболочек гипокотилей фасоли, бобов, стеблей томатов, огурцов, капусты, лука, груш, сливы, земляники. Эти вещества способны полностью или в значительной степени инактивировать полигалактуроназы, выделяемые многими фитопатогенами в среду обитания. В отношении полигалакутроназ, продуцируемых грибами, эти белковые ингибиторы более специфичны, чем фенольные. Белковый ингибитор полигалактуроназы является гликопротеидом из группы фитоагглютининов с молекулярной массой 5000 (Тютерев, 1976; Глинка и др., 2003).
Определение активности липаз, амилаз и их ингибиторов методом агарозных гелевых пластин (разработка метода)
Для измерения липазной активности используется различные субстраты: трибутирин (Покорны, 1964), подсолнечное масло, оливковое масло (Козлов и др., 1968), маслянокислый эфир 7-гидрокси-4 метилкумарина (4-МУБ) (Панчоли и Линда, 1972), 4 метилумбеллифероннонаноат (4-МУН) (Купера, Морган, 1981), п-нитрофенилбутират (п-НФБ) (Асатиани, 1969; Маргезин и др., 2002; Хазиев, 2005). Как правило, для количественного измерения активности ферментов этими методами требуются длительная инкубация реакционной смеси. Так, в методе Покорны реакционную смесь инкубируют 72 часа при 30 - 37 С, (Козлов и др., 1965). Метод Панчоли и Линда (Pancholy, Lynd, 1972 ) предполагает инкубацию в насыщенной водяным паром среде при 30 С в течение 15 суток. Результаты гидролиза субстрата при использовании этих методик определются по измерению интенсивности флуоресценции или экстинции продуктов реакции ( Jensen, 1970; Cooper, Morgan, 1981; Margesin, Feller et all., 2002; Хазиев, 2005). Соответственно, используемые при этом ферментные растворы и другие компоненты реакционной смеси должны быть достаточно прозрачными, что требует предварительной очистки биологичесих экстрактов. Как видно, использование существующих методов определения липолитической активности предполагает наличие спектрофотометров и спектрофлоуриметров, специальных реактивов, необходимость длительной инкубации реакционной смеси. Эти требования налагают определенные ограничения на использование вышеназванных методов. Как уже отмечалось, к их недостаткам можно причислить невозможность использования непрозрачных растворов и невысокая производительность методов. В связи с этим, перед нами стояла задача разработки метода, позволяющего измерять липолитическую активность в биологических экстрактах без их предварительной очистки и одновременно анализировать большое количество образцов.
В качестве субстрата для липолитических ферментов нами был выбран твин - 20 (полиоксиэтиленсорбитмонолаурат). Как известно, твины включают остатки жирных кислот, соответственно, содержат эфирную связь, что делает возможным их использование для измерения активности ферментов, гидролизующих эфирные связи. Твины относятся к неионогенным поверхностно - активным веществам (Табак, 1979), что в значительной степени облегчает приготовление водных растворов в качестве субстрата для ферментов. Принцип проведения реакции гидролиза и измерения активности фермента был аналогичен измерению пектиназной и целлюлазной активности: иммобилизация субстрата в агарозный гель, затем инкубация геля с ферментом и измерение активности фермента по размеру гидролизованного участка окрашенного субстрата.
Для приготовления гелевой пластины с иммобилизованным субстратом для липаз, к горячему (70 С) 1% водному раствору агарозы добавляли 1 мл твина - 20, предварительно окрашенного красителем (судан IV) до интенсивно-красного цвета из расчета 40 мг красителя на 1 мл субстрата. Смесь тщательно перемешивали и разливали в пластиковые кюветы из расчета 20 мл на кювету, на строго горизонтальной поверхности. Для формирования стабильного геля кюветы с раствором выдерживали в течение 30 мин при температуре 4 — 8 С. Затем в пластине вырезали лунки d = 4 мм. Для осуществления реакции гидролиза иммобилизованного субстрата, 20 мкл ферментного раствора заливали в лунки, пластину накрывали крышкой и инкубировали в течение 14 часов при температуре 37 С. Реакцию гидролиза субстрата останавливали, помещая пластины в 30 %-ный раствор уксусной кислоты. Участки геля с гидролизованным субстратом проявлялись в виде светлых зон вокруг лунок на общем коричнево- красном фоне (рис.4).
Судан IV является жирорастворимым красителем, окрашивание липидов представляет собой процесс растворения красителя в липидсодержащих структурах. Таким образом, процесс окрашивания липидов носит чисто физический, а не химический характер. В связи с этим,избирательное окрашивание отдельных липидов разного химического состава при помощи такого красителя невозможно (Буданцев, 2008). Активность ферментов рассчитывали по размеру площади гидролизованного участка. За 1 единицу активности (Е) принимали такое количество фермента, которое гидролизовало субстрат на участке геля размером 1 мм . Активность липаз колорадского жука оказалось равной 13,0 ±0,2. Как видно, размер гидролизованного участка геля вокруг лунки зависит от начальной концентрации фермента в лунке. В интервале концентраций липазы 100-1500 мкг/мл, активность фермента повышается пропорционально увеличению его концентрации в инкубационной среде. На рисунке 6 представлено изображение гелевой пластины после инкубации с образцами из различных источников с липазной активностью. Как видно, липолитическая (твингидролизующая) активность выявляется в прораста-ющих семенах подсолнечника, в медицинском препарате «Фестал», в коммерческом препарате «Желчь КРС». В тоже время, в исследуемых медицинских препаратах с истекшим сроком годности, активность этих ферментов не обнаружена.
Активность гидролитических ферментов в тканях картофеля различных сортов
Как уже отмечалось в обзоре литературы, гидролитические ферменты в живых организмах выполняют весьма важные физиологические функции. В частности, гидролазы насекомых являются одним из основных звеньев, выполняющих ключевые роли- в процессах обеспечения насекомых веществом и энергией. Расщепление пищевых субстратов (полимерных молекул) в организме насекомых происходит при непосредственном участии гидролитических ферментов (Фомичева, 1992; Зоров 2006; 2006). Помимо пищеварительной функции, гидролитические ферменты насекомых выполняют и регуляторные, и защитные функции, в т.ч. участвуют в детоксикации вредных соединений биотического и абиотического происхождения (Серебров, Алексеев, Глупов, 2001). Тем не менее, гидролитические ферменты насекомых изучены недостаточно, сведения о них фрагментарны и разрознены. В литературе отсутствует данные о наличии и распространении представителей отдельных классов гидролаз даже в пределах основных групп вредителей сельскохозяйственных растений.
В связи с вышесказанным, исследование активности, динамики изменения активности в онтогенезе, изменения в уровене активности в различных популяциях насекомых-вредителей основных гидролаз, представляет научный и практический интерес. Особую актуальность приобретают исследования гидролитических ферментов и их растительных ингибиторов, как функционально активных компонентов при взаимодействии насекомых -вредителей и культурных растений. В этом аспекте, весьма интересные и полезные в практическом отношении сведения могут быть получены при изучении взаимодействия колорадского жука и растений картофеля, представлющего яркий пример специализации насекомых. Этот раздел диссертационной работы посвящен определению активности пектиназ, целлюлаз, амилаз, липаз в личинках и имаго колорадского жука в различных локальных популяциях (выборках) на территории Республики Башкортостан.
Наши предварительные исследования показали, что имаго и личинки колорадского жука обладают амилолитической, липолитической, пектолитической, и целлюлолитической активностью. Как видно из рис.10, высокая активность в тканях имаго и личинок характерна для ферментов, гидролизующих целлюлозу, пектин. Целлюлолитическая активность в тканях колорадского жука составляет 20-25 Е/г массы, пектиназ - более 10 Е/г массы.
Уровень активности липаз в тканях исследуемых насекомых оказался значительно ниже (5-10 раз) , чем уровень активности ПМЭ и целлюлаз. Ранее было показано, что выборки насекомых из различных районов имеют существенные различия по экологическим, токсикологическим и биохимическим параметрам (Умаров, 2009). Мы измеряли изменение активности гидролитических ферментов в онтогенезе насекомых, обитающих в популяциях Чишминского, Балтачевского, Белорецкого, Илишевского и Баймакского районов республики Башкортостан (рис.11, 12). По данным дисперсионного анализа активность гидролаз насекомых локальных популяций достоверно различается в зависимости от района.
Уровень удельной активности гидролаз в имаго изменяется в зависимости от местообитания насекомых. Наибольшая активность целлюлаз и пектиназ (20-25 Е/мг) характерна для насекомых Баймакского района. Невысокая активность этих ферментов выявляется у имаго из Белорецкого района. По активности амилаз лидируют насекомые из Илишевского района (16, 1 ±0,3 Е/мг белка). Активность протеиназ и липаз, по сравнению с активностью других исследованных гидролаз, в тканях имаго во всех вариантах опыта выявляется на относительно невысоком уровне. Необходимо отметить, что уровень амилазной активности у насекомых Баймакской выборки существенно ниже, чем у имаго из других выборок. Анализ уровня активности гидролаз у насекомых всех исследованных выборок из нескольких территорий выявил следующую закономерность.
Наиболее высокие уровни активности у имаго среди исследованных гидролаз выявлены для целлюлаз и пектиназ, уровень активности амилаз занимает среднее положение. Далее по убыванию уровня активности располагаются протеолитические и липолитические ферменты.
Показатель удельной активности гидролитических ферментов в тканях личинок подвержен значительным колебаниям в зависимости от возраста и от местообитания насекомых. Так же как и имаго, личинки всех исследуемых локальных популяций характеризуются высокой активностью пектолитических и целлюлозолитических ферментов. Уровень активности этих ферментов у личинок, на всех стадиях их развития, существенно (до 10 раз) превышает аналогичный показатель амилаз, протеиназ, липаз. Наибольший показатель пектиназной активности среди исследуемых образцов выявлен у личинок четвертой стадии развития из Баймакской и Илишевской выборок насекомых ( более 16, 6±0,2 Е/мг). Максимальный уровень целлюлазной активности (30,3 ± 0,2 Е/мг) обнаружен также у личинок из Баймакского района. Высокий уровень амилазной активности определяется в личинках из Белорецкой и Чишминской выборок насекомых.
